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浅析支原体污染对非脊髓灰质炎肠道病毒分离率的影响
为探讨脊髓灰质炎(脊灰)实验室网络中非脊灰肠道病毒(NPEV)分离率下降的原因,采用套式聚合酶链反应(PCR)法对24个省(自治区、直辖市)的40份脊灰病毒(PV)分离物,用国家脊灰实验室的RD、HEp-2、L20B细胞及3个不同厂家生产的牛血清进行了支原体检测.结果显示:40份PV分离物中,37份检测到支原体,阳性率为92.5%,其中9份PV分离物感染了2种支原体;3种细胞悬液均被同种支原体污染;3份牛血清中未检出支原体.经核苷酸序列测定证明,污染的2种支原体为猪鼻支原体(M.hyorhinis)和精氨酸支原体(M.arginini).该实验表明,脊灰实验室网络中普遍存在支原体污染,这也许是导致近年来NPEV分离率普遍下降的原因之一.NPEV分离率是评价脊灰实验室监测敏感性的重要指标之一.我国正处于消灭脊灰后期的一个关键时期,除了有来自邻国脊灰野病毒输入的危险外,因为我国是使用减毒活疫苗预防脊灰的国家,还有发生疫苗相关麻痹型脊灰或由疫苗衍生脊灰病毒引起病例的危险.实验室监测敏感性下降会导致这些病毒的漏检,从而增加其向外扩散的危险.因此必须彻底消除支原体污染,以提高脊灰实验室网络的敏感性,保证网络监测的质量.
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培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用
在生物制剂的生产和研发领域,细胞培养扮演着极其重要的角色;用原代细胞或传代细胞制造疫苗;杂交瘤细胞制造单克隆抗体;基因工程或细胞生物学的研究等[1].然而支原体污染常常成为细胞培养的不速之客,严重影响着细胞及生物制剂的质量.污染细胞常见的支原体包括:发醉支原体(M.fementans)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginina)、梨支原体(M.pirum)、唾液支原体(M.salivarium)和人型支原体(M.hominis)[2-3].被这些支原体污染的细胞常常不引起明显的细胞病变,也不导致培养液浑浊,难以凭肉眼发现,因此,建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要.
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体外培养细胞工作中支原体污染及对策
一、细胞培养中常见的污染问题由不同细胞、不同组织器官构成的哺乳动物,其细胞在整体存活时,互相调节、互相依赖,有很好的内环境平衡稳定系统,有特化的应对外来微生物感染、致病因子作用的免疫系统.细胞生活在温度、pH、离子强度、营养成分等相对稳定的状态下.哺乳类细胞在体外培养成活本身就是一项研究.科学家模仿并尽可能创造接近体内的环境,成功地在实验室中培养了各种哺乳类细胞,是20世纪很重要的成就.
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多种方法去除人肝癌细胞系C3A支原体污染效果及比较
目的:通过对多种支原体污染去除方法治疗效果进行比较,找到适于人肝癌细胞系C3A去除支原体污染的佳处理方法。方法通过聚合酶链反应( PCR)检测C3A细胞培养物中支原体污染,并采用环丙沙星、加温处理、商品化支原体清除剂Plasmocure、人原代巨噬细胞体外共培养等方法对支原体污染样本进行处理,透射电镜( TEM)和实时荧光定量PCR( Q-PCR)对Plasmocure处理前后的细胞形态和基因表达进行比较分析。结果 Plasmocure成功清除支原体且无复发,环丙沙星清除支原体后复发,加温处理、巨噬细胞共培养法导致细胞死亡清除失败;电镜观察Plasmocure处理后细胞无支原体,生长良好,ALB、TF、CYP3A4表达较污染组明显增高(P<0.01)。结论 Plas-mocure是支原体污染的有效处理方法并且能显著恢复细胞形态及基因表达。
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中国药典与欧美药典对支原体检查培养基规定的差异
支原体污染对于研究和工业生产的细胞培养系统是一个严重而普遍的问题,可影响试验结果的准确性和给生物制剂、生物药物和病毒疫苗带来安全隐患[1]。《欧洲药典》(EP)6.0版[2]的支原体检查方法与5.0版[3]相比发生了许多变化,《美国药典》于2010年第一次载入支原体检查法[4,5],与EP6.0大致相同,仅在细节上有些变化。《中国药典》三部自2005年版以来未对支原体检查法做任何修订。近年来国内外对支原体研究的新成果和培养基产业的发展,亟待《中国药典》的支原体检查法进一步修订。采用适宜的培养基培养仍是目前各国药典进行支原体检查的标准方法之一,而支原体对培养基的营养要求和毒性物质的限制要求高于一般细菌培养基,所以,培养基的质量是支原体检查的关键因素。本文对现行版《中国药典》与新版本的《欧洲药典》8.0版[6]、《美国药典》(USP)36版[7]支原体检查方法中培养基的相关规定进行了比较,分析其中的差异可能会对试验结果造成的影响,为《中国药典》的进一步优化和修改提供参考依据。
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联合使用聚合酶链式反应和培养法可以提高培养细胞支原体的检出率
目的 分析国家实验细胞资源共享服务平台及其他实验室细胞支原体污染的情况,探讨聚合酶链式反应(PCR)和培养法在实验细胞支原体检测中的一致性.方法 通过PCR法对245例细胞培养上清进行了支原体检测,并检测了阳性样品支原体感染的种类;对其中127例新鲜上清同时进行了培养法检测,通过McNemar检验分析了二者的一致性.对二者检测不一致的细胞进行复检,同时使用生物发光法进行验证.结果 国内培养细胞支原体感染率在19% ~ 66%;培养法和PCR法检测支原体只有假阴性,没有假阳性;延长取样前细胞在无抗生素培养基中的培养时间至96h,可以提高低效价支原体感染样品的检出率.结论 PCR法和培养法检测支原体具有较好的一致性,应联合使用两种方法对培养细胞进行定期检测,提高支原体的检出率.在细胞培养过程中使用合格制剂,严格无菌操作,预防为主.
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应用巢式PCR检测细胞培养物中的支原体污染
我们建立了巢式PCR检测支原体的方法,进行细胞培养物、牛血清等支原体污染的检测,该方法方便、快速、特异和敏感.现报道如下.选用来源于美国ATCC的6株标准株ATCC23838、 M. Fermentane ATCC19989、 M. SalivariumATCC23064、 M. Hominis ATCC23114、 M. Hominis ATCC23114、M. Orale ATCC23714 和 M. Hyorhinis ATCC29052;共同引物选自支原体16S和23S保守区域,引物序列为外部引物为F1 5 '- ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3 ', R1 5'-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3 ';内部引物为F2 5'-GTTCTTT-GAAAACTGAAT-3' , R2 5'-GCATCCACCAAAAACTCT-3' .
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乳鼠心肌细胞原代培养支原体污染的分析
体外培养心肌细胞,建立实验模型,直接进行心肌细胞的生理、药理、病理等方面的研究,是分子生物学常用的手段.体外培养的细胞保持其在体内特定的结构与功能是作为实验模型进行研究工作的基础,细胞培养一旦污染,即使细胞存活,其功能和性质发生改变,使研究无法进行.
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两种方法处理支原体污染的疗效观察
支原体是细菌培养中常见、不易被察觉又很能干扰实验结果的一种污染.从1952~1972年间,有人检查了54个实验室的9700个各类培养细菌从中发现有11%的细胞受到支原体污染[1].目前发现支原体已有数十种之多.抗生素对支原体污染不能奏效,根据支原体对热耐受性差的特点,本实验拟用加温和药物处理体外培养被污染的细胞,以杀灭支原体.
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贴壁细胞培养过程中支原体污染的几种救治方案疗效比较研究
支原体是细胞培养中常见、不易被察觉和干扰实验结果的污染物,约有30.3%~50.5%的细胞培养物中有支原体污染[1].培养细胞中支原体污染的来源包括:所使用的动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系.