首页 > 文献资料
-
培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用
在生物制剂的生产和研发领域,细胞培养扮演着极其重要的角色;用原代细胞或传代细胞制造疫苗;杂交瘤细胞制造单克隆抗体;基因工程或细胞生物学的研究等[1].然而支原体污染常常成为细胞培养的不速之客,严重影响着细胞及生物制剂的质量.污染细胞常见的支原体包括:发醉支原体（M.fementans）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginina）、梨支原体（M.pirum）、唾液支原体（M.salivarium）和人型支原体(M.hominis)[2-3].被这些支原体污染的细胞常常不引起明显的细胞病变,也不导致培养液浑浊,难以凭肉眼发现,因此,建立一种高效、快速、敏感度高的检测方法十分必要.
-
猪鼻支原体抗原体外对白血病细胞增殖及凋亡的影响
目的探讨猪鼻支原体抗原对白血病细胞增殖和凋亡的影响及机制. 方法以MTT法测定猪鼻支原体抗原对白血病细胞系NB4、HL-60及K562增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳检测K562细胞凋亡;TUNEL法及二苯胺法定量检测细胞凋亡;同时观察猪鼻支原体抗原对K562细胞Bcl-2/Bax表达的影响. 结果猪鼻支原体抗原呈浓度依赖性抑制3种白血病细胞的增殖;在有效浓度的抗原作用下,DNA ladder显示K562细胞以凋亡方式死亡;TUNEL法获得凋亡率为38.65%,显著高于正常对照组(10.23%);二苯胺法获得凋亡率为25.01%,显著高于正常对照组(16.49%);与对照组比较,Bcl-2表达降低,Bax表达升高,Bcl-2/Bax比值下降(为0.6591). 结论猪鼻支原体抗原呈浓度依赖性抑制白血病细胞的增殖;猪鼻支原体抗原通过诱导K562细胞凋亡的方式抑制其增殖,可能是通过降低Bcl-2、升高Bax而实现的.
-
猪鼻支原体感染免疫胶体金快速检测卡的研制
目的 研制一种特异、敏感、快速的人猪鼻支原体(M. Hyorhinis)感染的胶体金免疫层析法检测卡(GICAs).方法 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗猪鼻支原体单克隆抗体(McAb),选择并优化层析条件,研制双抗体夹心模式的免疫胶体金检测卡,评价其灵敏度、特异性和稳定性.结果 其灵敏度检测限可达到1.72×103CFU/mL,50 ng/100 μL支原体全菌蛋白,与其他细菌和支原体无非特异性反应,检测用时约10 min,4℃可保存6个月以上.结论 本文研制的GICAs检测猪鼻支原体特异性强、灵敏度高,无需特殊仪器设备,可用于感染的流行病学调查和临床诊断.
-
抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立
目的 制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测.方法 用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Westem blotting确定IgG亚类及针对抗原的相对分子质量;筛选出配对抗体,建立双抗体夹心ELISA的检测方法,并评价其灵敏度和特异性.结果 共筛选出17株单克隆抗体,抗体亚类分别为ISG1、IsG2、 IgG2b、IgG3,免疫印迹结果表明单抗ZBI、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZBl0与相对分子质量为70 × 103的抗原有特异性结合.确定了2个配对抗体(ZBI-ZBI-HRP和ZB1-ZB2-HRP),可检出小抗原量为30ng/mL,检出猪鼻支原体活菌8.34×102CFU/mL,与人呼吸道常见的致病菌及支原体均无非特异性反应.结论 筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,应用双抗体夹心ELISA方法可用于猪鼻支原体的检测.
关键词： 猪鼻支原体 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA -
中国生产用细胞基质污染支原体类型的分析及猪鼻支原体特异性检测方法的初步建立
目的 分析我国生物制品生产用细胞基质中污染的支原体的类型,并建立猪鼻支原体感染特异性检测方法.方法 对半巢式PCR法的退火温度及引物进行优化,利用优化后方法对70份经培养法及染色法确证为支原体阳性的生产用细胞基质培养上清进行PCR检测及序列分析;用支原体特异的抗生素PlasmocinTM处理猪鼻支原体阳性细胞株NCI-H1703 1 ～3周后,收集上清,进行优化后方法的特异性验证.使用猪鼻支原体特异抗体PD-4对感染不同类型支原体及不同稀释度的猪鼻支原体的Vero细胞进行检测验证.结果 70份样本中60份PCR检测阳性,其中猪鼻支原体(44份)占62.9％,其他分别为口腔支原体(6份)、精氨酸支原体(3份)、肺支原体(2份)、人型支原体(2份)、滑液囊支原体(1份)、发酵支原体(1份)、牛鼻支原体(1份);优化后的方法检测支原体为阴性,且阴性结果随药物持续作用而维持不变,可特异地监控支原体增殖活性.猪鼻支原体特异抗体PD-4可特异地检测猪鼻支原体污染.结论 猪鼻支原体是中国生物制品生产用细胞基质的主要支原体污染源,初步建立的猪鼻支原体感染的有效特异检测方法,可明显提高与支原体污染相关的质量控制能力.
-
支原体感染与肿瘤的发生
一直被视为抗肿瘤单抗的 PD4在对其抗原进行纯化、测序后被证实为抗猪鼻支原体抗体.用单抗 PD4通过免疫组化检测发现,胃癌、大肠癌有较高的支原体感染率.细胞学实验表明,猪鼻支原体可提高胃癌细胞 MGC803在软琼脂上克隆形成能力,单抗 PD4则能够抑制这种作用.作者在回顾相关文献的基础上结合自己实验室的上述工作得出结论:支原体感染和肿瘤发生可能存在被人们忽视的某种相关性,需要进一步予以系统研究.
-
猪鼻支原体vlp重复区融合蛋白的构建表达及反应原性分析
目的 猪鼻支原体(Mhr)是临床猪场常见病原菌之一,同时研究证实其与多种人类肿瘤有关.目前对Mhr的血清学检测尚无有效的方法.本研究以Mhr可变脂蛋白(vlp)家族为对象,设计vlp家族蛋白重复区片段融合蛋白,以作为检测用包被抗原使用.方法 根据大肠杆菌的密码子偏嗜性,设计并构建串联表达7种Mhr可变脂蛋白vlpA、B、C、D、E、F、G重复区片段的重组蛋白vlpA-G基因.将该基因片段装入pET-32a(+)载体中转化大肠杆菌,筛选鉴定获得阳性工程菌.IPTG诱导表达,镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白vlpA-G.Western Blot鉴定该重组蛋白与Mhr阳性血清的反应能力,并利用该重组蛋白为包被抗原初步建立间接ELISA方法用于检测猪血清中的Mhr抗体.结果 构建表达vlpA-G重组蛋白的基因工程菌,经PCR及DNA测序正确.IPTG诱导后出现明显蛋白条带,经镍柱亲和层析纯化获得vlpA-G重组蛋白.Western Blot试验证明重组蛋白vlpA-G能够和Mhr阳性兔血清产生明显的阳性杂交带;利用重组vlpA-G为包被抗原初步建立间接ELISA检测方法可成功检测Mhr阳性猪血清,证明该重组vlpA-G蛋白具有良好的反应原性.结论 本研究构建了重组蛋白vlpA-G并证实该蛋白具有良好的反应原性,可作为Mhr血清学诊断方法研究的候选抗原,同时也为Mhr重组蛋白疫苗提供可选抗原.
-
1株猪鼻支原体特异性单克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备与鉴定猪鼻支原体单克隆抗体,用于猪鼻支原体诊断及致病机理的研究.方法 将猪鼻支原体全菌蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体.鉴定其抗体亚型并对纯化单抗的效价、特异性进行鉴定.将该单抗用于菌落免疫杂交试验、间接免疫荧光试验.结果 获得了1株猪鼻支原体单抗,命名为Mhr-08.该单抗的亚型属于IgG1,轻链为κ型.ELISA测定该纯化单抗效价为1∶102 400,Western-blot检测结果表明,该单抗与猪鼻支原体全菌蛋白在43 kDa处出现特异性反应条带,与猪其他支原体、大肠杆菌及KM2培养基无交叉反应;该单抗为猪鼻支原体表面膜蛋白抗体,可成功应用于菌落免疫杂交试验;将其用于间接免疫荧光试验可成功检测出黏附于猪气管上皮细胞上的猪鼻支原体.结论 成功制备和鉴定出1株猪鼻支原体单克隆抗体,该特异性单抗的获得为猪鼻支原体的诊断及致病机理的研究提供了工具.
-
猪鼻支原体可变脂蛋白家族重组蛋白的构建表达及黏附细胞功能检测
目的 本研究以猪鼻支原体表面的可变脂蛋白(vlp)家族为研究对象,鉴定其各成员对宿主细胞的黏附能力.方法 根据已公布的猪鼻支原体vlp家族7种成员的基因序列设计引物,构建重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,筛选获得阳性克隆.重组工程菌经IPTG诱导表达目的蛋白,经镍柱亲和层析获得7种纯化的vlp重组蛋白.利用间接免疫荧光法及微孔板定量法分别对vlp各个成员的黏附功能进行鉴定.结果 成功构建了7种重组表达质粒pET-32a(+)/vlp,获得阳性重组工程菌.经IPTG诱导及镍柱亲和层析纯化,获得了较纯的7种vlp重组蛋白.间接免疫荧光及微孔板黏附定量试验检测结果显示,重组蛋白vlpA、vlpB、vlpC、vlpE、vlpG可黏附PK细胞,而重组vlpD和vlpF蛋白黏附能力不明显.结论 本研究成功构建了猪鼻支原体7种vlp的重组蛋白,并对其黏附功能进行了初步鉴定,证明部分vlp属于猪鼻支原体的黏附因子.
-
猪鼻支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立
目的 猪鼻支原体是临床猪场的常见病菌,可引起猪多发性浆膜炎、肺炎、关节炎、中耳炎等慢性炎症,同时其与多种人类肿瘤有明显相关性,但其致病机理有待深入,其感染细胞机制的研究尚未明确,因此,本研究欲建立一种用间接免疫荧光技术检测猪鼻支原体黏附宿主细胞的方法.方法 以猪鼻支原体和猪肾上皮细胞为研究对象,以兔抗猪鼻支原体纯化抗体为一抗,以FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,通过反应条件的优化,建立猪鼻支原体黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法(IFA).结果 终确定小黏附滴度为1∶107 CCU/mL,猪鼻支原体黏附PK15所需时间为6 h以上,一抗的佳工作浓度为1∶100,二抗的佳工作浓度为1∶1 600.结论表明间接免疫荧光技术可以用来检测猪鼻支原体对宿主细胞的黏附作用.为猪鼻支原体的研究特别是感染细胞机制的体外研究提供基础方法,同时为疾病的诊断及疫苗的研发奠定基础.
-
胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养与鉴定
目的获得胃癌组织中存在猪鼻支原体感染的直接证据.方法收集新鲜的胃癌手术标本20例,利用PPLO培养基从胃癌组织中分离培养猪鼻支原体,并用聚合酶链反应(PCR)检测阳性培养产物中猪鼻支原体的特异性基因序列片段.结果除1例标本细菌污染外,19例胃癌组织中有4例获得阳性培养产物,阳性率为21.1%;该4例阳性培养物中均扩增出猪鼻支原体的特异性序列片段.结论胃癌组织中存在猪鼻支原体感染,说明猪鼻支原体对人亦具感染性.猪鼻支原体感染与胃癌发生的相关性有待进一步研究.
-
猪鼻支原体攻毒模型研究进展
猪鼻支原体是第一种从猪体内分离到的病原体,可引起猪的肺炎、多发性浆膜炎、关节炎、中耳炎等临床症状,对养殖业造成巨大危害.同时证实其与多种人类肿瘤有明显的相关性,也是人类和多种动物细胞培养中常见的污染物.目前对猪鼻支原体的预防较为困难,暂无理想的抗生素和疫苗.猪鼻支原体攻毒模型是进行致病机理、疫苗评价及药物等研究的基础.本文就目前猪鼻支原体常用攻毒模型的研究进展进行综述.
-
猪鼻支原体与猪地方性肺炎
猪鼻支原体(Mhr)是小猪呼吸道的常在菌,在猪群中的检出率很高,可引起猪发生肺炎、多浆膜炎、关节炎和中耳炎,一定程度上影响了猪的生长和生产性能,并可继发其它病原感染,加重呼吸道症状.Mhr也是细胞培养的常见污染物和多种癌症的诱发因素.Mhr引起猪肺炎的机理除了在病理变化方面有介绍外,其深层次的机制还未见报道,其在呼吸道移行及诱导全身性疾病的机制也不清楚.本文将从猪地方性肺炎(SEP)及主要致病原、可能的致病机理和研究方法方面进行阐述Mhr肺炎,为该病的研究和防治提供新思路与新手段,同时也为Mhr和其它病原共感染的研究提供借鉴.
-
套式 PCR检测中国江苏省猪场猪鼻支原体和猪肺炎支原体的感染
目的：猪鼻支原体和猪肺炎支原体的感染在中国养猪业较为普遍，本研究对江苏省猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis ，Mhr）和猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae ，Mhp）流行病学进行初步调查。方法从江苏省不同的猪场采集7、14、21、28及35日龄仔猪的鼻拭子样本，用套式PCR方法对收集的399份鼻拭子样本进行M hr和M hp的检测。结果江苏省不同猪场样本中M hr的检出率为70．9％，M hp检出率为13．5％。5周龄以下的猪M hr的感染率要高于M hp。其中30个样本（7．5％）的检测结果为两种病原体共感染。7-35日龄的猪M hr的感染率随着日龄的增长呈现明显的上升趋势，但M hp的感染率并未随着仔猪日龄的增长而显著上升。从本研究结果分析还发现，不同品种的猪M hr的感染率存在显著差异，与其他品种猪相比姜曲海瘦肉型品种猪（Jiangquhai porcine lean strain ，JQHPL）更易于感染Mhr （p＜0．001），但是其Mhp的感染率与其他猪相比不存在显著性差异（P＞0．05）。结论本试验调查了江苏地区猪场中仔猪感染Mhr和Mhp的情况，且研究结果表明 M hr的感染状况与日龄及品种有一定关系。
-
P37蛋白在卵巢癌组织中的表达及意义
目的 研究卵巢癌组织中P37蛋白的表达,探讨猪鼻支原体感染与卵巢癌发生的关系.方法 采用免疫组化法检测109例卵巢癌组织和30例正常卵巢组织中的P37蛋白表达情况.结果 卵巢癌组织中P37蛋白阳性表达率为43.1％ (47/109),正常卵巢组织的阳性表达率为0(0/30),两者相比差异具有统计学意义(P＜0.001).结论 卵巢癌组织中存在猪鼻支原体的感染,卵巢癌的发生与支原体感染有一定的相关性.
-
猪鼻支原体抗原对K562细胞增殖的影响
目的探讨猪鼻支原体抗原对肿瘤细胞的作用.方法以MTT法测定猪鼻支原体抗原对肿瘤细胞增殖的影响;琼脂糖凝胶电泳定性检测细胞凋亡;TUNEL法定量检测细胞凋亡.结果猪鼻支原体抗原呈浓度依赖性抑制K562细胞的增殖;在有效浓度的猪鼻支原体抗原作用下,DNA Ladder 显示K562细胞以凋亡方式死亡,TUNEL法获得凋亡率为38.6%,显著高于正常对照组(10.2%).结论猪鼻支原体抗原可通过诱导K562细胞凋亡的方式抑制其增殖.
-
易致污染的支原体在固体培养基上的形态特征
目的：研究不同条件下、不同生长期易致污染的支原体在固体培养基中的形态特征。方法通过改变支原体菌体浓度、培养时间及培养基组成，观察支原体在固体培养基中的形态变化。结果支原体菌体浓度小于103 cfu／mL时，培养至2～3天后可在固体培养基中形成典型的“油煎蛋”状形态，以蔗糖作为碳源培养支原体会导致葡萄糖发酵型支原体（肺炎支原体）不能在固体培养基中形成典型菌落，当使用牛血清代替马血清为支原体提供外源胆固醇时，猪鼻支原体在固体培养基中不能形成典型菌落。结论支原体的不同生长期、菌体浓度、培养基的组成都会使易致污染的支原体在固体培养基上的形态发生变化。
