首页 > 文献资料
-
双基因转染犬骨髓间充质干细胞复合HA/ZrO2生物材料新型组织工程骨的构建及其体外成骨能力的研究
目的：构建骨形态发生蛋白2(BMP-2)、血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)双基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合羟基磷灰石复合二氧化锆(HA/ ZrO2)生物材料的新型组织工程骨,并观察该组织工程骨在体外的成骨能力。方法采用有机泡沫作为模版,干铺烧制法制备新型的蜂窝状 HA/ ZrO2梯度生物材料,电镜观察新型生物材料的表面特性,生物力学试验机检测其力学性能。采取1岁龄健康 beagle 犬骨髓分离原代 BMSCs 进行培养,建立双基因修饰的 BMSCs 复合蜂窝状 HA/ ZrO2梯度生物材料的共培养体,构建新型组织工程骨。实验分为4组：未转染组,只转染BMP-2(BMP-2组)和 VEGF165(VEGF165组)单一目的基因的 BMSCs,以及转染 BMP-2、VEGF165共基因慢病毒的 BMSCs 组(BMP-2+ VEGF165组)。显微镜下观察细胞在支架材料上的生长情况,用碱性磷酸酶染色检测各组细胞成骨分化能力,免疫组织化学染色检测其成骨细胞特异性蛋白骨Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌。结果新型材料电镜下其表面整体呈多孔状,孔径125~550μm,各孔之间存在缝隙联结；其平均抗弯强度为812.25 MPa,高可达987.12 MPa；共培养体建立后扫描电镜观察转染后的 BMSCs 在支架材料上黏附生长状况良好,双基因联合转染组细胞分泌基质旺盛；BMP-2+VEGF165组细胞碱性磷酸酶活性检测明显高于其他各组(F =1029.398,P <0.01),免疫组织化学染色在不同阶段发现成骨细胞早晚期分泌的骨Ⅰ型胶原及骨钙素特异性蛋白。结论新型的蜂窝状HA/ ZrO2梯度生物材料是一种合适种子细胞生长的支架材料,并且其力学满足人体四肢承重骨的需要；VEGF165、BMP-2双基因转染 BMSCs 后具有协同作用,能够促进其在体外的成骨分化。
-
新型梯度复合HA/ZrO2组织工程骨支架在猕猴颈椎融合中的应用
目的 构建新型梯度复合羟基磷灰石-二氧化锆(HA/ZrO2)组织工程骨支架,并评估其在猕猴颈椎椎间融合中的效果.方法 通过离子交联法制备壳聚糖水凝胶作为骨形态发生蛋白2(BMP-2)的缓释载体,扫描电镜下观察其微观形态,检测其载药量、包封率及缓释速率;然后分离、培养猕猴源性骨髓间充质干细胞(BMSCs),并进行碱性磷酸酶、冯库萨染色等对其进行鉴定;后将前期制备好的BMP-2明胶/壳聚糖凝水胶缓释系统和第3代猕猴BMSCs加载于HA/ZrO2泡沫陶瓷,以构建新型组织工程骨,并观察其形态特征.将24只雄性猕猴按照随机数字表法分成4组,其中组织工程骨组(n=8)为植入梯度复合HA/ZrO2泡沫陶瓷负载BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统和第3代猕猴BMSCs,泡沫陶瓷组(n=8)为植入梯度复合HA/ZrO2泡沫陶瓷,自体髂骨组(n=4)为植入自体髂骨,假手术组(n=4)为只对相应部位的软组织进行切开、缝合,未破坏其椎间盘;观察术后颈椎X线(术后即刻、8周、16周)、组织形态学表现(术后8周、16周)及测试相应节段的生物力学(术后16周).结果 扫描电镜下BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶呈3D网状结构,内见均匀分布的壳聚糖微球,其负载BMP-2后的包封率和载药率随时间逐渐降低:第1天分别为87.4%±0.9%和58.2%±0.5%、第15天分别为45.2%±0.6%和30.1%±0.4%,累积释放率第1天为12.6%±0.11%、第15天为55%±0.16%.显微镜下观察见BMSCs的形态呈多样性,以梭形及短棒形等较常见;第3代猕猴BMSCs成骨诱导后的碱性磷酸酶、冯库萨染色以及表面特异性抗原的检测结果显示,符合BMSCs的生物学特性.不同时点的X线及组织形态学观察显示材料内部新生骨量组织工程骨组较泡沫陶瓷组明显增多;生物力学测试结果显示,在大载荷、抗压强度和能量吸收方面假手术组均低于其他3组(P值均<0.05),在抗压强度上组织工程骨组与自体髂骨组差异无统计学意义(P>0.05).结论 BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合猕猴第3代BMSCs种植于HA/ZrO2泡沫陶瓷构建的新型组织工程骨支架,能有效促进猕猴颈椎椎间融合,在影像学及组织学表现和生物力学测试方面,可达到与自体骨相似的骨代替作用.
-
野黄芩苷体外促成骨分化作用研究
目的：研究野黄芩苷的体外促成骨分化作用。方法利用荧光素酶报告基因系统检测野黄芩苷对稳定转染bmp2启动子的 MC3T3-bmp2-Luc细胞中bmp2转录活性的影响；体外培养小鼠颅骨来源的前体成骨细胞系 MC3T3-E1和小鼠多能间充质干细胞样成纤维细胞 C3H10T1/2，采用 MTT的方法检测野黄芩苷对细胞增殖的影响；p-NPP 法检测野黄芩苷对成骨细胞内碱性磷酸酶活性的影响以及通过茜素红染色的方法考察野黄芩苷对钙化结节形成的影响；Real-time PCR进一步验证野黄芩苷长时间诱导后对成骨细胞bmp2 mRNA水平的影响。结果野黄芩苷可以在20μmol/L显著上调bmp2转录活性（P <0.001）；在1~20μmol/L的剂量浓度范围内，野黄芩苷作用72 h后对 MC3T3-E1细胞增殖不明显但也无杀伤作用。野黄芩苷在两种实验用细胞中均能剂量依赖地上调 ALP的活性，其中10μmol/L和20μmol/L为显著（P <0.05），并且在 C3H10T1/2细胞中该作用呈时间依赖性。同时也观察到24 d诱导后，野黄芩苷（5~10μmol/L）可以增加成骨细胞钙化结节的数目，且诱导12 d后，在5~20μmol/L浓度下上调bmp2 mRNA的水平。结论野黄芩苷具有体外促成骨分化的活性，有潜力成为抗骨质疏松候选化合物。
-
骨形态发生蛋白质2介导Smad和丝裂原活化蛋白激酶通路促进人神经胶质瘤细胞增殖的实验研究
目的 探讨骨形态发生蛋白质2 (BMP-2)在神经胶质瘤细胞株中的表达及BMP-2对细胞增殖的作用机制.方法 传代培养人U8vIII、U87、T98G、LN229及U373神经胶质瘤细胞株.采用PCR法检测BMP-2及其受体BMPR1A、BMPR1B、Alk-2和Smad1在5种细胞株中的表达.MTS法检测0、25、50、100、250及500 ng/ml的BMP-2对U87细胞增殖的影响.Western blot方法分析用上述剂量的BMP-2处理U87细胞后,Smads和丝裂原活化蛋白激酶类(MAPKs)活性的变化;100 ng/ml的BMP-2处置U87细胞后0、5、15、30及60 min,Smads和MAPKs活性的变化;用100 ng/ml的BMP-2处置U87细胞后0、4、8、16及24 h,BMP通路下游基因cyclin B、cyclin D1、p27及p21的表达.结果 BMP-2及其受体BMPR1A、BMPR1B、Alk-2和Smad1在5种细胞株中均有表达,表达量差异有统计学意义(均P ＜0.01);BMP-2在U87中表达高,U373中表达低.MTS实验显示,BMP-2对U87细胞的增殖具有促进作用,在剂量为100 ～ 250 ng/ml时达高峰;与0 ng/mlBMP-2比较,随着BMP-2剂量的增加磷酸化的Smad1/5/8、p38激酶、c-Jun N-末端激酶(JNK)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)的表达逐渐增高(均P＜0.01),100 ～ 250 ng/ml时达高峰.在BMP-2处理U87细胞5 min后磷酸化的Smad1/5/8、p38、JNK和ERK蛋白的表达开始升高,30 min达高峰,各磷酸化蛋白在不同时间点的表达差异均有统计学意义(均P ＜0.01).BMP-2(100 ng/ml)处置U87细胞后,cyclin B和cyclin D1的表达逐渐升高,p27和p21的表达逐渐下降,均于24 h达高峰,各个时间点的表达差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 BMP-2通过介导BMP/Smad和BMP/MAPK通路的活性而促进神经胶质瘤细胞的增殖.
关键词： 神经胶质瘤 骨形态发生蛋白质2 丝裂原激活蛋白激酶类 Smad蛋白质类 -
NELL-1：高效特异的新型生长因子
骨与其他组织的再生往往需要种子细胞、支架材料和相关生长因子三方面的参与，而生长因子作为维持微环境的重要组成部分，对于组织再生起着重要作用［1－2］。人类尼尔样-1型分子（Nel-like mol-ecule-1，NELL-1）基因位于第11号染色体p15．1-p15．2，长度约906 kb，包含20个编码外显子。基因编码的分泌蛋白包含810个氨基酸开放阅读框架，其相对分子质量在糖基化之前约为90000。NELL-1是人类颅缝早闭症相关的一种分泌蛋白，结构包含有6个表皮生长样因子结构域，一个分泌信号肽，一个N末端分子，4个半胱氨酸富集区。NELL-1与胚胎系统发育密切相关，在骨骼系统的发育进程中扮演着重要角色，其具有良好的诱导骨再生与软骨再生的能力，尤其是针对软骨细胞系有较高的特异性。相对于经典的成骨诱导因子骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2），NELL-1具有特异性强、诱导成骨的骨质更为致密、不良反应小等优势。近年来，NELL-1在组织工程领域进行了大量的研究，NELL-1研究涉及的方面主要包括基因或者蛋白结构及其表达谱［3－4］、生物学功能［5－6］、分子调控机制［7－8］、与疾病相关性［9－10］等。NELL-1与胚胎系统发育密切相关，在骨骼系统的发育进程中扮演着重要角色，其具有良好的诱导骨再生与软骨再生的能力，尤其是针对软骨细胞系有较高的特异性。NELL-1还具有与BMP-2协同作用的能力，NELL-1能够提高细胞对于BMP-2成骨诱导的反应，以及显著降低BMP-2诱发的炎症反应。因此本文拟通过循证医学系统评价的方法综述 NELL-1生物学功能。
-
复合骨髓间质干细胞和BMP-2的HA/ZrO2泡沫陶瓷修复猕猴腰椎椎体缺损
目的 探讨BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合骨髓间质干细胞种植于HA/ZrO2泡沫陶瓷构建的组织工程骨修复猕猴腰椎椎体缺损的疗效.方法 将BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统和第3代猕猴骨髓间质干细胞加载于HA/ZrO2泡沫陶瓷,构建组织工程骨,观察其形态特征.制作猕猴L4或L5椎体缺损模型24个,分别植入组织工程骨(n=10)、泡沫陶瓷(n=10)、自体髂骨(n=4).术后8周、16周观察腰椎脊柱X线、Micro-CT扫描及组织形态学表现,术后16周行相应节段的生物力学测试.通过RT-PCR和Western Blot检测组织工程骨组和泡沫陶瓷组的Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白、碱性磷酸酶、碱性成纤维细胞生长因子及血管内皮生长因子的表达.结果 扫描电镜下BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶均匀分布于材料及孔隙处,在HA/ZrO2泡沫材料的孔内可见被水凝胶包裹的骨髓间质干细胞;HE染色可见材料表面均匀分布散在的骨髓间质干细胞;BrdU染色观察到黏附于材料表面的细胞生长正常.不同时点的X线、Micro-CT扫描及组织形态学观察显示组织工程骨组材料内部新生骨量较泡沫陶瓷组明显增多;生物力学测试结果显示泡沫陶瓷组的大载荷和弹性模量低于其他各组,组织工程骨组与自体髂骨组的极限抗压强度和大吸收能量均高于泡沫陶瓷组(P＜ 0.05).组织工程骨组Ⅰ型胶原(1.682±0.031)、骨钙素(1.04±0.032)、骨桥蛋白(1.01±0.026)、碱性磷酸酶(1.24±0.023)、碱性成纤维细胞生长因子(3.67±0.018)及血管内皮生长因子(2.36±0.003)基因相对表达量均高于泡沫陶瓷组(分别为1.01±0.012、0.56±0.018、0.42±0.012、0.98±0.036、1.04±0.048、0.62±0.024,P＜0.05).Western Blot检测结果与PCR一致.结论 BMP-2明胶/壳聚糖水凝胶缓释系统复合第3代骨髓间质干细胞种植于HA/ZrO2泡沫陶瓷构建的组织工程骨能有效修复猕猴椎体缺损,在影像学及组织学表现、成骨相关蛋白检测和生物力学测试方面可达到与自体骨相似的骨替代作用.
-
基于iTRAQ技术的BMP-2诱导肌源C2C12细胞向成骨细胞分化过程中的蛋白质组学研究
目的 应用iTRAQ技术观察BMP-2诱导肌源C2C12细胞向成骨细胞分化过程中蛋白质表达组的变化.方法 将肌源C2C12细胞接种于BMP-2诱导分化体系中进行分化诱导,提取第7天的分化蛋白以iTRAQ试剂标记后进行质谱检测,分析差异表达的蛋白质,并进行生物信息学分析.结果 iTRAQ试剂标记的BMP-2诱导肌源C2C12分化细胞蛋白质表达谱分析筛选出明显差异表达蛋白质点为23个,表达上调的蛋白质点8个,下调的蛋白质点15个.通过趋势分类发现上述差异蛋白在C2C12细胞成骨分化的各时期(第1至7天)均存在蛋白的差异表达.其中部分上调蛋白在分化早期表达水平升高、部分上调蛋白在分化晚期表达水平升高;同样,部分下调蛋白在分化早期表达水平下降,部分下调蛋白在分化晚期表达水平下降.初步鉴定SERCA3、细胞色素b5、S100A4、ATPase inhibitor、ATPIF1等5个蛋白表达出现动态变化,证实上述蛋白可能与诱导成骨分化机制有关.结论 本研究差异蛋白表达趋势的结果显示全程监测C2C12细胞成骨分化的必要性,提示iTRAQ技术是研究细胞分子蛋白改变的有效的蛋白质组学方法,SERCA3、细胞色素b5、S100A4、ATPase inhibitor、ATPIF1等5个蛋白可作为诱导成骨分化机制研究的候选靶标.
-
软骨寡聚基质蛋白对BMP-2诱导骨髓间质干细胞分化的影响
目的 探讨过表达软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein,COMP)对BMP-2诱导骨髓间质干细胞成骨及成软骨分化的影响.方法 用BMP-2诱导骨髓间质干细胞分化,通过脂质体转染含人COMP基因的质粒使骨髓间质干细胞过表达COMP,空载质粒作为对照.以RT-PCR检测成骨相关基因Ⅰ型胶原、RUNX2、骨桥蛋白、骨钙蛋白以及成软骨相关基因Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖的表达变化;通过碱性磷酸酶染色观察成骨过程中的碱性磷酸酶活性,茜素红染色观察成骨终末阶段矿化结节的生成情况,阿利新蓝染色观察细胞基质蛋白多糖的合成情况.结果 COMP组目的基因COMP mRNA的表达显著升高;骨桥蛋白mRNA表达水平较对照组低,呈现出一致的下调趋势(P＜0.05);Ⅰ型胶原、RUNX2、骨钙蛋白mRNA表达水平在诱导早期均高于对照组(P＜0.05),但在诱导晚期均明显低于对照组(P＜0.05);成软骨指标(Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖)的基因表达水平强于对照组,呈一致的上调趋势(P＜0.05);SOX9 mRNA表达水平高于对照组,仅在第7天时差异具有统计学意义(P＜0.05);细胞成骨染色(碱性磷酸酶染色、茜素红染色)均弱于对照组,而阿利新蓝染色强于对照组.结论 COMP能抑制BMP-2诱导骨髓间质干细胞成骨分化,促进BMP-2诱导骨髓间质干细胞成软骨分化.
-
补肾化痰方对去卵巢大鼠骨形成的影响及其作用机制研究
目的:观察补肾化痰方对去卵巢大鼠骨形成的影响及其作用机制.方法:将30只6月龄SPF级雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和补肾化痰组,每组10只.模型组和补肾化痰组大鼠手术摘除双侧卵巢,假手术组不摘除卵巢,只切除卵巢周围与双侧卵巢质量相等的脂肪组织.造模术后5周开始,补肾化痰组以0.94 g· mL-1补肾化痰方药液灌胃,假手术组和模型组以等体积生理盐水灌胃,均每天1次,连续干预8周.药物干预结束后,将所有大鼠处死,摘除双侧眼球取血检测血清骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)-2、Runt相关转录因子(Runt related transcription factor,RUNX)-2含量,取左侧股骨行Micro CT扫描测定骨密度、骨小梁数量、骨小梁平均厚度、骨小梁分离度,取右侧股骨上端部分骨片以蛋白免疫印迹法测定骨组织中BMP-2、RUNX-2含量,取右侧股骨下端部分骨片以免疫组织化学法检测BMP-2、RUNX-2的定位.结果:①一般情况.所有大鼠均在造模手术麻醉3～4h后完全清醒,正常进食,1周后切口完全愈合.药物干预过程中,模型组1只大鼠死亡、补肾化痰组2只大鼠死亡.②血清BMP-2、RUNX-2含量检测结果.3组大鼠的血清BMP-2含量比较,差异有统计学意义[(245.40±10.10)pg·mL-1,(111.03±29.75)pg·mL-1,(190.35±14.00) pg·mL-1,F=109.998,P=0.000];模型组、补肾化痰组的血清BMP-2含量均低于假手术组(P =0.000,P=0.000),补肾化痰组的血清BMP-2含量高于模型组(P=0.000).3组大鼠的血清RUNX-2含量比较,差异有统计学意义[(4 131.04±277.39) pg·mL-1,(1 601.09±266.10) pg·mL-1,(3 134.90±202.33) pg·mL-1,F=237.192,P=0.000];模型组、补肾化痰组的血清RUNX-2含量均低于假手术组(P =0.000,P=0.000),补肾化痰组的血清RUNX-2含量高于模型组(P =0.000).③股骨Micro CT扫描结果.3组大鼠骨密度比较,差异有统计学意义[(556.90±8.86) mg HA·cm-3,(498.81±9.26) nmg HA·cm-3,(530.17±10.70) nmg HA·cm-3,F=90.488,P=0.000];模型组、补肾化痰组的骨密度均低于假手术组(P=0.000,P=0.000),补肾化痰组的骨密度高于模型组(P=0.000).3组大鼠骨小梁数量比较,差异有统计学意义[(2.65±0.32)个·mm-1,(1.74±0.22)个·mm-1,(2.41±0.33)个·mm-1,F=23.900,P=0.000];模型组的骨小梁数量少于补肾化痰组和假手术组(P =0.000,P=0.000),补肾化痰组的骨小梁数量与假手术组比较,差异无统计学意义(P =0.224).3组大鼠骨小梁平均厚度比较,差异有统计学意义[(109.33±16.12) μm,(79.27±18.17)μm,(95.73±11.38)μm,F=8.730,P=0.001];模型组的骨小梁平均厚度低于假手术组(P=0.001),补肾化痰组的骨小梁平均厚度分别与假手术组和模型组比较,差异无统计学意义(P=0.181,P=0.098).3组大鼠骨小梁分离度比较,差异有统计学意义[(350.95±68.46) μm,(472.33±33.70) μm,(406.68±47.77) μm,F=12.460,P=0.000];模型组、补肾化痰组的骨小梁分离度均高于假手术组(P=0.000,P=0.036),补肾化痰组的骨小梁分离度低于模型组(P=0.017).④股骨组织中BMP-2、RUNX-2蛋白含量检测结果.3组大鼠股骨组织中的BMP-2含量比较,差异有统计学意义(0.73±0.03,0.26±0.02,0.48±0.02,F=738.111,P =0.000);模型组、补肾化痰组股骨组织中的BMP-2含量均低于假手术组(P=0.000,P=0.000),补肾化痰组股骨组织中的BMP-2含量高于模型组(P=0.000).3组大鼠股骨组织中的RUNX-2含量比较,差异有统计学意义(0.67±0.03,0.36±0.03,0.47±0.02,F=286.493,P=0.000);模型组、补肾化痰组股骨组织中的RUNX-2含量均低于假手术组(P=0.000,P=0.000),补肾化痰组股骨组织中的RUNX-2含量高于模型组(P =0.000).⑤股骨组织中BMP-2、RUNX-2蛋白定位检测结果.BMP-2、RUNX-2的阳性表达主要位于骨髓基质细胞胞浆及骨小梁周边成骨细胞中,光学显微镜下阳性表达蛋白呈棕黄色颗粒.结论:补肾化痰方能通过调节BMP-2/Smads/RUNX-2信号转导通路,促进去卵巢大鼠的骨形成.
-
接骨续筋丸促进大鼠骨折愈合的作用机制研究
目的:探讨接骨续筋丸促进大鼠骨折愈合的作用机制.方法:将72只3月龄雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组,每组18只.截断模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组大鼠股骨干中段,制作股骨开放性骨折模型;假手术组仅暴露股骨干,不做截骨.造模后第2天开始灌胃,接骨续筋丸组以3 g·kg-1剂量的接骨续筋丸混悬液灌胃,接骨七厘胶囊组以0.52 g·kg-1剂量的接骨七厘胶囊混悬液灌胃,模型对照组和假手术组给予蒸馏水灌胃;每天灌胃1次,各组连续灌胃21 d.分别于药物干预7 d、14 d、21 d后取材,各组随机选取6只大鼠从腹主动脉抽血,经静置、离心后吸取上层血清,保存待检;抽血完成后,取出大鼠左侧股骨干,制备骨折端股骨石蜡标本.分别采用钙(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P)、血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)测试盒测定大鼠血清Ca、P、ALP含量,采用苏木精-伊红(HE)染色观察骨组织形态学变化,采用免疫组化法检测骨折端骨组织中骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)和血管内皮生长因子(vascular endothe-lial growth factor,VEGF)的表达.结果:①药物干预后血清Ca含量.药物干预7 d、14 d、21 d后,4组大鼠血清Ca含量比较,组间差异均无统计学意义[(1.80±1.03)mmol·L-1,(1.88±0.80)mmol·L-1,(1.91±0.68)mmol·L-1,(1.83±0.62)mmol·L-1,F=0.023,P=0.995;(1.77±0.89)mmol·L-1,(1.77±0.73)mmol·L-1,(1.88±1.18)mmol·L-1,(1.74±0.89)mmol·L-1,F=0.025,P=0.095;(1.72±0.98)mmol·L-1,(1.74±0.61)mmol·L-1,(1.80±0.90)mmol·L-1,(1.69±0.79)mmol·L-1,F=0.019,P=0.996].②药物干预后血清P含量.药物干预7 d后,4组大鼠血清P含量比较,差异有统计学意义[(1.89±0.56)mmol·L-1,(1.97±0.53)mmol·L-1,(3.23±0.90)mmol·L-1,(4.24±0.68)mmol·L-1,F=16.041,P=0.000];组间两两比较,假手术组与模型对照组的差异无统计学意义(P=0.846),假手术组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.003),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.005),接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.018).药物干预14 d后,4组大鼠血清P含量比较,差异有统计学意义[(1.81±0.48)mmol·L-1,(2.65±0.36)mmol·L-1,(3.73±0.77)mmol·L-1,(4.37±0.93)mmol·L-1,F=16.998,P=0.000];组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.045,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.012),接骨七厘胶囊组与接骨续筋丸组的差异无统计学意义(P=0.116).药物干预21 d后,4组大鼠血清P含量比较,差异有统计学意义[(1.82±0.40)mmol·L-1,(2.15±0.50)mmol·L-1,(3.35±0.62)mmol·L-1,(4.21±0.70)mmol·L-1,F=22.663,P=0.000];组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.036,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.002),接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.016).③药物干预后血清ALP含量.药物干预7 d后,4组大鼠血清ALP含量比较,差异有统计学意义[(49.71±14.67)U·L-1,(93.75±15.11)U·L-1,(125.00±22.89)U·L-1,(145.49±20.79)U·L-1,F=29.797,P=0.000];组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000,P=0.001),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.001,P=0.000),接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.009).药物干预14 d后,4组大鼠血清ALP含量比较,差异有统计学意义[(41.57±10.69)U·L-1,(91.13±10.76)U·L-1,(111.77±19.66)U·L-1,(149.42±12.71)U·L-1,F=62.354,P=0.000];组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000),接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.019).药物干预21 d后,4组大鼠血清ALP含量比较,差异有统计学意义[(42.73±14.94)U·L-1,(77.33±15.54)U·L-1,(95.49±26.12)U·L-1,(124.85±25.34)U·L-1,F=15.847,P=0.000];组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000,P=0.010),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.026,P=0.001);接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.015).④药物干预后骨折端骨组织形态.药物干预7 d后,模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组骨折端骨组织中可见少量成骨细胞聚集;药物干预14 d后成骨细胞显著增多,且接骨续筋丸组及接骨七厘胶囊组的成骨细胞数量较模型对照组明显增多;药物干预21 d后成骨细胞开始减少;3组破骨细胞在药物干预21 d后出现增长趋势.⑤药物干预后骨折端骨组织中BMP-2的表达量.药物干预7 d后,4组大鼠骨折端骨组织中BMP-2表达量比较,差异有统计学意义(0.10±0.01,0.14±0.02,0.23±0.03,0.27±0.03,F=59.960,P=0.000);组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.018,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000),接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.015).药物干预14 d后,4组大鼠骨折端骨组织中BMP-2表达量比较,差异有统计学意义(0.12±0.02,0.15±0.02,0.24±0.03,0.28±0.03,F=47.588,P=0.000);组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.047,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000),接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.006).药物干预21 d后,4组大鼠骨折端骨组织中BMP-2表达量比较,差异有统计学意义(0.11±0.02,0.15±0.02,0.24±0.03,0.28±0.02,F=80.017,P=0.000);组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.004,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000),接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.004).⑥药物干预后骨折端骨组织中VEGF的表达量.药物干预7 d后,4组大鼠骨折端骨组织中VEGF表达量比较,差异有统计学意义(0.11±0.02,0.14±0.02,0.26±0.01,0.27±0.04,F=69.567,P=0.000);组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.015,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000),接骨七厘胶囊组与接骨续筋丸组的差异无统计学意义(P=0.905).药物干预14 d后,4组大鼠骨折端骨组织中VEGF表达量比较,差异有统计学意义(0.11±0.02,0.15±0.02,0.25±0.03,0.28±0.02,F=72.334,P=0.000);组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.026,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000),接骨七厘胶囊组与接骨续筋丸组的差异无统计学意义(P=0.071).药物干预21 d后,4组大鼠骨折端骨组织中VEGF表达量比较,差异有统计学意义(0.11±0.02,0.15±0.02,0.24±0.02,0.27±0.05,F=39.739,P=0.000);组间两两比较,假手术组低于模型对照组、接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000,P=0.000),模型对照组低于接骨七厘胶囊组、接骨续筋丸组(P=0.000,P=0.000),接骨七厘胶囊组低于接骨续筋丸组(P=0.029).结论:接骨续筋丸促进大鼠骨折愈合的作用机制可能是通过提高大鼠血清P、ALP的含量,促进其骨组织中BMP-2及VEGF的表达,从而促进成骨细胞增殖,但其具体作用机制有待进一步深入研究.
-
miR-133 a对骨形态发生蛋白2诱导的鼠前成骨细胞分化的影响及其作用机制
目的：探究miR-133a对骨形态发生蛋白2诱导的鼠前成骨细胞分化的影响及其作用机制。方法：检测骨形态发生蛋白2诱导的鼠前成骨细胞分化过程中miR-133a水平、碱性磷酸酶活性、Runx-2蛋白水平及Osterix蛋白水平，检测转染miR-133a后鼠前成骨细胞分化过程中碱性磷酸酶活性、Runx-2 mRNA水平、Runx-2蛋白水平、Osterix mRNA水平和Osterix蛋白水平。miR-133a测定采用qRT-PCR法，Runx-2和Osterix蛋白水平测定采用Western-blot法，Runx-2和Osterix mRNA水平测定采用RT-PCR法，碱性磷酸酶活性检测采用碱性磷酸酶检测试剂盒。采用HEK293细胞进行miR-133a靶基因验证实验，细胞中荧光值的检测采用荧光素酶报告基因检测系统。结果：miR-133a在骨形态发生蛋白2诱导的MC3T3-E1细胞分化过程中表达显著下调，碱性磷酸酶的活性则显著增高。转染miR-133a后，细胞中碱性磷酸酶活性受到明显抑制，Runx-2蛋白水平显著下调、Runx-2 mRNA水平未发生明显变化，Osterix的mRNA和蛋白水平均明显下调。荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-133a可靶向作用于Runx-2 mRNA的3’-UTR区。结论：miR-133a通过抑制Runx-2的蛋白表达进而抑制骨形态发生蛋白2诱导的鼠前成骨细胞分化过程。
-
pIRES2-EGFP-hBMP2载体的构建及对人牙龈成纤维细胞表型的影响
目的:构建hBMP2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2并观察其对人牙龈成纤维细胞表型的影响. 方法:采用RT-PCR方法从人成骨肉瘤细胞中克隆hBMP2基因,连接T 载体并测序正确后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接,酶切鉴定后转染入HEK293细胞中,利用荧光显微镜和Western Blot进行表达鉴定,后转染人牙龈成纤维细胞,通过MTT实验观察转染hBMP2后对人牙龈成纤维细胞增殖特性、ALP活性、OC含量、体外矿化能力的影响. 结果:成功克隆了人BMP2基因,酶切鉴定及测序均正确,真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2能正确表达hBMP2蛋白,hBMP2对人牙龈成纤维细胞增殖特性无影响,但可增强其ALP活性、OC含量及体外矿化能力. 结论:构建了hBMP2基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-hBMP2,该基因可促进人牙龈成纤维细胞向成骨细胞方向分化.
-
BMP2-海藻酸钠-壳聚糖微球对骨折愈合影响
目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)-海藻酸钠-壳聚糖微球的制备及其促进兔桡骨骨折愈合的作用.方法 采用脉冲电场法制备BMP2-海藻酸钠-壳聚糖微球,观测其形态、尺寸,测定BMP2载药量、包封率,并进行体外释放实验.制备新西兰兔骨缺损模型,随机分BMP2微球组、BMP2注射组、空微球组及空白对照组4组.于术后第30天行X线检查,比较各组骨折愈合情况.结果 微球具有很好的圆形形态,平均粒径为900.79μm;微球的平均包封率为(84.97±3.49)％,BMP2载药量平均为(16.34±0.48)％.体外模拟体液中,微球所载BMP2被缓释出来,在第7天时87.33％的BMP2被释放出来,在第14天时BMP2被完全释放出来.术后第30天BMP2微球组的骨折愈合情况较各对照组好,差异有显着性(H=6.87,P＜0.05).结论 BMP2-海藻酸钠-壳聚糖微球具有良好的缓释效果,局部植入能促进骨折修复愈合.
