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靶向COL1A1基因的shRNA对乳腺癌MDA-MB-231细胞体外侵袭与迁移的影响
目的 探讨Ⅰ型胶原α1链(COL1A1)基因沉默对人乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭与转移的影响.方法 设计2条shRNA干扰载体及1条阴性对照载体,分别稳定转染乳腺癌MDA-MB-231细胞.用Western blot法筛选抑制效率高的细胞进行细胞平板集落形成实验、细胞黏附实验、细胞迁移及侵袭实验,观察COL1A1基因对MDA-MB-231细胞黏附、运动及侵袭能力的影响.结果 转染pshRNA-COL1A1-2干扰载体的MDA-MB-231细胞COL1A1蛋白表达降低明显,抑制率达66.98％±2.08％,选择该组细胞作为有效干扰组进行后续实验.pshRNA-COL1A1转染组细胞的集落形成率显著低于空白对照组和阴性质粒pshRNA-scramble转染组(P＜0.05)；细胞黏附实验中pshRNA-COL1A1转染组细胞的吸光度值较对照组明显降低(P＜0.001)；转染pshRNA-COL1A1质粒组细胞的穿膜细胞数也显著低于空白对照组和阴性质粒pshRNA-scramble转染组(P ＜0.001).结论 COL1A1基因沉默可在体外抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的黏附、侵袭和迁移.
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3家系成骨不全基因突变及临床表型分析
目的对3家系成骨不全(OI)测序及其临床表型和突变分析,提高对成骨不全的诊断和认识.方法收集临床资料,提取患者及家属血标本;高通量测序,一代测序验证和结果分析.结果先证者1,FKBP10,EXON6,c.1016G>A,p.R339Q,纯合突变,父、母分别为此位点杂合突变.先证者2,COL1A1,EXON9,c.671G>A,p.G224D,杂合突变,父亲为此位点杂合突变,母亲基因无变异.先证者3,COL1A1,EXON30,c.2010delT,p.P670fs,杂合突变,母亲此位点杂合突变,父亲基因无突变.结论FKBP10新位点突变可能导致了XI型成骨不全及其新表型的发生;证实了COL1A1两位点突变和成骨不全之间的关系.
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泡球蚴组织蛋白处理对人肝星状细胞α-SMA和COL1A1表达及TGF-β/Smad信号通路的影响
目的 探讨泡球蚴组织蛋白在肝星状细胞活化中的作用.方法 用不同浓度泡球蚴组织蛋白体外刺激人肝星状细胞,以PBS处理作为阴性对照,TGF-β1处理肝星状细胞作为阳性对照,分别采用qRT-PCR和Western blot检测肝星状细胞中COL1A1、a-SMA和TGF-β/Smad信号通路基因及蛋白表达水平.结果 60和600 μg/ml泡球蚴蛋白处理肝星状细胞后α-SMA mRNA相对表达量分别为2.16±0.33和2.72±0.49,COL1A1 mRNA相对表达量分别为1.73±0.12和5.39±0.14;TGF-β1处理肝星状细胞后α-SMA mRNA相对表达量为13.43±0.27,COL1A1 mRNA相对表达量为18.89±2.59;PBS阴性对照组α-SMA基因相对表达量1.07±0.42,COL1A1基因相对表达量1.00±0.02.不同浓度泡球蚴蛋白组和TGF-β1处理组与PBS阴性对照组相比α-SMA及COL1A1mRNA相对表达量差异有统计学意义(P＜0.05);肝星状细胞泡球蚴组织蛋白处理组与TGF-β1处理组α-SMA和COL1A1的蛋白水平较阴性对照组显著升高(P＜0.05).TGFβ-RⅡ基因相对表达量在600 μg/ml泡球蚴组织蛋白处理组为1.71±0.08,与PBS阴性对照组1.09±0.4β相比差异具有统计学意义(P＜0.05);Smad2基因相对表达量在TGF-β1处理组为1.68±0.29,与PBS阴性对照组1.07±0.42相比差异有统计学意义(P＜0.05);Smad3基因相对表达量在600 μg/ml泡球蚴组织蛋白处理组为2.41±0.84,TGF-β1处理组为1.61±0.15,与PBS阴性对照组1.00±0.09相比差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 泡球蚴组织蛋白中有类似TGF-β作用的能够诱发宿主肝星状细胞活化的细胞因子,该细胞因子可能参与泡球蚴感染所致宿主肝纤维化损伤.
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成骨不全症家系基因突变位点的检测
目的 检测一I型成骨不全症家系中4例患者的基因突变位点.方法 收集该家系患者外周血标本及健康人对照外周血标本,采用聚合酶链式反应、直接测序对COL1A1基因突变位点检测.结果 该家系中成骨不全患者均存在COL1A1基因第23号外显子上一处G-C突变,在家系内非患者及正常对照者均未发现该突变.结论 本研究为I型成骨不全的突变位点提供了新的证据,为进一步讨论COL1A1基因型和成骨不全临床分型之间的关系提供了研究基础.
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国人COL1A1和COL1A2突变致成骨不全家系内表型不一
目的 观察123个汉族成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)家系中存在表型不一的家系比率,并探讨导致同一突变不同表型的潜在机制.方法 分析123个汉族OI家系(包括以往研究的117个家系)中存在表型不一的家系比率.用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)SNaPshot分型技术检测21个家系先证者及其表型不一家系成员的血液和口腔黏膜的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)中COL1A1和COL1A2基因21个SNP位点的分型,从而检查体细胞样本的嵌合率.同时检测2个存在COL1A2基因同一突变(c.1009G>A)家系的甲基化程度差异.结果 在123个OI家系中,21个(17.1％)家系存在表型不一,仅1例先证者的父亲显示体细胞基因镶嵌,其血液中有43.1％突变等位基因,口腔上皮细胞有39.6％的突变等位基因.在2个存在COL1A2基因同一突变(c.1009G>A)的家系中,2例先证者的甲基化程度均高于其母亲.结论 国人OI家系内COL1A1和COL1A2基因同一突变发生不同表型的比率为17％.在这21个表型不一的家系中只有1例(4.8％)先证者的父亲存在体细胞镶嵌.甲基化程度可能与表型严重程度有关.在遗传咨询时,对先证者无临床表型的家属进行致病基因的突变检测是十分必要的.
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COL1A1基因多态性与高度近视易感性的系统评价
目的 评价COL1A1基因多态性与高度近视(high myopia)的相关性.方法 检索Pubmed、万方、维普和CNKI数据库中已发表的相关文献,利用荟萃分析的方法进行病例对照研究.文献纳入标准:研究内容为COL1A1基因多态性与高度近视的病例对照研究;文章中提供了基因型频率的完整数据;研究的位点符合H-W(Hardy-Weinberg)平衡.结果 经全面的文献检索终5篇文献被纳入COL1A1基因rs2075555位点的荟萃分析,3篇文献被纳入COL1A1基因rs2269336位点的荟萃分析.合并统计量之后的结果显示,COL1A1基因rs2075555位点的基因型频率和等位基因频率4种遗传模式下在病例对照间均无明显差异(P＞0.05),COL1A1基因rs2269336位点在隐性遗传模式下与高度近视的发生存在明显关联(P=0.02).结论 COL1A1基因m2269336位点可能是高度近视发生的重要危险因素,增加高度近视的发病风险.
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Fli-1及其靶基因在颅内动脉瘤患者中的表达
目的 探讨Fli-1及其靶基因COL1A1、TNC在颅内动脉瘤患者血液单核细胞中的表达及作用. 方法 研究纳入41例颅内动脉瘤患者,其中25例动脉瘤破裂患者,16例动脉瘤未破裂患者;取病人的外周血,10例正常人外周血作为对照,分离血液单核细胞,提取总RNA,根据之前生物信息预测结果,采用实时定量RT-PCR检测Fli-1及其靶基因(COL1A1、TNC)在疾病和健康人群中的表达差异. 结果 在检测的Fli-1及靶基因COL1A1和TNC中,在颅内动脉瘤中差异表达的基因有2个,分别为Fli-1和COL1A1.进一步分组发现,相比于未发生破裂的动脉瘤患者,这两个基因在破裂的颅内动脉瘤患者中的表达有显著升高. 结论 破裂与未破裂颅内动脉瘤患者之间Fli-1及COL1A1的表达水平差异可能与动脉瘤的破裂表现存在相关性.
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新发现COL1A1基因突变致成骨不全合并催乳素瘤一例及其家系分析
目的 分析1例成骨不全合并催乳素瘤患者及其家系Ⅰ型胶原α1链( collagen, typeⅠ, α1 chain, COL1A1)基因的突变情况.方法 收集患者及其家庭成员的临床资料,并采集外周血标本,分离白细胞,提取基因组DNA,以聚合酶链反应扩增COL1A1基因各外显子并进行直接测序分析,同时与50名该地区健康非亲属人员的该基因进行比对.结果 测序分析发现患者COL1A1基因第24位内含子存在剪切突变c.1669-1 G＞A,家庭成员中先证者的父亲、二弟、小侄子3人也存在该基因突变位点,其余表型正常者未见该基因改变.通过检索发现该家系所携带的该基因突变未见报道.结论 本研究发现了1个新的COL1A1基因突变家系和突变位点,但成骨不全与催乳素瘤的关系尚不明了.
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静压力下兔髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化
目的:研究兔髁突软骨细胞对静压力的分子生物学响应.方法:体外分离培养4周龄健康雌性新西兰大白兔髁突软骨细胞,使用形态学观察,COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色方法对P2代髁突软骨细胞进行鉴定;100kPa静压力条件下,分别对P2代髁突软骨细胞进行0、1、2、3和4h的加压处理;采用CCK-8检测压力加载后各组细胞活性的变化;通过Western免疫印迹分析髁突软骨细胞COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达变化.采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析.结果:兔髁突软骨细胞呈多角形,“铺路石”样排列,细胞爬片COL2A1和SOX9免疫细胞化学染色鉴定结果为阳性.100kPa静压力加载1h时,细胞活性显著降低(P=0.04),但在2～4 h后,细胞活性恢复并与对照组无显著差异.Western印迹结果显示,压力加载3h和4h时,COL2A1、SOX9、COL1A1和ALP的表达显著升高.其中,在压力加载4h组ALP的表达量比3h组低.结论:兔髁突软骨细胞对压力微环境的改变具有一定的适应能力,100kPa静压力加载4h不会对髁突软骨细胞活性产生不可逆损伤.适宜的压力加载对髁突软骨细胞的成软骨和成骨能力有促进作用.髁突软骨细胞压力微环境的改变,可能影响颞下颌关节适应性改建和颞下颌关节紊乱病的病理过程.
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miR-369-5 p对SD大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响
目的 探讨miR-369-5p对大鼠心肌成纤维细胞(car-diac fibroblasts,CFs)活化增殖的影响.方法 差速贴壁离心法提取CFs,并于倒置相差显微镜下进行形态鉴定.分别向各组细胞瞬时转染miR-369-5p抑制物、miR-369-5p模拟物、阴性对照组(NC)24～48 h后,应用实时定量PCR检测miR-369-5p、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原前胶原A1(Col1A1)的蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖活性;Western blot测定α-SMA和Col1A1蛋白表达.结果 miR-369-5p在模拟物组CFs中表达上调;而在抑制物组中的表达下降.Western blot结果显示,α-SMA和Col1A1蛋白在模拟物组中的表达明显降低,在抑制物组中的表达明显增加.CFs瞬时转染miR-369-5p模拟物后培养48 h,CFs增殖活力明显下降,而抑制物组的CFs活力明显增强.结论 miR-369-5p表达下调能够促进CFs的活化增殖,提示miR-369-5p是心肌纤维化的可能作用靶点.
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microRNA-200 b下调DNMT3 A的表达对SD大鼠心肌纤维化抑制作用的机制研究
目的 研究微小RNA200b(miR-200b)靶向下调DNA甲基化转移酶3A(DNMT3A)对SD大鼠心肌纤维化的影响.方法 SD大鼠构建心肌纤维化模型,HE和Masson法观察病理学改变;qRT-PCR检测miR-200b的表达;Western blot法测定α-SMA、Col1A1、DNMT3A的表达.提取SD乳鼠心肌成纤维细胞(CFs),将miR-200b促进剂和抑制剂分别转染于CFs中,同时设立空白及阴性对照组.qRT-PCR检测miR-200b、DNMT3A、Col1A1和 α-SMA水平;Western blot测定DNMT3A、Col1A1和α-SMA的蛋白表达;MTT法观察CFs的增殖情况.结果 HE和Masson染色结果显示,模型组SD大鼠心肌组织胶原纤维明显增多,心肌细胞排列杂乱;qRT-PCR显示miR-200b表达降低;Western blot显示,α-SMA、Col1A1、DNMT3A蛋白水平升高.体外实验qRT-PCR结果显示,α-SMA、Col1A1、DNMT3A在miR-200b促进剂组中的表达降低,miR-200b抑制剂组则相反;Western blot显示,miR-200b促进剂组中DNMT3A、Col1A1和 α-SMA的表达降低,miR-200b抑制剂组结果则相反;MTT结果显示,外源性过表达miR-200b 24、48、72、96 h后,CFs增殖水平降低,而miR-200b抑制剂组结果相反.结论 miR-200b可能通过下调DNMT3A来影响CFs的活化增殖,从而改善心肌纤维化.
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刺头复叶耳蕨总黄酮促进脐带间充质干细胞成骨分化
目的 研究刺头复叶耳蕨总黄酮(total flavonoids from arachniodes exilis,TFAE)在人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)成骨分化中的作用.方法 采用组织块贴壁法分离培养hUCMSCs,取P3代细胞进行实验,不同浓度的TFAE处理hUCMSCs,CCK-8法检测细胞活性;AMP法测定碱性磷酸酶(ALP)活力,茜素红染色检测钙结节形成;RT-PCR检测成骨相关基因I型胶原酶a1(collagen type I alpha1, Col1a1)、骨桥蛋白(osteopotin, OPN)、Runx2、Osterix(Osx)mRNA表达水平,Western blot检测Col1a1、OPN蛋白表达水平.结果 在一定浓度范围内,TFAE(1、5 mg·L-1)促进细胞增殖;钙结节数量增多;ALP活力增强,成骨相关基因Col1a1、OPN、Runx2、OsxmRNA及Col1a1、OPN蛋白表达水平上调.结论 一定浓度的TFAE促进hUCMSCs增殖及成骨分化.
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化学合成microRNA-29 a inhibitors和mimics对SD大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响
目的：探讨微小 RNA-29a ( miR-29a) inhibitors 和mimics对大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响。方法取SD大鼠心肌组织,以组织块酶消化法分离细胞,通过差速贴壁离心法收集、培养SD大鼠心肌成纤维细胞。应用Lipo-fectamineTM 2000 Reagent分别向大鼠心肌成纤维细胞瞬时转染miR-29a inhibitors和miR-29a mimics 24 h和48 h后,实时定量聚合酶链反应( qRT-PCR)检测miR-29a、Ⅰ型胶原前胶原 A1(Col1A1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的RNA水平的表达,MTT 法检测细胞增殖活性。结果与正常对照组和阴性对照组比较,在瞬时转染miR-29a inhibitors的心肌成纤维细胞中,miR-29a 的表达水平下调；而在转染 miR-29a mimics的心肌成纤维细胞中, miR-29a 的表达水平上调。Col1A1在miR-29a inhibitors组中表达水平升高,而在miR-29a mimics组中则表达水平降低。α-SMA在miR-29a inhibi-tors组中表达水平升高,在miR-29a mimics组中则表达水平降低。瞬时转染miR-29a mimics 24、48 h后,与空白对照组和其阴性对照组相比较,心肌成纤维细胞活力明显下降；而瞬时转染miR-29a inhibitors 24、48 h后,心肌成纤维细胞活力则明显增强。结论 miR-29a mimics可明显抑制心肌成纤维细胞增殖活性,而miR-29a inhibitors则显著提高心肌成纤维细胞的增殖活性,提示心肌纤维化的形成可能与 miR-29a 表达下调有关,其潜在的分子作用机制有待进一步研究。
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化学合成 microRNA-21 inhibitors 对大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响
目的：探究 microRNA-21 inhibitors 对大鼠心肌成纤维细胞活化增殖的影响。方法应用 LipofectamineTM 2000 Reagent 向大鼠心肌成纤维细胞瞬时转染 microRNA-21 in-hibitors 24、48 h 后,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测 microRNA-21、I 型胶原前胶原 A1(Col1A1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平；Western blot 法检测 Col1A1和α-SMA 的表达水平；MTT 法检测 microRNA-21 inhibitors对心肌成纤维细胞活化增殖的影响。结果转染 microR-NA-21 inhibitors 的心肌成纤维细胞中,microRNA-21表达下调,Col1A1和α-SMA 的表达下降；转染 microRNA-21 inhibi-tors 的心肌成纤维细胞增殖活性明显减弱。结论 microR-NA-21 inhibitors 可明显抑制心肌成纤维细胞增殖活性,提示microRNA-21是心肌成纤维细胞活化增殖的潜在靶向分子,有利于为干预和预防心肌纤维化的发生发展提供新思路。
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RNAi对人类皮肤成纤维细胞COL1A1及COL3A1表达的影响
目的 研究RNA干扰(RNAi)技术对人类皮肤成纤维细胞(HSF)COL1A1及COL3A1表达的影响.Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原是构成皮肤结缔组织的主要成份,其异常是造成真皮结缔组织以及纤维增生性疾病病理变化的主要因素.RNAi技术可有效抑制特定基因的表达.方法 利用小干扰RNA(siRNA)表达框(SEC)快速筛选有效干扰序列,再将有效SEC的siRNA片段连接入表达载体并转染HSFs,获得稳定抑制效果.结果 经过筛选的有效SEC可特异性抑制HSFs中COL1A1和COL3A1的表达(分别至野生株的5.00%和6.48%),载体介导的有效干扰序列可稳定抑制HSFs中COL1A1和COL3A1的表达,抑制效果达30 d(分别至阴性对照的25.21%和22.12%).结论 SEC和载体介导的RNAi均可有效并且特异性抑制COL1A1和COL3A1在HSFs中的表达.
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成骨相关基因在强直性脊柱炎与正常人成纤维细胞的表达差异
目的:探究强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)患者与正常人脊上韧带成纤维细胞的原代爬出时间、生长曲线及两组细胞之间的成骨相关性指标的差异.方法:取AS和正常人棘上韧带,离体原代培养成纤维细胞.记录组织爬出成纤维细胞时间和四甲基偶氮唑盐(MTT)检测法检测两组细胞生长曲线.原代细胞爬出后传代培养,取对数期细胞RNA并逆转录CDNA,实时荧光定量PCR法检测两组细胞之间成骨相关基因表达的差异.结果:两组细胞的爬出时间有明显差异(P＜0.05),生长曲线大致成“S”型,两组细胞生长曲线未见明显差异.Ⅰ型胶原酶(COL1A1)在两组之间表达无差异(P＞0.05),骨钙素(OC)基因起始表达量过低,可记为不表达.结论:AS组与正常人组成纤维细胞成骨性相关基因原始表达量和生长曲线均无明显差异.
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IL-13和乙醇促进人肺成纤维细胞胶原的表达
目的:研究乙醇和/或白细胞介素13(IL-13)对人肺成纤维细胞(HFL-1)Ⅰ、Ⅲ型胶原α1链基因(COL1A1、COL3A1)以及Ⅰ型胶原蛋白(Co Ⅰ)表达的影响,探讨肺纤维化的机制.方法:培养HFL-1,通过实时定量荧光RT-PCR检测乙醇和/或IL-13对HFL-1细胞IL-13受体(IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-4Rα)mRNA、COL1A1 mRNA和COL3A1 mRNA表达的影响,ELISA的方法检测乙醇和/或IL-13对HFL-1分泌Co Ⅰ的影响.结果:单独低浓度乙醇(25、50、100、200mmol/L)作用HFL-1后,与对照组相比IL-13Rα1 mRNA与IL-4Rα mRNA水平比对照组显著增高(P<0.05),而IL-13Rα2 mRNA水平比对照组显著降低(P<0.05).单独低浓度乙醇(25、50、100、200 mmol/L)对HFL-1的COL1A1 mR-NA和COL3A1 mRNA表达无影响(P>0.05).IL-13(10、20、50μg/L)可以促进HFL-1的COL1A1 mRNA和COL3A1 mR-NA的表达(P<0.05),且存在浓度依赖性.乙醇(200 mmol/L)与IL-13(10、20、50μg/L)共同作用刺激HFL-1促进COL1A1 mRNA和COL3A1 mRNA的表达比IL-13(10、20、50μg/L)单独作用强(P<0.05).IL-13组(10、20、50μg/L)和乙醇(200 mmol/L)与IL-13(10、20、50μg/L)共同刺激组HFL-1均有Co Ⅰ的分泌,但共同刺激组HFL-1分泌Co Ⅰ量显著增加(P<0.05).结论:单独低浓度乙醇(25、50、100、200mmol/L)不影响HFL-1细胞的COL1A1和COL3A1表达,但可以影响HFL-1细胞IL-4Rα、IL-13Rα1和IL-13Rα2的表达,而乙醇与IL-13共同刺激与单独IL-13刺激相比对HFL-1的COL1A1和COL3A1以及Co Ⅰ的表达有显著的促进作用.
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miR-498通过下调FOXM1抑制肺腺癌细胞系A549的迁移侵袭
目的 探索微小RNA498(miR-498)是否通过下调FOXM1抑制肺癌细胞系(A549)细胞的迁移和侵袭.方法 转染miR-498mimic和miR-NC至培养的A549细胞中,Western blot检测A549细胞中COL1A1、COL1A5、FOXM1的表达情况,划痕试验和Transwell法观察细胞迁移侵袭情况,荧光素酶试验验证FOXM1是miR-498的靶基因;再通过转染过表达FOXM1的质粒至已成功转染miR-498的A549细胞中,检测A549细胞中COL1A1、COL1A5、FOXM1的表达情况,划痕试验和Transwell法观察细胞迁移侵袭情况.结果 与空质粒组比较,转染miR-498mimic的A549细胞中COL1A1、COL1A5、FOXM1的表达减少(P<0.05),A549细胞的迁移侵袭减少(P<0.01);荧光素酶实验结果显示,miR-498能够显著降低FOXM1-3′-UTR质粒的荧光素活性(P<0.05);与miR-498+空质粒组比较,转染过表达FOXM1质粒的A549细胞中COL1A1、COL1A5表达增加(P<0.05),细胞的迁移侵袭增加(P<0.01).结论 miR-498可以通过下调FOXM1而抑制A549的迁移和侵袭.
