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SH-EP1细胞株转染表达神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型激活态的电生理学特征
目的:建立SH-EP1细胞株转染表达的神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型的膜片钳全细胞记录技术并研究其激活态的电生理学特征.方法:用高糖DMEM培养液培养细胞.传代3 d后,细胞可用于膜片钳全细胞记录.通过多管给药电极喷射给予激动剂烟碱(α4β2,α4β4)或胆碱(α7)诱导受体由静息态转变为激活态.结果:传代培养的SH-EP1细胞功能状态良好,受体表达丰富.α4β2、α4β4和α7三种亚型均可被激动剂快速激活诱发内向电流,且该三种通道的内向电流均具有激动剂浓度依赖性、电压依赖性和内向整流特性.三种通道由静息态转变为激活态、以及激活态受体数目减少的速度各不相同.其中,α7亚型激活速度快,失活速度也快;α4β4亚型激活速度慢,失活速度也慢;α4β2亚型则均居中.结论:在激动剂作用下神经元N受体α4β2、α4β4和α7亚型激活态的形成和转变各具特点,但其介导的内向电流均具有激动剂浓度依赖性、电压依赖性和内向整流特性.
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下丘脑神经元钙激活钾通道的整流现象
目的: 研究SD乳鼠下丘脑神经元中钙激活钾通道的整流现象.方法:采用膜片钳内面向外式记录方式.结果:记录到一种大电导钙激活钾通道(KCa),在对称140 mmol/L [K+]时内向电导为(171±12)pS,不随[Ca2+] 变化而改变,而外向电导可受[Ca2+]调控,当[Ca2+]为500 μmol/L时,外向电导为(76±14)pS.[Ca2+] 越大,整流现象越明显,Mg2+对这种KCa的整流作用不明显.结论:下丘脑神经元中KCa具有Ca2+依赖性整流现象,它可能与神经元的兴奋性和稳定性有关.
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低压低氧对胎鼠海马神经元NMDA受体影响的实验研究
目的:观察低压低氧环境对胎鼠海马神经元NMDA受体数目和通道特性的影响.方法:采用原位杂交和膜片钳观察NMDA受体的数量和功能.结果:胎鼠低压低氧后,NMDA受体数量和通道开放机率减少,通道开放时间常数减少,通道关闭时间常数增加.结论:低压低氧影响到胎鼠NMDA受体的发育,提示低压低氧环境下大鼠的学习记忆可能受到影响.
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低氧预处理提高下丘脑细胞缺氧耐受性与Na+、K+电流的关系
目的:研究低氧预处理提高下丘脑细胞缺氧耐受性与Na+、K+电流的关系.方法:采用培养的大鼠下丘脑神经元,用膜片钳全细胞记录技术,观察低氧预处理对其钠电流(INa)、钾电流(IK)的影响.结果:①低氧预处理未明显改变INa,但增加了IK幅值;②急性缺氧导致对照组细胞INa、IK明显受抑制,而经过低氧预处理的细胞INa、IK受抑制程度显著低于对照组.结论:低氧预处理提高下丘脑细胞的耐缺氧能力与低氧预处理后K+通道的大量开放有关.
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5-HT1B受体亚型对小脑顶核介导的运动行为的影响
目的:探讨5-羟色胺(5-HT)能神经系统在经小脑顶核介导的运动行为中的作用.方法:采用大鼠离体脑片膜片钳及大鼠走步机的行为学测试方法.结果:阻断5-HT1B受体能够增强小脑顶核兴奋性突触传递,行为学试验中给予5-HT及5-HT1B受体阻断剂SB224289,发现注射5-HT到小脑顶核后,大鼠在Rota-rod走步机上的持续时间显著延长,而给予其阻断剂SB224289后,能够反转此作用.结论:5-HT很可能通过5-HT1B受体抑制顶核神经元的兴奋性突触传递从而调节小脑核团神经元环路的活动,继而影响小脑的终输出,实现对小脑顶核介导的运动平衡和协调能力的调控.
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吗啡对新生鼠尾核神经元钾离子通道电流的作用
目的:研究吗啡对新生鼠尾核神经元钾离子通道电流的作用.方法:应用全细胞膜片钳技术在培养的尾核神经元上,观察吗啡急性与慢性处理对尾核神经元电压门控钾离子通道电流的影响.结果:吗啡急性处理尾核神经元诱发钾离子通道电流增大,电流从加吗啡前的(2.6±0.4)nA增高到(3.3±0.5)nA,加纳洛酮后电流下降为(2.4±0.4)nA;吗啡慢性处理尾核神经元的钾离子通道电流从对照组的(2.6±0.4)nA增高到(3.1±0.5)nA,加纳洛酮后电流下降为(2.4±0.4)nA.结论:在吗啡急性或慢性处理尾核神经元后,吗啡经μ受体介导,诱发尾核神经元钾离子通道电流增大,使神经元处于超极化状态,导致神经元活动的抑制.
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KCNJ11基因E23K基因多态对细胞膜电流的影响
目的:KCNJ11基因E23K多态与心血管疾病、糖尿病等相关联,本实验通过研究人KCNJ11基因外显子处E23K多态对细胞膜电流密度的影响,探讨其与相关疾病关联的机制.方法:普通PCR法扩增KCNJ11基因外显子,重叠延伸PCR法使多态位点G→A突变,基因重组法将KCNJ11基因外显子(分别含23E和23K等位基因)插入pcDNA3.1/CT-GFP真核表达载体,脂质体转染法分别将重组质粒pcDNA3.1-KCNJ11 (E)和pcDNA3.1-KCNJ11 (K)转入HEK293T细胞.采用全细胞膜片钳技术,检测转染不同质粒的细胞膜电流密度.结果:PCR扩增获得长度为1 173 bp的KCNJ11基因外显子,成功构建pcDNA3.1-KCNJ11 (E)和pcDNA3.1-KCNJ11 (K)重组表达载体.全细胞膜片钳检测结果显示,两组转染不同质粒的HEK293T细胞表面均检测到正电流和负电流,细胞表面翻转电压均为50mV.两组细胞相比,转染pcDNA3.1-KCNJ11 (E)质粒的细胞表面电流明显高于转染pcDNA3.1-KCNJ11 (K)质粒的细胞(P＜0.05,n=10).结论:KCNJ11基因外显子E23K多态能导致细胞膜电流发生改变,为进一步研究多态位点与相关疾病的关联机制提供实验基础.
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大鼠海马神经元膜离子通道随培养时间变化的特点
目的和方法:采用膜片钳全细胞记录技术观察新生大鼠海马神经元体外分散培养过程中,基本离子通道和膜参数随培养天数延长而变化的规律.结果:在7 d,14 d和21 d时电压依赖性钠电流(Voltage-dependent Na+cur-rent,ⅠNa)和延迟整流性钾电流(Delayed rectifier K+current,Ⅰk)的幅度无显著性差异.电压依赖性钙电流(Voltage-dependent Ca2+current,ⅠCa)和ⅠCa密度则持续增大,进一步研究表明,L型钙通道(L-type voltage-dependent Ca2+channel,L-VDCC)的增加是其主要原因.NMDA诱发电流随培养时间延长而明显增加.结论:钙通道和NMDA受体所介导的Ca2+内流是神经元易感于衰老和死亡的重要机制之一.
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胞外pH降低对肺动脉平滑肌细胞膜上电压门控性钾通道的调节
目的:观察pH对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)钾电流的调控作用并探讨其机制.方法:用全细胞膜片钳技术记录在正常细胞外液和不同pH的灌流液中,PASMCs膜上电压门控性钾电流大小(IKv),并分析了其电生理学特性的改变.结果:①胞外pH降低可快速可逆性抑制IKv,与对照相比(pH 7.4),pH值为7.0、6.5、6.0时,+60 mV处的峰电流的抑制率分别为:16.93%±2.47%、33.03%±2.13%、41.59%±6.53%,电流-电压关系曲线右下移.②胞外pH为7.0、6.5、6.0时,使电压依赖性Gk-Em向去极化方向移动.同时使半激活电压增加.结论:在缺氧所致缺氧性肺血管收缩反应(HPV)的发生中,胞外pH的降低可参与对IKv的调节,从而使细胞膜去极化,IKv减小,电压门控钙通道打开,平滑肌细胞收缩,这可能是缺氧导致HPV的机制之一.
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钙激活钾通道在黎芦碱致神经细胞损伤中的作用
目的:观察新生SD大鼠原代培养皮层神经元的钙激活钾通道(Kca)在黎芦碱致神经元损伤模型上的激活、抑制效应.方法:采用细胞贴附和内面向外两种膜片钳单通道记录方法记录新生SD大鼠原代培养皮层神经元的Kca电生理活动.结果:黎芦碱在胞外可激活Kca.在有钙浴液内,细胞贴附式,钳制膜电位+30 mV,加入不同浓度黎芦碱(μmol/L:15、25、50、75),通道开放概率由0.005分别增加为0.014±0.003、0.085±0.010、0.132±0.016、0.059±0.006(P＜0.01),在50μmol/L以内表现出浓度依赖性.无钙浴液内,细胞贴附式膜片上,钳制膜电位+50 mV,随药物浓度(μmol/L)增加为15、40、60、100时,通道开放概率由0.005分别增加为0.014±0.010、0.113±0.006、0.141±0.004、0 295±0.009(P＜0.05).6例内面向外式膜片上,钳制膜电位+40 mV,分别加入黎芦碱25 μmol/L、50μmol/L 3 min后,通道开放概率由0.011±0.008分别增加为0.010±0.010、0.012±0.007(P＞0.05).黎芦碱在胞内Kca开放概率,平均开放/关闭时间,电流幅值均无明显变化.结论:黎芦碱通过影响胞内游离钙水平间接调节Kca,在缺血缺氧早期,胞内游离钙增高激活Kca开放.
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氟对成骨细胞样细胞胞内钙和钙通道电流的影响
目的:观察氟(Fluoride,F-)对培养的成骨细胞样细胞胞内钙和钙通道电流的影响.方法:应用Fura-2负载的成骨细胞样细胞,通过紫外荧光分光光度仪测定细胞内游离钙的浓度,同时应用全细胞膜片钳技术记录成骨细胞样细胞钙通道的变化.结果:氟可引起成骨细胞样细胞胞内钙增高,尤以100ng/ml F-为明显,与对照组比较差异显著(P＜0.05).应用全细胞膜片钳技术发现25ng/ml F-即可引起成骨细胞样细胞钙通道开放,随着染F-剂量的增加,Ca2+通道电流的幅值增大(P＜0.01),且F-对Ca2+通道电流的兴奋作用呈剂量依赖性(r=0.9914).结论:F-可引起成骨细胞样细胞钙通道开放,从而导致细胞胞内钙浓度的增加.
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CoCl2预处理对大鼠海马神经元急性低氧后Na+、K+电流的影响
目的:观察氯化钴(CoCl2)预处理对急性低氧后海马神经元电压门控性Na+、K+电流的影响.方法:原代培养大鼠海马神经元,分为CoCl2预处理和非处理组,采用膜片钳全细胞记录技术,检测急性低氧后海马神经元钠电流(INa)、钾电流(Ik)的变化.结果:急性低氧后,海马神经元INa、IK电流幅度明显降低,INa阈值右移,而经CoCl2预处理的海马神经元INa、IK电流的降低幅度明显减轻.结论:CoCl2预处理减轻急性低氧所致的INa、IK电流变化,对神经元有明显的保护作用.
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Syn-1A在抑制弱酸性pH诱导的KATP通道活化过程中的作用
目的:观察Syn-1A在抑制弱酸性pH诱导的KATP通道活化过程中的作用及机制.方法:用稳定表达Kir6.2/SUR2A KATP通道的HEK-293细胞构建细胞膜内面向外的记录方式,并给细胞膜片连续灌流含或不含Syn-1A的pH7.4,7.0,6.8,6.5和6.0的溶液,观察弱酸性pH对通道的活化作用及Syn-1A对上述作用的抑制,并采用体外结合实验分析不同pH时syn-1A与SUR2A亚单位结合的影响.结果:Syn-1A可抑制pH 6.5,6.8和7.0时诱发的通道活化作用,Syn-1A与SUR2A的结合在pH7.4至6.0范围内,随pH下降逐渐增加.结论:Syn-1A对KATP通道的抑制作用可缓冲pH波动引起的KATP通道开放,从而抑制折返性心律失常的发生.
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镉对大鼠心室肌细胞动作及L-型钙电流的影响
目的:探讨镉(Cd)对大鼠心室肌细胞动作电位(AP)及L-型钙电流(ICa-L)影响.方法:用常规微电极和全细胞膜片钳技术记录心肌细胞动作电位和ICa-L.结果:①不同浓度的CdCl2可降低大鼠心肌细胞动作电位幅值(APA),缩短复极化时程(APD).②不同浓度的CdCl2明显抑制大鼠心室肌细胞钙通道电流.结论:CdCl2抑制大鼠心室肌细胞动作电位和ICa-L,可能是Cd对心肌毒性的重要机制之一.
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大鼠肺动脉平滑肌细胞钙激活氯通道电流的电生理检测
目的:研究大鼠肺动脉平滑肌细胞钙激活氯通道电流的电生理特性.方法:膜片钳全细胞和膜内向外记录模式检测大鼠肺动脉平滑肌细胞上钙激活氯通道全细胞电流和单通道电流.结果:大鼠肺动脉平滑肌细胞记录到稳定的钙激活氯通道电流(ICl(Ca));ICl(Ca)表现出典型的外向整流特性和电压时间依赖性激活.结论:大鼠肺动脉平滑肌细胞膜上存在电压、时间依赖性氯通道电流,钙激活氯通道通过促进肺动脉平滑肌细胞去极化而成为调节肺动脉特性的关键调节因子.
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一种适合膜片钳单通道记录的大鼠DRG神经元急性分离方法
目的:建立一种适合膜片钳单通道记录的脊髓背根神经节神经元急性分离方法.方法:用酶消化和机械分离相结合的方法急性分离大鼠DRG神经元.结果:用本方法分离的DRG细胞容易形成较高的封接电阻(＞5GΩ),降低了噪音干扰,可记录到pA级的单通道电流.结论:本方法急性分离的DRG神经元适合单通道膜片钳实验研究.
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稳定表达hHCN2基因 HEK293细胞系的建立
目的:培育稳定表达hHCN2基因的细胞系,建立一种表达研究心肌离子通道的有效模型.方法:通过脂质体转染的方法,将重组pcDNA3-hHCN2真核表达载体导入人胚肾细胞(HEK293细胞),以G418压力筛选转染细胞,并对其进行全细胞膜片钳记录.结果:经600μg/ml压力筛选后,获得抗性细胞克隆,并用全细胞膜片钳技术记录到克隆hHCN2通道编码电流.结论:本实验采用脂质体转染法成功地培育出G418抗性HEK293细胞,为进一步研究克隆离子通道结构和功能的关系奠定基础.
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培养的大脑皮层、海马及交感神经细胞钠、钾和钙离子通道的全细胞记录技术
目的: 建立新生大鼠大脑皮层、海马细胞及交感神经元细胞的培养方法及其钠、钾和钙通道的膜片钳全细胞记录技术.方法: 取出生1～3 d的大鼠大脑皮层、海马及交感神经节,用胰蛋白酶(0.125%)消化组织并分离出神经细胞,种植在涂有多聚赖氨酸的35 mm培养皿中,用高糖的DMEM培养液培养,一周后,镜下可见神经细胞壁光滑、完整,周围有明亮的光润,在高倍倒置显微镜下可见到完整的细胞核及均匀的胞浆,细胞间形成良好的突触连接,可用于细胞膜片钳记录.结果: 用胰蛋白酶消化分离培养的神经细胞,功能状态良好,在膜片钳全细胞记录中,易形成细胞与记录电极间的高阻抗封接,可分别记录到INa、IA、IK和ICa.结论:在神经系统电生理学研究中,此方法可应用于中枢神经系统不同脑区培养以及钠、钾和钙通道电流的记录.
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血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂对豚鼠心肌细胞电生理及L-型钙电流的作用
目的探讨血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂对豚鼠心肌细胞动作电位间期及L-型钙电流的作用.方法分离豚鼠乳头肌的单个心室肌细胞,采用内充3 mol/L KCl的玻璃微电极记录心肌动作电位.采用膜片钳全细胞技术,钳制电位-40 mV,保持时间200 ms,指令电位为0,并记录L-型钙电流的大峰电流.结果灌注血管紧张素Ⅱ可致多种机制的心律失常.灌注1 min,动作电位振幅、动作电位复极90%的间期(APD90)、静息膜电位(RMP)较对照状态显著降低或缩短;灌注3 min,动作电位复极30%和50%的间期(APD30和APD50)及有效不应期均较对照状态显著缩短.膜片钳研究示血管紧张素Ⅱ灌注5 min,L-型钙电流较对照状态显著增加,氯沙坦灌注1 min L-型钙电流显著降低,灌注3 min较1 min进一步降低,电压-电流关系曲线形状均无显著变化.结论血管紧张素Ⅱ降低动作电位幅度,缩短动作电位时程及有效不应期,电压依赖性增加L-型钙电流大峰电流,具有致心律失常作用,氯沙坦电压依赖性地降低L-型钙电流.
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果蝇三龄幼虫中枢神经元细胞培养
目的:建立果蝇幼虫中枢神经元细胞培养方法,为研究吸入麻醉药相关的离子通道建立实验模型.方法:取晚期三龄幼虫的脑腹神经节经解剖、酶解、冲洗、吹打、接种、培养步骤进行分散细胞的原代培养,并用膜片钳技术记录全细胞电流以检测培养细胞的功能.结果:培养的神经元细胞生长活跃,状态良好,具有神经元的特征-轴突生长及形成网络连接.以"全细胞方式"记录到的电压依赖性K+电流在不同细胞之间电流动力学和幅度变化较大,呈多样性.结论:果蝇中枢神经元可在体外进行培养,方法稳定可靠;培养的神经元细胞生长活跃,状态良好,为进行吸入麻醉药的电生理机制提供良好实验模型.
