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中性粒细胞膜K+通道电流特性研究
目的 研究中性粒细胞膜上K+通道的动力学特性.方法 采用重复梯度密度离心的方法分离中性粒细胞(PMNs),通过细胞贴附式的膜片钳单通道记录方式记录PMNs膜上K+通道的电流活动.结果 发现PMNs膜上的K+通道电流存在不同特性,一种具有电压依赖性,电导值约为56 pS,另一种不存在电压依赖性,平均电流幅度为-7 pA左右,主要在钳制电位接近PMNs静息膜电位-60 mV时开放,越偏离这个电位,开放概率越小.结论 PMNs膜上存在2种不同的K+通道电流,一种具有电压依赖性,另一种无电压依赖性,且K+通道电流的变化与细胞的功能存在密切关系.
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双酚A对大鼠背根神经节神经元钙离子通道电流影响
目的 探讨双酚A对大鼠背根神经节(DRG)神经元钙离子通道影响.方法 SD大鼠,周龄4～6周,采用酶消化法急性分离大鼠背根神经节神经元,分别采用全细胞膜片钳技术和激光共聚焦技术记录钙电流和KC1激发钙瞬变的变化.结果 双酚A(0.1、1、10、100 μmol/L)呈浓度依赖性抑制大鼠背根神经节神经元钙电流,对钙通道的半数大抑制浓度(IC50)为11.41 μmol/L;10 μmol/L双酚A显著改变Ca2+通道的激活特性,电流激活曲线去极化方向移动(P＜0.05),该浓度双酚A同样可以抑制50 mmol/L KCL激发瞬时胞内钙浓度增加.结论 双酚A对大鼠背根神经节神经元钙离子通道具有抑制作用.
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无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中电压门控性钙通道Cav1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的表达
目的 利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测电压门控性钙通道Ca,1.2和钙凋蛋白激酶Ⅱ的表达变化.方法 采用新生24h内Wistar大鼠,取海马进行神经元原代培养.体外培养至12d,无镁细胞外液处理一部分神经元3h后,应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况以及免疫印迹法检测电压门控性钙通道Ca,1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的蛋白表达.无镁细胞外液处理另一部分细胞12h后检测Ca,1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的蛋白表达.结果 在无镁细胞外液处理3h后,神经元存在自发的“癫痫样”放电,而神经元Ca,1.2和磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ表达不变；无镁诱导12h后,神经元电压门控性钙通道Ca,1.2表达下调,而磷酸化钙调蛋白激酶Ⅱ表达上调.结论 电压门控性钙通道Ca,1.2和钙调蛋白激酶Ⅱ的表达变化可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关.
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双分离法记录Wistar大鼠神经元的全细胞电流
背景:细胞培养与通道电流记录是全细胞膜片钳实验的主要难点.目的:介绍一种简单可行的降低全细胞膜片钳实验方法,将细胞急性分离与电流的分离技术结合起来,以提高工作效率,缩短实验的时间,从根本上降低膜片钳实验的难度.方法:SPF级出生4～7 d的wistar大鼠40只,雌雄不限.采用改良的急性分离的方法制备Wistar大鼠脑皮质细胞,将大鼠脑皮质切成400～600μm厚度的薄片,在人工脑脊液中通混合气静止1 h,并通以氧气.将脑组织块放入含有16 u/mL(typeX)和2 u/mL(type XIV)蛋白水解酶的人工脑脊液中,孵育60 min,清除消化酶.在全细胞电压钳制模式下,保持电位～80 mV,给予-60 mV到60 mV的去极化脉冲刺激,步阶为+10 mV,刺激波宽160 ms.记录到跨膜总电流,在全细胞电极液里面加入70 mmol/LCsCl,70 mmol/L CsF;在外液中先后加入11 μmol/L阻断剂河豚毒素、30 mmol/L的氯化四乙胺、1 mmol/L的4-AP.分别记录内向钠电流,瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流,结果用clampfit分析处理.主要观察:①细胞的形态学观察.②全细胞电流的记录.③内向钠电流的记录.④外向钾电流的记录.结果与结论:细胞空间立体结构强,表面光滑,有完整的树突或者轴突,且细胞的活性可以在25℃室温下维持8-10 h.在外液中加入1 μmol/L的河豚毒素基本上可以阻断钠电流;30 mmol/L的氯化四乙胺和1 mmol/L的4-AP可以阻断外向钾电流.结果表明,改良的细胞急性分离方法细胞功能完好.通过电流分离技术,不改变细胞外液和电极液,仅需添加特异阻断剂,可记录到内向钠电流,瞬时外向钾电流以及延迟整流钾电流,较之传统方法可显著提高工作效率.
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以膜片钳技术急性分离新生大鼠尾核神经元
背景:许多离子通道研究需要单个分散的神经元.人工原代培养的神经细胞受环境的影响,自身特性改变较大,而急性分离的神经元却能相对保持完好的生理特性.目的:建立急性分离尾核神经元的方法,用膜片钳技术研究尾核神经元离子通道及其信号转到机制,利于深入了解尾核的功能.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2008-02/12在三峡大学医学院实验中心完成.材料:新生7-10 d Wistar乳鼠12只,雌雄不限.方法:取7～10 d的大鼠,采用酶和机械分离法制备分散的单个尾核神经元,利用全细胞膜片钳技术记录电压依赖性钙电流.主要观察指标:用全细胞膜片钳急性分离大鼠尾核神经元的形态学视察和电生理特性.结果:用链蛋白酶(Protease)消化及机械分离法,急性分离的新生大鼠尾核神经元,表面光洁,胞膜完整,有较长的突起,形态和生理特性良好.利用急性分离的新生大鼠尾核神经元观察L-钙离子通道电流,所记录的电学参数在正常生理范围内,较好地保存电压依赖性钙离子通道活性.结论:分离出的神经元形态正常,有较长的轴突;保存了主要的离子通道活性,成功建立了一种适用于膜片钳技术的大鼠尾核神经元急性分离方法.
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小剂量藜芦碱诱发大鼠脑海马CA1区锥体神经元异常放电癫痫脑片模型的特征
背景:阵发性去极化漂移是癫痫活动的脑神经元的细胞学特征,过去认为其产生与突触传递异常有关.近年来,阵发性去极化漂移的内因机制得到进一步关注和重视.;目的:观察小剂量藜芦碱诱发大鼠脑海马CA1区锥体神经元产生癫痫样活动的特征,探讨其可能的离子机制.设计:探索性观察实验.单位:解放军第四军医大学的神经科学研究所.材料:实验于2002-10/2004-10在解放军第四军医大学神经科学研究所完成.选择出生后14 d的健康SD大鼠40只,所需试剂购自天津市医药公司和Sigma公司.干预:大鼠经腹腔麻醉后取脑切片,通过0.5 μmol/L藜芦碱诱发癫痫样活动.在6张脑片上诱发产生阵发性去极化飘移样放电后,灌流液中加入80 nmol/L河豚毒素,在另外5张脑片上,用抗癫痫药物苯妥英(5μmol/L)替换河豚毒素,观察在不同药物作用下细胞电生理特性的变化.主要观察指标:①细胞放电模式.②电压钳模式下通过细胞Ⅰ-Ⅴ反应计算河豚毒素敏感性持续性钠电流的大小.结果:小剂量藜芦碱细胞外灌流后,随着神经元膜的超极化,大鼠CA1区锥体细胞表现出固定模式的阵发性去极化漂移串样放电,这种电活动可被小剂量(80 nmol/L)河豚毒素或(5 μmol/L)苯妥英所阻断.电压钳模式下测量阈下河豚毒素敏感性钠电流,在膜电位-55,-60,-65mV范围内,癫痫放电神经元测值明显增大,表明小剂量藜芦碱可增强持续性钠电流,并具有电压依赖性.结论:小剂量藜芦碱可在大鼠脑海马CA1区锥体神经元上诱发出阵发性去极化漂移样癫痫活动.小剂量河豚毒素或苯妥英可阻断这种癫痫活动,其离子机制可能与持续性钠电流的增强有关.
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L型钙通道在碱性成纤维细胞生长因子调控软骨细胞增殖中的作用
背景：L 型钙通道作为电压依赖式钙通道的一种，是细胞外钙离子进入细胞内的主要途径，在维持细胞的形态及生理活动上起重要作用，具有单通道电导较大，通道衰减较慢，通道开放持续时间较长的特点，以往研究表明碱性成纤维细胞生长因子能够促进体外培养的软骨细胞的增殖。
目的：利用膜片钳技术探讨L型钙通道在碱性成纤维细胞生长因子对软骨细胞增殖分化调控中的作用。
方法：取3日龄新西兰兔关节软骨细胞，培养至第2代后，随机分为实验组和对照组，关节软骨细胞分别在含有10μg/L的碱性成纤维细胞生长因子及不含生长因子的培养液中培养。采用膜片钳记录L型钙通道在碱性成纤维细胞生长因子作用下的开放情况。然后采用激光共聚焦显微镜观察碱性成纤维细胞生长因子培养2周后软骨细胞内游离钙离子浓度。后用Cel Titer单溶液细胞增殖反应试剂盒分析连续培养8 d软骨细胞增殖情况和免疫组织化学染色方法观察培养10 d后软骨细胞合成Ⅱ型胶原情况。
结果与结论：碱性成纤维细胞生长因子对 L 型钙通道的开放有一定的抑制作用，导致细胞内游离钙离子浓度降低(P <0.01)。碱性成纤维细胞生长因子培养的软骨细胞与常规条件下培养的软骨细胞相比细胞数量增多(P <0.01)，Ⅱ型胶原染色面积明显增大(P <0.05)。结果证实，碱性成纤维细胞生长因子能够通过抑制L型钙通道的开放使软骨细胞内钙离子浓度维持在较低水平，以此促进软骨细胞的增殖和分化。 -
骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的改变
背景:目前体外实验对骨髓间充质干细胞来源的神经元样细胞的研究多集中于形态学层面和神经标志物方面,对分化后的电生理功能研究较少.目的:观察脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸诱导Wistar大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后电生理特性的变化.设计、时间及地点:细胞学体外培养,对比观察,于2005-06/2007-10在天津市环湖医院细胞室和南开大学生命科学院完成.材料:6周龄雄性Wistar大鼠3只,体质量160g左右.方法:贴壁培养法体外分离纯化间充质干细胞,用脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸联合诱导间充质干细胞向神经元样细胞分化.诱导前和诱导3 d后分别用膜片钳技术检测细胞膜电流.主要观察指标:流式细胞仪检测间充质干细胞表型:倒置显微镜观察诱导分化前后细胞形态变化;免疫细胞化学鉴定神经元特异性烯醇化酶的表达,以及全细胞电流测定结果.结果:①流式细胞仪检测结果显示,CD90阳性率(99±3)%,CD31阳性率(3.4±0.8)%,CD34阳性率(0.3±0.1)%.说明这一细胞群大部分处于未分化的干细胞状态,其纯度可达95%.②光镜下可见未经诱导的间充质干细胞多为扁平形带突起的细胞,似纤维样细胞,诱导3 d后出现神经元样细胞.③免疫细胞化学结果显示,诱导前间充质干细胞的神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性,诱导后呈强阳性.诱导72 h时分化率为(24.01±3.76)%.④诱导组神经元样细胞外向电流峰值及大外向电流密度高于对照组(P＜0.05),但未发现内向钠电流.结论:脑源性神经营养因子/碱性成纤维细胞生长因子/全反式维甲酸诱导方法可以诱导间充质干细胞向神经元方向分化,虽未发现具有成熟神经元电生理功能,但有向成熟神经元分化的趋势.
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人胚胎干细胞源多巴胺能神经元的功能性分化
背景:干细胞源多巴胺能神经元作为帕金森病替代疗法的细胞来源,其体外分化方案被不断的优化和改良,后续的鉴定手段和检测指标也随之不断完善.目的:通过观察人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元的形态发育过程,检测其电生理特性,以了解在目前分化方案下人胚胎干细胞能否发育为形态成熟、功能成熟的多巴胺能神经元.方法:通过单层贴壁法,采用SMAD通道双抑制剂分化方案,定向诱导人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元,通过光镜、电镜和细胞免疫荧光等检测手段进行形态学和免疫化学鉴定,并应用膜片钳技术检测多巴胺能神经元的电生理特性.参照体内多巴胺能神经元的电生理标准,对体外分化的多巴胺能神经元进行功能评价.结果与结论:①采用SMAD通道双抑制剂分化方案,成功诱导人胚胎干细胞定向分化为形态学上发育成熟的多巴胺能神经元;②膜片钳检测结果显示多巴胺能神经元具有成熟的电生理功能,且其电生理特性符合体内多巴胺能神经元的评价标准;③上述分化方案可以将人胚胎干细胞定向分化为成熟的、有功能的多巴胺能神经元.
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海洛因成瘾模型大鼠心肌细胞的动作电位和L型钙通道电流
背景：钙离子通道异常可导致心肌受损，海洛因可直接作用钙离子通道，从而改变心肌结构。
目的：观察海洛因成瘾致大鼠心律失常后心肌细胞超微结构、L 型钙离子通道电流及心肌细胞动作电位的变化情况。
方法：SD大鼠随机分为对照组和模型组，模型组大鼠以海洛因初使剂量5 mg/(kg?d)，采用逐日剂量递增法[递增剂量2.5 mg/(kg?d)]复制海洛因成瘾大鼠模型；20 d海洛因成瘾模型成功建立，继续递增剂量至第30天，进一步建立海洛因成瘾大鼠心律失常模型。
结果与结论：与对照组相比，海洛因成瘾大鼠心肌电镜结构改变主要表现在细胞核膜皱缩、核浓缩、变小，染色质集结成块，线粒体嵴排列紊乱、消失，肌小节排列紊乱、灶性断裂，肌丝辨识不清等，心肌细胞 L 型钙通道电流-电压曲线呈现上移趋势，90%去极化动作电位显著缩短。表明海洛因可直接致心肌结构发生病理改变，钙通道电流发生改变是造成心肌损伤的主要原因之一。 -
缬沙坦对大鼠心室肌细胞L-型钙通道电流的影响
目的 研究AT1受体拮抗剂缬沙坦对正常大鼠心室肌细胞L-钙电流(Ica-L)的影响.方法 采用全细胞膜片钳技术,观察0.4 μmol/L 的缬沙坦引起单个大鼠心室肌细胞L型钙通道电流变化.结果 0.4 μmol/L 缬沙坦使正常大鼠心室肌细胞L型钙电流峰值明显降低(P＜0.01),I-V曲线上移,但不改变其激活电位、峰值电位和反转电位.不影响通道稳态激活曲线,使稳态失活曲线左移.结论 0.4 μmol/L 缬沙坦可直接阻断大鼠心室肌细胞L型钙通道,改变心室肌细胞的电生理特性,可能是其抗心律失常的机制之一.
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安律胶囊对豚鼠心室肌细胞钾离子通道的影响
目的:通过研究安律胶囊对豚鼠心室肌细胞钾离子通道的影响,以探讨其抗心律失常的作用机制.方法:采用膜片钳全细胞记录技术记录了安律胶囊对单个豚鼠心室肌细胞钾电流的影响.结果:①安律胶囊清膏2、20、200μg/L可使IKl幅值从给药前的(-2.06±0.29,nA)降低到(-1.95±0.34、-1.67±0.43和-1.62±0.25,nA),大剂量具有显著的统计学意义(P<0.05);在对IK1时效关系的实验中,在200μg/L的安律胶囊清膏作用下,未计时时大内向峰值钾电流为(-1.60±0.27,ha),1min、4min、8min后,大内向峰值钾电流分别为(-1.56±0.35,-1.34±0.26和-1.26±0.29,nA),无统计学意义(P>0.05).②安律胶囊清膏2、20、200μg/L可使 Ito1幅值从未给药时的(1.14±0.17,nA),降低到(1.13±0.17、1.10±0.16和1.06±0.13,但无但无统计学意义(P>0.05).③安律胶囊清膏2、20、200μg/L可剂量依赖性的降低Ik,分别使Ik幅值从给药前的(1.45±0.15,nA),降低到(1.42±0.15、1.29±0.10和1.20±0.11,nA),中剂量组具有显著的统计学意义(P<0.05),大荆量具有极为显著的统计学意义(P<0.01);在对Ik时效关系的实验中,在200μg/L的安律胶囊清膏作用下,未计时时大内向峰值电流为(1.45±0.15,nA),1min、4min、8min后,大内向峰值钾电流分别为(1.21±0.10,1.20±0.12和1.11±0.13,nA),无统计学意义(P>0.05).结论:安律胶囊对IK1有一定的阻滞作用且可剂量依赖性的阻滞Ik,但不具有时间依赖性,对Ito1无阻滞作用,这是其抗心律失常作用的机理之一.
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壬基苯酚对豚鼠心室肌细胞L-型钙电流的影响
目的 观察环境激素壬基苯酚(NP)对豚鼠心室肌细胞L-广型钙电流(I_(Ca-L))的影响.方法 应用酶机械法分离豚鼠单个心室肌细胞;应用膜片钳全细胞方法观察NP对单个心室肌细胞I_(Ca-L)的影响.结果 NP可抑制不同膜电位下的I_(Ca-L),NP(10~(-6) mol·L~(-1)、10~(-5) mol·L~(-1))使I_(Ca-L)峰值电流密度从(-3.2±1.5)pA.pF-1减少到(-1.6±0.8)pA·pF~(-1)(P＜0.01)和(-1.4±0.7)pA·pF~(-1)(P＜0.01);但对I_(Ca-L)激活动力学曲线无明显影响.结论 NP可剂量依赖性抑制豚鼠心室肌细胞I_(Ca-L).
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无镁诱导培养大鼠海马神经元与SH-SY5Y细胞自发性放电的变化
目的 利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元和SH-SY5Y细胞建立癫痫放电模型.方法 采用新生24 h内Wistar大鼠,分离海马神经元进行原代培养.无镁细胞外液处理体外培养至10 d的神经元和传代培养的SH-SY5Y细胞3h后恢复正常细胞外液,应用全细胞膜片钳技术记录2种细胞的放电情况.结果 无镁处理后的神经元存在自发性的“癫痫样”放电；SH-SY5Y细胞未出现“癫痫样”放电.结论 细胞间通过突触联系形成网状结构可能是诱导“癫痫样”放电的必要条件之一.
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尾核神经元的原代培养及离子通道特性的研究
目的 建立一种稳定的大鼠尾核神经元的分离和体外培养方法,用于中枢神经元离子通道特性的研究.方法 自新生24 h内的Wistar乳鼠大脑中分离出尾核,结合酶消化及机械吹打分离尾核神经元,进行体外原代神经元培养.采用全细胞膜片钳技术记录电压门控钠通道电流和电压门控钾通道电流.结果 分离出的神经元形态正常,细胞膜光滑有弹性,保存了主要离子通道的活性.结论 本方法适用于中枢神经系统神经元离子通道的研究.
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无镁诱导培养大鼠海马神经元癫痫放电模型中延迟整流钾电流的变化
目的 利用无镁细胞外液诱导原代培养大鼠海马神经元癫痫放电模型来检测延迟整流钾电流的变化.方法 采用新生24 h内Wistar大鼠,分离海马神经元进行原代培养.体外培养至12～16 d时,无镁细胞外液处理神经元3 h并恢复正常细胞外液,应用全细胞膜片钳技术记录神经元的放电情况及延迟整流钾电流.结果 无锾处理后的神经元存在自发的"癫痫样"放电;无镁诱导可使神经元延迟整流钾电流增大.结论 延迟整流钾电流增大可能与无镁诱导体外培养大鼠海马神经元自发异常放电的基础病理机制相关.
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钙调蛋白的N末端和C末端片段载体构建和蛋白制备
目的 构建钙调蛋白(CaM)的N末端片段(N-lobe)、C末端片段(C-lobe)及其钙离子(Ca2+)结合位点突变体(N-lobe12,C-lobe34)原核表达载体并进行蛋白表达、纯化和活性鉴定.方法 将上述cDNA片段插入PGEX-6p-3质粒载体后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.利用Glutathione-Sepharose 4B beads进行分离纯化.采用SDS-PAGE检测目的蛋白纯度和相对分子质量,Bradfo rd方法测定纯化后蛋白浓度,GST pull-down方法和膜片钳技术检测纯化后蛋白活性.结果 蛋白高表达,纯化后获得高纯度、高浓度目的蛋白,纯化后蛋白能与Cav l.2型钙通道结合并可恢复已“rundown”心肌细胞膜钙通道的活性.结论本研究成功构建可以表达生物活性蛋白的N-lobe、C-lobe、N-lobe12及C-lobe34原核表达载体,为深入研究CaM的生物学功能奠定了基础.
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诺贝尔生理学或医学奖中的“四大利器”
生物医学原理与高科技结合诞生了心电图仪、CT扫描仪、核磁共振成像及膜片钳等四个仪器,它们还登上了诺贝尔生理学或医学奖的宝座.这些仪器将科学技术通过发明的途径物化成生产工具,对人类进步做出了巨大贡献,犹如开路“利器”,对人类文明的历史产生了深远的影响.挖掘四大“利器”研发历程中的重大进展,对未来相关研究在科学思维层面提供了极好的哲学理念和探索启示.仪器获奖的意义在于将科学仪器赋予人类的强大力量在一定程度上转化为能够按照人类自己的目的和方式去设计和建设自己的未来.
关键词： 心电图仪 CT扫描仪 核磁共振成像 膜片钳 诺贝尔生理学或医学奖 -
钙离子致神经细胞损伤中钙激活钾通道的应用研究
目的：采用膜片钳单通道记录法，对新生SD大鼠的皮层神经元中，钙激活钾通道（KCa）特征，及胞内不同游离钙水平，开放动力学的调节。结果：培养SD大鼠皮层神经元中，KCa以大电导活动占优势，胞内游离钙为10-8mol/L时，通道几乎不开放，在10-6mol/L 时达大激活。结论：神经元上KCa通道开放概率，依赖于胞浆中钙离子膜电位，KCa对胞内钙离子浓度敏感。钾通道的开放剂，有一定神经细胞保护作用。
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钾通道开放剂对哮喘豚鼠支气管平滑肌电压依赖性钾通道的作用
采用膜片钳技术探讨哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞(BSMCs)电压依赖性钾离子通道(Ⅸ)特性的变化和钾通道开放剂对哮喘豚鼠支气管平滑肌细胞IK的作用.
