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EGCG和PC-B2联合用药对AFB1致肝细胞损伤的保护作用及其机制
目的:探讨多酚类植物化学物表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)与原花青素B2(PC-B2),对黄曲霉素B1(AFB1)起的肝细胞损伤保护作用及机制.方法:选用人胚肝细胞(L-02细胞)进行体外实验研究,实验分为6组,分别为空白组,溶剂对照组,AFB1染毒组,AFB1染毒+EGCG组,AFB1染毒+PC-B2组和AFB1染毒+EGCG+ PC-B2组.采用MTT检测细胞存活度,通过单细胞凝胶电泳试验(SCGE)检测细胞DNA损伤,通过流式细胞法检测细胞凋亡,采用Western blot法检测凋亡信号通路相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3),Caspase-9,p53蛋白表达的水平.结果:EGCG与PC-B2均能降低AFB1所致L-02细胞的生长抑制,使AFB1对肝细胞的生长抑制率从61.12％降至42.18％和46.72％;EGCG与PC-B2联用则效果更佳.SCGE实验结果表明EGCG与PC-B2单用与联用均能减小AFB1引起的L-02细胞DNA损伤(P＜0.05).EGCG与PC-B2单用与联用均能显著降低AFB1所致L-02细胞的早期凋亡率(P＜0.05).Western blot实验结果表明,AFB1染毒后,EGCG和/或PC-B2处理均能显著降低Caspase-3,Caspase-9的表达(P＜0.01),提高Bcl-2/Bax比值,而对p53表达影响不明显.结论:EGCG与PC-B2通过降低L-02细胞DNA损伤与细胞凋亡率,从而降低AFB1对人肝细胞的损伤作用,其作用机制可能与下调Caspase-3,Caspase-9的表达,升高Bcl-2/Bax有关.
关键词： 表没食子儿茶素没食子酸酯 原花青素B2 对黄曲霉素B1 DNA损伤 细胞凋亡 -
蛇附子化学成分及抗氧化活性研究
目的 研究蛇附子(三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum的块根)的化学成分及抗氧化活性.方法 采用多种色谱技术对其进行分离纯化,应用1H-NMR、13C-NMR、MS、HR-MS等波谱学方法进行结构鉴定;利用DPPH法进行抗氧化活性测定.结果 从蛇附子80％甲醇提取物中分离得到14个化合物,分别鉴定为山柰酚(1)、槲皮素(2)、水杨酸(3)、苯甲酸(4)、氧化白藜芦醇(5)、儿茶素(6)、表儿茶素(7)、表没食子儿茶素(8)、原花青素B2 (9)、原花青素B1 (10)、绿原酸(11)、原儿茶醛(12)、对羟基苯甲酸(13)、原儿茶酸(14);其中化合物2、8、9、10、12抗氧化活性IC50值分别为14.15、14.19、15.99、12.4、15.98 μmol/L,优于阳性药维生素C(IC50值为23.0μmol/L).结论 化合物4～12均系首次从该植物中分离,得到蛇附子中除了黄酮类成分外,也富含较多的有机酸类成分;并且化合物2、8、9、10、12抗氧化活性良好.
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指纹图谱与一测多评法相结合评价荔枝多酚提取物
目的 采用指纹图谱与一测多评(QAMS)结合的方法评价荔枝多酚提取物,并测定提取物中4种多酚类成分.方法 采用RP-UPLC法测定22批荔枝多酚提取物,建立指纹图谱的共有模式.以表儿茶素为内参物,建立原花青素A2、原花青素B2、表儿茶素-(4β--8,2β→O→7)-表儿茶素-(4β→8)-表儿茶素(PC-C)的相对校正因子(f),并测定各成分量,实现QAMS.同时比较QAMS和外标法测定4种多酚类成分量测得值的差异,验证QAMS的可行性及其准确性.结果 22批荔枝多酚提取物特征指纹图谱标定了19个共有峰,指认了其中9个共有峰,即4个已知主成分6号峰(原花青素B2)、8号峰(表儿茶素)、9号峰(PC-C)、15号峰(原花青素A2),3个A型原花青素三聚体(12、16、17号峰),1个A型原花青素二聚体(19号峰)和1个B型原花青素二聚体(14号峰);22批荔枝多酚提取物相似度大于0.9,其中4个主成分的QAMS计算值与外标法实测值间无显著差异(P＞0.25).结论 指纹图谱与QAMS结合的质控模式准确可行,可为全面合理评价荔枝多酚提取物的质量提供参考.
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HPLC法评估25种国产干红葡萄酒质量研究
目的 对25种不同品牌、产地和年份的国产干红葡萄酒中7种活性成分(没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、白藜芦醇和鞣花酸)进行HPLC法同步检测,为其质量评价提供科学依据.方法 采用HPLC法测定中国干红葡萄酒中没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、白藜芦醇和鞣花酸的量.色谱条件为Kromasil C18(150mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液,梯度洗脱:0～21 min,19％乙腈;21～24 min,19％～25％乙腈;24～32 min,25％～30％乙腈;32～39 min,30％～40％乙腈;39～44 min,40％～50％乙腈;44～55 min,50％～60％乙腈;55～60 min,60％～80％乙腈;60～65 min,80％～100％乙腈;65～70 min,100％乙腈;体积流量为1 mL/min;柱温25℃;检测波长为280 nm;每次进样10μ.结果实 验所测中国干红葡萄酒中都含有没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、白藜芦醇和鞣花酸7种活性成分,定量范围依次为31.6～111.9、3.7～11.9、30.7～71.9、30.3～135.7、29.8～82.5、0.9～12.3、1.9～23.2 mg/L.结论 没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、白藜芦醇和鞣花酸7种活性成分可作为国产干红葡萄酒质量评价的指标,它们的存在是干红葡萄酒品质的保障和保健作用的物质基础.
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RP-HPLC法测定葡萄籽提取物中原花青素B1和B2的含量
目的 建立同时测定葡萄籽提取物中原花青素B1和B2含量的方法.方法 采用RP-HPLC法.色谱柱为Kromasil C18柱(250 mm ×4.6 mm,5μm),以甲醇-体积分数0.1％磷酸溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长280nm.结果 原花青素B1和B2的质量浓度分别在23.0～230 mg·L-1(r=0.9991)和14.5～145 mg·L-1(r =0.999 4)内与峰面积呈良好的线性关系;平均回收率分别为96.3％和97.5％,RSD分别为1.4％和1.3％.结论 该方法简便、准确、重复性好,可用于测定葡萄籽提取物中原花青素B1和B2的含量.
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HPLC法测定金荞麦提取物中原花青素B2、表儿茶素
目的 建立金荞麦提取物中原花青素B2、表儿茶素的测定方法.方法 采用高效液相色谱法.色谱柱:Zorbax C18(4.6 mm×250 mm,5μm);以乙腈-0.01 mol/L磷酸溶液(8:92)为流动相;检测波长为280 nm;体积流量:0.8 mL/min;柱温:35℃;进样量为10μL.结果 原花青素B2、表儿茶素分别在0.0143～0.3420μg(r=0.9996),0.0227～0.5436 μg(r=0.999 8)范围内呈良好线性关系;平均回收率分别为98.70%(RSD=0.59%),98.8%(RSD为0.69%).结论 本法准确可靠,专属性强,结果 稳定,重现性好,适合金养麦提取物中原花青素B2、表儿茶素的测定.
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HPLC测定葡萄籽提取物中原花青素B2的含量
目的:测定不同来源的葡萄籽提取物中原花青素B2的含量.方法:采用高效液相色谱法,ZORBAX SB-C18柱,流动相为乙腈-2%冰醋酸,梯度洗脱,检测波长280 nm.结果:原花青素B2在1～30μg/mL范围内,线性关系良好.平均加样回收率为99.29%(n=5),RSD=1.64%.结论:该方法简便、准备、重复性好,可用于测定原花青素B2的含量.
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HPLC法测定威麦宁胶囊中原花青素B2和表儿茶的含量
目的:建立威麦宁胶囊中原花青素B2、表儿茶素的HPLC测定方法.方法:采用高效液相色谱法测定原花青素B2、表儿茶素的含量,其标准曲线、精密度、重复性、加样回收率均符合要求.色谱柱:Zorbax SB-C18柱,流动相为乙腈-0.04％磷酸水溶液,梯度洗脱,检测波长为280nm,柱温30℃,流速1.0 mL·min-1,进样量10 μL.结果:原花青素B2、表儿茶素的标准曲线分别为A原花青素B2=7047.3C-1066 (r=0.9998),A表儿茶素=7321.9C-601.43 (r=0.9999),加样回收率分别为93.56％(RSD 4.36％)、99.34％(R SD 4.14％),3个批次威麦宁胶囊中原花青素B2、表儿茶素的平均含量分别为1.44mg/粒、0.96mg/粒.结论:威麦宁胶囊3个批次中2种主要成分的含量相近.该方法简便、准确、重复性好,可为威麦宁胶囊提供质量控制方法.
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高效液相色谱法同时测定葡萄籽提取物中儿茶素、原花青素B1和原花青素B2的含量﹡
目的：建立高效液相色谱法同时测定葡萄籽提取物中儿茶素、原花青素B1和原花青素B2的含量。方法色谱柱为Zorbax SB C18，流动相为乙腈－0．5％冰醋酸溶液（梯度洗脱），检测波长为278 nm，柱温为35℃，流速为1．0 ml／min。结果儿茶素、原花青素B1和原花青素B2的质量浓度分别在0．99～66．0（r＝0．9999）、0．774～51．6（r＝0．9998）、1．44～96．0（r＝0．9999）mg／L范围内呈良好的线性关系，精密度试验及重复性、稳定性试验的相对标准偏差（RSD）均小于3％，平均加样回收率分别为99．48％、95．95％、99．14％，RSD 分别为0．90％、0．91％、2．72％（n＝6）。结论本方法经验证，可用于葡萄籽提取物中儿茶素、原花青素B1和原花青素B2含量的测定。
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原花青素B2对LPS诱导的心肌细胞凋亡的保护作用
目的：研究原花青素B2( procyanidin B2, PCB2)对脂多糖( lipopolysacchride, LPS)诱导的心肌细胞凋亡的保护作用及其机制。方法采用原代培养新生大鼠心肌细胞, LPS诱导心肌细胞损伤模型,PCB2低、中、高剂量组分别用含有6．25、12．5、25．0μmol·L-1 PCB2的DMEM培养基持续培养24 h。采用四唑盐( MTT)比色法测定心肌细胞存活率,光泽精化学发光法测定心肌细胞NOX的活性, Western blot法分析心肌NADPH氧化酶p47phox亚基的表达,TUNEL法检测细胞凋亡,流式细胞术测定心肌细胞ROS的含量。结果 LPS诱导的细胞损伤组与正常对照组( Control)比较,心肌细胞活力明显降低( P<0．01),而心肌细胞NOX活性、p47 phox亚基的表达、凋亡细胞数量以及 ROS 含量均明显增加( P <0．01)。 PCB2处理后,低、中、高剂量组细胞活力均明显升高,心肌细胞NOX活性、p47 phox亚基的表达、凋亡细胞数量以及ROS含量均明显下降,且具有剂量依赖性( P<0．01)。结论 PCB2通过抑制NADPH氧化酶激活、p47 phox的表达以及活性氧的产生发挥对LPS诱导的心肌细胞凋亡的保护作用。
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平衡透析法测定人体外血浆中原花青素B2、表儿茶素蛋白结合率
目的 建立检测原花青素B2、表儿茶素在血浆中药物浓度的方法,并测定其体外血浆蛋白结合率.方法 采用平衡透析法测定血浆蛋白结合率,建立HPLC法测定各成分的血药浓度及游离药物浓度,生物样本用乙酸乙酯溶液提取的方法.结果 在低、中、高3种浓度下,原花青素B2和表儿茶素在人体外血浆中的蛋白结合率分别为(44.21±2.80)%,(52.60±1.92)%,(48.11±3.09)%和(47.12±2.85)%,(55.03±2.47)%,(43.69±1.53)%.结论 采用HPLC法对原花青素B2、表儿茶素进行分离,方法简便、可靠、稳定.体外实验中原花青素B2和表儿茶素与人血浆属中等结合型药物,且蛋白结合率随着药物浓度的增加无明显的浓度依赖性.
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金荞麦多酚类成分在大鼠胃肠道中转化的初步研究
目的:研究金荞麦多酚类成分在大鼠胃肠道的生物转化情况. 方法:通过胃肠道体外转化实验,采用HPLC法测定低、中、高浓度金荞麦多酚溶液中原花青素B2和表儿茶素的含量.结果:原花青素B2和表儿茶素在胃中含量明显降低.低浓度溶液中原花青素B2在十二指肠中含量降低,低、中、高浓度溶液中原花青素B2在空肠中含量变化不明显,在结肠和回肠中含量增加,结肠更明显(P<0.01). 在肠道中,低浓度溶液中表儿茶素含量低,且随着金荞麦多酚溶液浓度的增加有升高的趋势,同浓度溶液中表儿茶素含量在各肠段含量有升高的趋势. 结论:金荞麦多酚类成分在大鼠胃肠道中的生物转化存在两种途径:一是金荞麦中所含的(-)-表儿茶素多聚体分解生成二聚体原花青素B2,使原花青素B2含量增加,另一条途径是原花青素B2和表儿茶素在胃肠道中发生降解使其含量降低. 胃中的pH值、酶可能会促进原花青素B2和表儿茶素的降解,结肠是生成原花青素B2的主要部位.
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HPLC法测定玫瑰花中原花青素B2的含量
目的:测定不同来源玫瑰花中原花青素B2的含量.方法:色谱柱:Phenomenex Luna(250 mm×4.6 mm,5 μm) C18柱;柱温:30 ℃;流速:1 ml·min-1;检测波长:280 nm.流动相条件:梯度洗脱:A:2%冰醋酸,B:甲醇;0～15 min,8%～10%B;15～40 min,10%B;40～45 min,10%～20%B.结果:原花青素B2在51.4～154.2 μg·ml-1范围内线性关系良好.回收率为98.35%(n=5).结论:该方法简便、准确、重复性好,可用于测定玫瑰花原花青素B2的含量.
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藏药黑果枸杞中总花色苷与原花青素B2的含量测定
目的 测定藏药黑果枸杞中总花色苷与原花青素B2的含量.方法 采用紫外-可见分光光度法测定总花色苷的含量.原花青素B2的含量测定采用RP-HPLC法,色谱柱Diamonsil C18(250mm×4.6mm,5μm),流动相为2％冰醋酸溶液-乙腈,梯度洗脱;流速为1 ml/min;检测波长为280 nm.结果 原花青素B2在1～ 50 μg/ml范围内线性关系良好,线性相关系数0.9980.平均回收率为98.43％、总花色苷和原花青素B2的含量分别为0.639 g/100 g和0.141 g/100 g.结论 建立的方法快速可靠,重复性好,可用于藏药黑果枸杞中总花色苷与原花青素B2的含量测定.
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原花青素对人表皮细胞株HaCaT增殖功能的影响
目的:研究原花青素B2对人表皮细胞株HaCaT增殖功能的影响.方法:常规培养HaCaT细胞,将细胞分为对照,6.25、12.5、25、50、100 μmol/L原花青素B2处理组及阳性对照rhEGF处理组,采用MTT法检测各组细胞在24 h和48 h增殖水平.然后将细胞分为对照组,25、50 μmol/L原花青素B2处理组和阳性对照rhEGF处理组,采用细胞划痕实验检测细胞各组细胞划痕愈合率.结果:培养24 h和48 h后,12.5、25、50、100 μmol/L细胞相对增殖率均明显高于对照组(P＜0.05),且具有一定的浓度依赖性.6.25 μmol/L原花青素B2处理组与对照组无明显差异.培养24 h后,25、50 μmol/L原花青素B2组划痕愈合率分别为41.7％、40.2％,显著高于对照组的28.1％(P＜0.05).培养48 h后,各实验组划痕愈合率均为100％,显著高于对照组78.9％(P＜0.05),但两实验组之间并无明显差异.结论:原花青素B2能够促进HaCaT细胞增殖和细胞划痕损伤后愈合,有望成为治疗和预防皮肤老化和创伤的有效药物.
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高效液相色谱法同时测定金荞麦中4种指标成分含量
目的 建立同时测定金荞麦中儿茶素、原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的HPLC方法.方法 采用TSK ODS-100V色谱柱(5μm,4.6 mm×250 mm)进行分离;流动相为乙腈-0.2％ 磷酸水溶液,流速为0.8 mL·min-1,梯度洗脱;检测波长280 nm;柱温为35℃;进样量为10μL.结果儿茶素、原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的质量浓度分别在15.55～194.40μg·mL-1(r=0.9998)、15.36～192.00μg·mL-1(r=0.9996)、15.95～199.40μg·mL-1(r=0.9997)和15.50～193.80μg·mL-1(r=0.9992)与峰面积呈现良好的线性关系,平均加样回收率分别为98.6％(RSD=1.4％)、98.3％(RSD=1.4％)、98.6％(RSD=1.2％)和97.0％(RSD=1.5％).结论 该方法简便快速,测定结果准确可靠,可用于金荞麦药材的质量控制.
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HPLC同时测定花生衣中4种成分含量的方法研究
目的:建立花生衣中儿茶素、原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯的含量测定方法.方法:采用KromasilC18色谱柱(250×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈-0.3％磷酸梯度洗脱;流速:0.7 mL/min;柱温:30℃;进样量:10 μL;检测波长278 nm.结果:儿茶素、原花青素B2、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯分别在0.155～1.162 μg、0.156～1.168 μg、0.161～1.204μg和0.151～1.128 μg范围内线性关系良好,回归方程分别为Y=5.367×105X+1.231 ×104,r=0.999 7;Y=5.639×105X+1.475×104,r=0.999 5;Y=6.151 ×105X+4.007× 103,r=0.999 6;Y=4.874×105X+3.277×104,r=0.999 6.平均加样回收率分别为98.3％ (RSD=1.2％)、97.6％(RSD=1.7％)、98.0％ (RSD=1.0％)和98.2％ (RSD=1.3％).结论:本研究建立的方法简便、高效、快速、准确性高、重复性好,可用于花生衣的质量控制.
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原花青素单一活性成分 B2对高糖作用下人内皮祖细胞的保护作用
目的：研究原花青素单一活性成分B2（PC－B2）对高糖环境下人内皮祖细胞（EPCs）的保护作用及其作用机制。方法：从健康人外周血中分离诱导培养人EPCs，并进行鉴定。将EPCs分为control组（ PBS处理）、高渗对照组（25 mmol／L甘露醇处理）、高浓度30 mmol／L葡萄糖作用组以及不同浓度（2、10和50 mg／L） PC－B2与30 mmol／L葡萄糖共处理组。使用CCK－8法检测各组中EPCs 活力的变化；同时检测各组EPCs 中乳酸脱氢酶（ LDH）、丙二醛（ MDA）、超氧化物歧化酶（ SOD）和还原型谷胱甘肽（ GSH）水平；ELISA方法检测各组EPCs上清中一氧化氮（NO）、内皮素－1（ET－1）、细胞间黏附分子－1（ICAM－1）和血管细胞黏附分子－1（VCAM－1）的含量变化；流式细胞术检测各组中EPCs活性氧簇（ ROS）生成和凋亡率变化；Western blot检测血管内皮生长因子（ VEGF）和血管内皮生长因子受体－2（ VEGFR－2）的表达情况。结果：与control组相比，高糖作用组中人EPCs的活力显著下降（ P＜0．05）；LDH漏出量以及MDA、ET－1、ICAM－1和VCAM－1含量均显著升高（P＜0．05）；而SOD和GSH活性以及NO含量显著降低（ P＜0．05）；细胞中ROS含量和凋亡率显著上升（ P＜0．05）；EPCs中VEGF和VEGFR－2表达量显著降低（P＜0．05）。与高糖作用组相比，不同浓度PC－B2作用组EPCs活力均明显回升（P＜0．05）；LDH漏出量以及MDA、ET－1、ICAM－1和VCAM－1含量均逐渐下降（ P＜0．05）；SOD和GSH活性以及NO含量均显著上升（ P＜0．05）；细胞中ROS生成和凋亡率逐渐下降（ P＜0．05）；而EPCs中VEGF和VEGFR－2表达量也随之逐渐上升，并具有浓度依赖性（ P＜0．05）。结论： PC－B2能够提升高糖作用下人EPCs活力，减少高糖引起的氧化损伤，恢复EPCs正常功能，降低高糖诱导的炎症因子和细胞凋亡，从而对人EPCs发挥保护作用，并可通过诱导VEGFR－2和VEGF表达发挥作用。
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原花青素B2及黄曲霉毒素B1对人胚胎肝细胞细胞色素P450亚酶1A2、3A4活力及基因表达的影响
目的 探讨原花青素B2(PC-B2)与黄曲霉毒素B1(AFB1)对人胚胎肝细胞L-02细胞色素P450 (CYP)亚酶1A2、3A4活力及其基因表达的影响.方法 L-02细胞体外培养后分空白对照、溶剂对照、AFB1染毒、PC-B2处理和PC-B2干预共5组,其中PC-B2处理分为3个亚组,分别采用3、10、30 μg/ml PC-B2干预,PC-B2干预分为3各亚组,分别采用3、10、30 μg/ml PC-B2预处理12 h后,再加不同浓度PC-B2与AFB1干预24 h.测定各组细胞的CYP1 A2、CYP3A4酶活力以及CYP1 A2、CYP3A4基因的mRNA表达水平;测定细胞存活率,倒置荧光显微镜观察细胞形态.结果 与空白对照组相比,AFB1染毒组细胞存活率降低(P＜0.05),胞膜结构不清,漂浮细胞增多,CYP1 A2、CYP3A4酶活力及其mRNA表达水平明显升高(P＜0.05).与空白对照组相比,3、10μg/ml PC-B2处理组细胞相关指标无明显变化,但30 μg/ml PC-B2处理组的细胞存活率升高,CYP1A2、CYP3A4酶活力下降(P＜0.05).与AFB1染毒比较,30 μg/ml PC-B2干预组的细胞存活率升高(P＜0.05),各浓度PC-B2干预组的细胞CYP1A2、CYP3A4酶活力及基因表达均降低(P＜0.05),且干预浓度越高,CYP1A2、CYP3A4酶活力及基因表达越低(P＜0.05).结论 AFB1能明显诱导肝细胞CYP1A2、CYP3A4酶活力及其mRNA表达,促使肝细胞凋亡,PC-B2干预可促进肝细胞生长并抑制上述CYP二个亚酶的活力及其基因表达,提示PC-B2可能通过抑制Ⅰ相代谢酶CYP对AFB1的活化而对肝细胞有良好保护作用.
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原花青素B2保护血管内皮细胞延缓凋亡及机制研究
目的 以H2O2诱导人内皮细胞凋亡为模型,观察原花青素B2 (GSPB2)延缓人内皮细胞凋亡的保护作用及其机制.方法 用0.5 mmol H2O2预处理细胞,分别加入不同浓度的GSPB2(5.0、10.0、20.0 μmol/L)保护细胞,TUNEL法检测细胞凋亡;Western blotting检测凋亡相关分子Caspase-3、Bax、Bcl-2以及影响凋亡的相关分子PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表达;Transwell小室检测各组细胞迁移情况.结果 0.5 mmol H2O2致人内皮细胞凋亡明显增加(P＜0.01),GSPB2能明显减轻H2O2所致的人内皮细胞凋亡(P＜0.05),10 μmol/mL的GSPB2就能接近恢复到H2O2未处理的对照组水平.进一步研究发现:Caspase-3、bax蛋白表达上调,Bcl-2表达下调;PI3K、p-Akt、Akt表达上调.结论 不同浓度的GSPB2对H2O2诱导的血管内皮细胞具有保护作用,而且表现为浓度依赖性和时间依赖性,其机制与相关分子PI3K、p-Akt、Akt有关.
