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大鼠生后中枢神经系统S100B和胶质纤维酸性蛋白表达的变化
目的 探讨SD大鼠生后中枢神经系统发育过程中S100B和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化.方法 24只雄性SD大鼠分为生后7d、14d、21d和成年4组,用免疫组织化学方法对脑、脊髓切片进行S100B、GFAP抗体染色,观察不同时间点不同部位中两种阳性细胞平均数.结果 生后7d到成年,前额皮质、海马、纹状体、黑质和脊髓S100B阳性标记的密度和数量逐渐减少,生后2～3周时渐趋于稳定;脑内GFAP阳性星形胶质细胞(AST)随年龄增大逐渐增多,突起增粗增长,生后21d GFAP阳性细胞数量已接近成年;相反,脊髓GFAP阳性标记数则随年龄增长呈现由多到少的趋势;海马CAl区生后各年龄段GFAP和S100B免疫荧光双标显示,生后1周至成年S100B阳性细胞的数量明显减少,尤以分子层明显;随年龄增长,双标阳性细胞的比例逐渐增高,多集中分布于锥体细胞层和多形层.结论 大鼠中枢神经系统中S100B和GFAP两种星形胶质细胞蛋白存在不同的表达模式;同时S100B和GFAP蛋白的表达在发育过程中可能受不同机制的调节,并可能代表星形胶质细胞的不同亚型.
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反义GFAP逆转录病毒表达载体的构建及其对反应性星形胶质细胞的作用
目的构建反义GFAP逆转录病毒表达载体,评价其对培养正常及损伤星形胶质细胞(Ast)形态及GFAP基因表达的影响. 方法用定向克隆技术,将1.1kb的GFAP基因片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN上,获得重组体PLBskG,经病毒包装、抗性克隆筛选、滴度测定等,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩展培养,收获病毒上清液感染体外培养的Ast,通过免疫组织化学、原位杂交、RT-PCR、Southern blot和流式细胞仪分析等方法,研究PLBskG对正常及损伤Ast的生长、细胞增殖周期、细胞形态结构、GFAP基因表达的影响. 结果插入PLBskG中的GFAPcDNA片段序列、方向完全正确,Southern杂交及RT-PCR分析表明,PLBskG成功整合入PA317细胞中,并实现了在NIH3T3细胞中的表达.PLBskG使正常及反应性Ast生长抑制,G1期阻滞,Ast胞体变圆、胞浆减少、突起变细、回缩,核浆比例增大.GFAP免疫组织化学染色减弱;GFAP mRNA表达水平降低. 结论获得了构建正确的反义GFAP逆转录病毒表达载体,并证实其对正常及反应性Ast形态结构、GFAP表达水平等均有明显的影响,为深入研究Ast反应及GFAP基因的功能创造了条件.
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激活的星形胶质细胞分泌的TNF-α对大鼠离子型谷氨酸受体1表达的影响
目的探讨星形胶质细胞在癫痫发病中的作用.方法选用肿瘤坏死因子TNF-α(TNF-α)刺激及TNF-α反义寡核苷酸阻断后马桑内酯(CL)刺激纯化培养的海马星形胶质细胞,将这两种条件培养基提取液(ACM)10μl分别注入正常大鼠侧脑室,观察动物行为与脑电图的变化;用免疫细胞化学方法检测大脑皮质与海马中离子型谷氨酸受体(NMDAR1)表达水平的改变,并做显微图像分析.结果 1.侧脑室注射肿瘤坏死因子TNF-α刺激后的条件培养基提取液可引起大鼠Ⅲ级癫痫样发作及典型的尖波、棘波、棘-慢波癫痫样脑电图表现,大脑前梨状皮质和海马CA1区NMDAR1免疫反应阳性神经元数和平均光密度值均明显高于对照组;2.侧脑室注射TNF-α反义寡核苷酸阻断后由马桑内酯刺激的条件培养基提取液,大鼠无癫痫样行为发生,大脑前梨状皮质和海马CA1区NMDAR1免疫反应阳性神经元数和平均光密度值与对照组无显著性差异.结论 1.激活的星形胶质细胞分泌的TNF-α可诱导大鼠癫痫发作.2.NMDAR1表达的变化可能与癫痫发作有关.
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睫状神经营养因子对体外培养的星形胶质细胞细胞周期及Fos蛋白表达的影响
目的研究睫状神经营养因子(CNTF)对体外培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞(Ast)细胞周期及Fos蛋白表达的影响.方法通过体外纯化培养获取大鼠大脑皮质Ast,将CNTF加入培养液,作用相应的时刻点后,应用流式细胞仪测定细胞周期的变化,采用免疫细胞化学方法研究Fos蛋白的表达.结果CNTF作用Ast 6h后,可显著促进细胞周期进程,表现为G0/G1期细胞百分比降低;S期+G2/M期细胞百分比(增殖指数,poliferation index,PI值)升高.12h促增殖作用达高峰,24 h、48 h有所恢复,但PI仍明显高于对照组.CNTF作用于Ast 2 h后即可引起Fos蛋白的显著表达,并持续至24 h,而糖皮质激素预处理可明显抑制Fos蛋白表达.结论CNTF可促进Ast增殖及Fos蛋白表达.
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人脐血干细胞定向分化为多巴胺能神经元的实验研究
目的 探讨人脐血干细胞定向分化为多巴胺(DA)能神经元的佳诱导条件.方法 体外分离、原代培养人脐血干细胞,流式细胞仪检测其表面标志,分别以EGF+bFGF、ATRA、ATRA+EGF+bFGF、纹状体条件培养液、纹状体星形胶质细胞条件培养液对其进行诱导,倒置相差显微镜观察细胞形态的变化.应用免疫荧光染色技术检测DA能神经元标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 比较各组对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用,纹状体星形胶质细胞条件培养液＞纹状体条件培养液＞ATRA+EGF+bFGF组＞ATRA组＞EGF+bFGF组＞对照组.结论 纹状体组织对人脐血干细胞定向分化为DA能神经元的诱导作用优于其他各组,并且此作用可能主要源于纹状体的星形胶质细胞.
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渗透压变化对缝隙连接蛋白在培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞和神经元表达的影响
目的观察渗透压改变对培养的下丘脑星形胶质细胞的缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)和神经元的缝隙连接蛋白Cx32表达的影响.方法体外培养孕14 d或新生1d SD大鼠下丘脑的神经元和星形胶质细胞并进行纯化和鉴定.实验各分两组,第1组:细胞由等渗培养液移至高渗培养液(含9% NaCl)分别放置1min、3min、5min、10min和15min后将液体吸出常规固定;第2组:细胞先置于高渗培养液中15min后换成等渗培养液,分别在1min、3min、5min和10min后将等渗培养液吸出常规固定.两者均进行抗Cx43或抗Cx32的免疫荧光染色,Confocal显微镜观察.结果第1组,Cx43在刺激1min后在星形胶质细胞表达比对照组有所增加,3 min达到高峰,以后逐渐降低,15 min恢复正常;而Cx32在刺激后1min的神经元中表达比对照组增加,5 min达到高峰,以后降低,15min恢复正常.第2组同样为Cx43在星形胶质细胞刺激1min后表达增加,3 min达到高峰,以后降低,10 min恢复正常;神经元的Cx32表达在刺激后5 min达到高峰,以后降低,10 min恢复正常.两组Cx43表达的高峰期均早于Cx32.结论Cx43和Cx32可能参与星形胶质细胞与神经元渗透压的调节.
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强力霉素诱导表达脑啡肽细胞株的构建及其对慢性神经痛大鼠的镇痛作用
目的 构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株,并评价鞘内移植该细胞对慢性坐骨神经压榨性损伤(CCI)大鼠的镇痛效应.方法 应用逆转录病毒转染法,建立受强力霉素调控表达人前脑啡肽原基因(hPPE)的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/Tet-On/hPPE),实时定量PCR及放射免疫分析法检测强力霉素对该细胞株脑啡肽表达的定量调节.将IAST/Tet-On/hPPE细胞植入CCI大鼠蛛网膜下腔,观察腹腔注射强力霉素对其镇痛效应的影响及免疫组织化学检测脊髓背角Fos蛋白的表达.结果 实时定量PCR及放射免疫分析结果显示,强力霉素可定量调控IAST/Tet-On/hPPE细胞株中脑啡肽的表达;IAST/Tet-On/hPPE植入CCI大鼠的蛛网膜下腔后,大鼠机械缩爪阈值升高(P＜0.05),脊髓背角浅层Fos蛋白表达明显降低(P＜0.05),且该镇痛效应受强力霉素调控.结论 成功构建了可调控的定量表达脑啡肽的永生化星形胶质细胞株,其有望成为慢性疼痛治疗的新方法.
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大鼠腰髓背角星形胶质细胞及神经元对一侧胫、腓骨骨折的反应及其相互关系
目的研究大鼠脊髓内星形胶质细胞及神经元对一侧胫、腓骨骨折的反应及相互关系. 方法应用细胞免疫组织化学方法,观察脊髓内胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、Fos蛋白双标记以及蛋白激酶C(PKC)在左侧胫、腓骨骨折后不同时程的表达变化. 结果 1.左侧胫、腓骨骨折后,GFAP阳性反应产物主要分布于同侧腰髓背角的星形胶质细胞胞浆,Fos阳性产物在其胞核也有表达,且以浅层为主,神经元的胞核也有Fos阳性产物;2. Fos-LI神经元与GFAP/Fos-LI星形胶质细胞的分布基本一致,两者关系密切;3. GFAP/Fos-LI星形胶质细胞表达高峰期在骨折后45min,而Fos-LI神经元的表达高峰期在骨折后90min;PKC-LI星形胶质细胞出现及达到高峰的时间比PKC-LI神经元要早. 结论腰髓背角的星形胶质细胞参与了下肢骨折伤害性刺激的应激反应及调节过程,而且Fos-LI、PKC-LI的表达早于神经元,可能主动地影响神经元的活动.
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纤维蛋白支架促进神经干细胞向神经元分化并抑制星形胶质细胞增生
目的 探讨纤维蛋白支架对神经干细胞和星形胶质细胞分化及增殖的影响.方法 分别培养胚胎大鼠脊髓来源的神经干细胞和新生鼠脊髓神经胶质细胞,接种于纤维蛋白支架上,同时用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照.于体外培养不同时间后,用神经丝蛋白(NF200)对神经细胞进行免疫荧光染色,测量各复孔(n=4)内NF阳性细胞的突起长度,计算其平均值;用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对胶质细胞进行染色,各复孔(n=4)内统计5个不同视野的胶质细胞总数和GFAP阳性细胞数,计算GFAP阳性细胞相对数量的平均值.比较在纤维蛋白支架和玻片上神经干细胞分化、神经纤维延伸及神经胶质细胞增殖的差异.同时用免疫印迹技术对荧光染色结果进行验证.上述实验各重复3次.结果 纤维蛋白支架组的NF阳性纤维明显长于对照组,GFAP阳性星形胶质细胞相对数量明显少于对照组,GFAP的表达水平明显低于对照组.结论 纤维蛋白支架可促进神经干细胞向神经细胞分化,并有利于神经纤维的延伸而抑制星形胶质细胞的增殖和成熟.
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马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液及CNQX对正常大鼠脑内及培养的神经元内NSF的影响
目的 揭示星形胶质细胞对神经元内N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白(NSF)和AMPA受体的影响及其在癫痫发病中的作用.方法 将马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液(ACM)注入正常SD大鼠侧脑室,观察其行为变化;运用免疫组织化学方法观察其大脑皮质、海马内NSF免疫反应的变化;将培养的神经元随机分为对照组、ACM组及CNQX+ACM组,免疫细胞化学方法观察NSF表达的变化,Western blotting法检测NSF含量的变化.结果 ACM组大鼠在注射后30min出现癫痫行为.免疫组织化学染色结果显示:1.ACM作用后2h及4h,大鼠大脑皮质及海马内NSF免疫反应阳性神经元数和平均吸光度明显降低(P<0.05);2.培养的神经元的免疫细胞化学染色结果显示,ACM组在作用4h及8h时,NSF免疫阳性反应产物与对照组比较明显减少(P<0.05).Western blotting法检测NSF含量,在ACM作用4h及8h时较对照组及CNQX+ACM组明显减少(P<0.05).结论 ACM可下调神经元内NSF的表达,并导致动物痫性发作,而运用AMPA受体拮抗剂CNQX则能阻断其下调作用,提示ACM对NSF的下调作用可能与AMPA受体有关.
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星形胶质细胞条件培养基对培养海马神经元GluR2和PICK1 mRNA表达的调控
目的 探讨癫痫发病过程中,星形胶质细胞对神经元AMPA受体亚单位表达的调节机制.方法 收集谷氨酸刺激的星形胶质细胞条件培养基,作用于培养的海马神经元,用RT-PCR方法检测神经元GluR2和PICK1 mRNA表达的变化.结果 在星形胶质细胞条件培养基作用2h、8h、12h后,培养的海马神经元GluR2mRNA表达明显下降,而PICK1 mRNA表达则升高,与对照组相比,差异有显著意义(P＜0.05).离子型谷氨酸受体拮抗剂D-AP5和CNQX不能完全阻断条件培养基的作用.结论 在癫痫发病过程中,星形胶质细胞激活能通过上调PICK1的表达,实现下调神经元AMPA受体GluR2亚单位的表达.
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抗CD81抗体对星形胶质细胞增殖的抑制作用
目的 研究抗CD81抗体在星形胶质细胞增殖中的作用.方法 将纯化的星形胶质细胞分为6组,加入不同浓度抗CD81抗体,其浓度依次为0、0.1mg/L、0.5mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L,以四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性.在此检测结果的基础上,选出3个有意义的浓度组,加入浓度分别为0、0.5mg/L、5mg/L的抗CD81抗体,采用流式细胞术观察抗CD81抗体对星形胶质细胞周期的影响并进行统计学分析.结果 抗CD81抗体对星形胶质细胞的增殖有抑制作用,并呈一定的剂量依赖性.加入抗CD81抗体培养24 h后,实验组的星形胶质细胞处于G0/G1期的细胞指数减少,S期细胞指数增多.结论 抗CD81抗体抑制了星形胶质细胞的增殖,使星形胶质细胞的细胞周期受阻,阻滞于S期.
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妊娠中晚期暴露于可卡因对后代脑发育影响的形态学观察
目的建立妊娠中晚期接触可卡因的小鼠动物模型,研究可卡因对后代脑发育是否具有持续影响.方法称量实验组与对照组仔鼠在P10的体重与脑重;分别采用甲苯胺蓝染色和免疫组织化学方法,观察各组仔鼠大脑皮质神经元和胼胝体与海马神经胶质细胞的发育情况.结果可卡因处理组的仔鼠P10体重与脑重比对照组明显降低;神经元极性紊乱、各皮层结构不清,神经元发育不良;GFAP免疫组织化学染色显示胼胝体区与海马区星形胶质细胞含量降低.结论妊娠中晚期暴露于可卡因对后代脑的发育具有长期影响,引起形态学的持续改变,这种影响可能在后代表现出的神经行为异常发病机制中扮演着重要角色.
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细菌脂多糖对培养星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C底物表达的影响
目的 研究细菌脂多糖(LPS)对培养的大鼠星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS)表达的影响.方法 培养的星形胶质细胞随机分为空白对照组、LPS单一刺激组、LPS联合PKC抑制剂(RO-31-8220)刺激组.运用荧光定量PCR(Real time RT-PCR)、免疫印迹和免疫细胞化学法分析SSeCKS的表达变化和亚细胞定位.结果 Real time RT-PCR显示,LPS可以上调SSeCKS mRNA水平,在作用浓度为100 μg/L和1 mg/L时与对照组有显著差异(P＜0.01).Western blotting表明,当LPS作用浓度为100 μg/L时,SSeCKS蛋白表达量明显上调;在此浓度作用下,SSeCKS表达于6 h达高峰并广泛磷酸化,至24 h其蛋白表达仍维持于较高水平.免疫细胞化学分析显示,正常情况下,SSeCKS散在分布于胞质,于胞膜略有浓集.在LPS单一刺激组,SSeCKS富集于核周;当LPS联合RO-31-8220共同作用时,SSeCKS的亚细胞定位与正常组无明显差异.结论 在体外培养的星形胶质细胞中,LPS可诱导SSeCKS表达,上调其磷酸化水平,影响其细胞内定位.这些改变与PKC的功能相关.提示SSeCKS可能参与星形胶质细胞中炎症信号的转导.
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不同温度热应激时大鼠下丘脑内胶质原纤维酸性蛋白的表达变化
目的 探讨不同温度下,大鼠下丘脑内胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况.方法 将成年SD大鼠40只置于24℃、34℃、38.5℃、42℃(10只/每组温度),相对湿度为60%的实验仓内,60min后取出,常规方法灌流固定取脑,下丘脑恒冷箱制片(30μm),应用抗GFAP免疫组织化学标记法和抗GFAP与Fos双重免疫组织化学标记方法,观察大鼠急性热应激后,星形胶质细胞在下丘脑内的形态、分布和数量的变化.结果 24℃时,下丘脑内GFAP阳性细胞较少;34℃时,GFAP在下丘脑内各个核团(下丘脑前区、室旁核、弓状核、视交叉上核和视上核)表达增加,38.5℃时,GFAP表达明显增加,达到峰值;42℃时又降低,并且出现了Fos阳性的星形胶质细胞.结论 星形胶质细胞参与了热应激的病理生理过程.
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局灶性脑梗死引起谷氨酸转运体在星形胶质细胞的表达
目的探讨急性局灶性脑梗死可塑性变化的星形胶质细胞在脑缺血损伤中的作用.方法免疫组织化学和免疫荧光双标记技术.结果胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性星形胶质细胞在脑梗塞灶的周围发生肥大和增生性可塑改变,其突起的变化尤为显著.粗大的突起呈纤维状,并相互交织呈密集的网,其末端向脑梗塞灶的中央延伸.在缺血周边的半影区可见谷氨酸转运体(EAAT1)阳性表达,呈斑点和纤维状;共聚焦扫描显微镜下可见EAAT1与GFAP双标记的星形胶质细胞.结论急性局灶性脑梗死后发生可塑性变化的星形胶质细胞通过增强EAAT1的功能参与脑梗死的修复过程.
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大鼠腰骶髓和延髓星形胶质细胞及神经元对慢性结肠炎的反应
目的探讨大鼠腰骶髓和延髓星形胶质细胞及神经元对慢性结肠炎的反应,及反应性星形胶质细胞和反应性神经元之间的关系.方法成年雄性SD大鼠,实验组(n=17)给予三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠诱导结肠炎;对照组(n=16)给予生理盐水灌肠.免疫组织化学法显示大鼠腰骶髓和延髓内胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性星形胶质细胞和Fos阳性神经元.结果TNBS灌肠后,GFAP阳性星形胶质细胞主要分布在脊髓背角浅层(Ⅰ～Ⅱ层)、中间外侧核(Ⅴ层)、后连合核(Ⅹ层)和腹角外侧核(Ⅸ层).Fos阳性神经元集中分布在背角深层(Ⅲ～Ⅳ,Ⅴ～Ⅵ层).在延髓,两者均主要分布在由孤束核、中间网状带和腹外侧区组成的延髓内脏带(MVZ).TNBS灌肠后3、7、14 d,脊髓中GFAP阳性细胞密度明显高于对照组(P＜0.05).TNBS灌肠后3 d,延髓中GFAP阳性细胞密度明显高于对照组(P＜0.05).TNBS灌肠后28 d,脊髓和延髓中GFAP阳性细胞密度下降,与对照组无显著性差异(P＞0.05).结论结肠炎性刺激引起脊髓和延髓中星形胶质细胞激活.随着结肠炎的恢复,星形胶质细胞的反应性下降.在延髓内脏带,反应性星形胶质细胞与反应性神经元关系密切.
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脂多糖对大鼠中脑和桥脑内Fos、GFAP、OX42表达的影响
目的探讨单次腹腔注射脂多糖(LPS),中脑和桥脑神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的可塑性变化.方法抗Fos蛋白、抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、抗特异性标记小胶质细胞(OX42)和抗Fos/GFAP双重免疫组织化学标记法.结果 Fos阳性神经元分布于上丘、中脑导水管周围灰质、臂旁核和蓝斑.Fos蛋白在注射后30min表达,1～3h为高峰.GFAP阳性星形胶质细胞胞体变大,突起增粗,细胞密度增加,30min出现表达,1h为高峰,3h后减少.0X42阳性小胶质细胞首先于脑室周围灰质表达,注射后6h达到高峰,胞体变大,全脑分布.相应于Fos阳性神经元分布区域,GFAP阳性星形胶质细胞和OX42阳性小胶质细胞深染和密集.结论上丘、臂旁核、蓝斑内神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞可能参与神经免疫调节,臂旁核可能为此调节通路的中继站之一.
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静脉麻醉药对脂多糖诱导的神经星形胶质细胞增殖的影响及其机制
目的 检测静脉麻醉药对脂多糖诱导的神经星形胶质细胞的影响及其机制.方法 利用MTT实验、集落形成实验和Annexin V-FITC/PI双染色法检测静脉麻醉药对脂多糖作用后的神经星形胶质细胞增殖和凋亡的影响.Western blotting技术检测相关机制.结果 静脉麻醉药可以逆转脂多糖诱导的神经星形胶质细胞增殖.经麻醉药处理后的神经星形胶质细胞p-Akt和p-mTOR蛋白表达下降,Caspase-3和Caspase-9表达水平升高.结论 静脉麻醉药可以通过抑制mTOR通路逆转脂多糖诱导的神经星形胶质细胞增殖.
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改良的体外中枢神经系统损伤后胶质瘢痕模型的建立
目的 建立胶质疤痕体外模型,观察其形态及细胞外基质的表达情况.方法 体外分别培养来自大脑皮层的星形胶质细胞和脑膜成纤维细胞,经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和纤连蛋白(FN)抗体免疫细胞化学染色鉴定后,将两种细胞混合共培养,2d后添加转化生长因子-β1(TGF-β1),以未添加TGF-β1为对照组;GFAP和FN免疫细胞化学染色观察胶质疤痕的形态;免疫细胞化学染色和Western blotting观察促红素肝细胞受体B2(EphB2) 、Eph受体作用配体B2(ephrinB2)、神经蛋白聚糖(neurocan)和神经抗原2(NG2)表达情况.结果 疤痕样细胞团簇结构主要是由星形胶质细胞和成纤维细胞共同组成;实验组EphB2、ephrinB2和neurocan、NG2表达量较对照组明显增加(P＜0.05).结论 体外混合培养星形胶质细胞与成纤维细胞并添加TGF-β1后成功建立体外中枢神经系统损伤后疤痕模型.
