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基因组不稳定性及其相关检测在肿瘤诊疗中的应用进展
肿瘤发生的过程是一个多基因参与的、逐渐演变的过程。基因组的不稳定是肿瘤细胞的重要功能特征之一，在肿瘤发生发展中发挥了重要作用。后基因组时代里，随着对基因组不稳定性的认识日益深入，其与肿瘤发生之间的关系愈发受到重视。目前认为，当肿瘤发生时，细胞基因组不稳定性与端粒损伤、基因修饰及DNA损伤修复受损等密切相关。本文着重阐述影响基因组不稳定的主要因素、常用的检测基因组不稳定的技术方法以及其临床诊疗中的应用等。（中华检验医学杂志，2016，39：311－314）
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一组端粒相关蛋白分子的克隆
目的:进一步了解端粒酶的生物学功能及其在永生化或肿瘤细胞中作用的分子机制,筛选新的端粒相关蛋白分子.方法:基于酵母双杂交技术原理,采用DNA重组技术构建诱饵融合蛋白表达载体,筛选cDNA文库,β-半乳糖苷酶滤膜影印分析确证阳性克隆,对阳性克隆质粒测序并在GenBank进行cDNA序列同源性比较.结果: AH109、Y187酵母菌基因表型稳定,无His渗漏表达.成功构建端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT,其表达的融合蛋白对AH109酵母细胞生长无毒性且不具有激活自身报告基因(LacZ)的作用.从cDNA文库中筛选到Ade+、Leu+、Trp+和His+阳性克隆28个,β-半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析筛选到Ade+、His+和LacZ+阳性克隆12个,其中有5个文库质粒具有自身激活报告基因的作用,予以弃除.7个阳性克隆质粒测序发现有2个为重复序列,cDNA序列同源性比较终获得6个已收录人cDNA序列,他们分别为T-STAR、PAWR、I-1、SMARCB1、LOXL3和HKR3.结论:获取新的端粒相关蛋白可了解端粒酶全酶的结构及其在肿瘤、细胞永生化的生物学功能及分子机制,为肿瘤、衰老的发生及防治奠定重要的理论基础.
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端粒酶与大肠癌
自1989年Morin[1 ]首次在人的癌细胞中发现端粒酶以来,肿瘤细胞永生化的"端粒-端粒酶"假说已为越来越多的研究结果所证实.同时,在研究过程中,人们发现大肠癌的发生发展、诊断和治疗等各环节都与端粒酶有关.
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端粒长度测量方法的研究进展
近年来研究表明端粒的长短同癌症的发生有密切联系,各国学者报道了大量与端粒相关的研究.端粒长短测量法则成为研究端粒的重要手段.本文总结了多种端粒测量方法,对相关疾病研究有一定指导意义.
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紫杉醇体外诱导人胃癌细胞凋亡及对端粒酶活性的影响
目的研究紫杉醇诱导人胃癌细胞凋亡及端粒酶活性变化.方法采用0.001～1 μmol·L-1的紫杉醇处理SGC 7901细胞后,用MTT法测定胃癌细胞的生长抑制率,通过形态学观察及流式细胞术检测细胞凋亡率,半定量TRAP-银染法测定端粒酶活性变化.结果不同浓度的紫杉醇对胃癌细胞均有明显抑制作用,且呈时间依赖性及剂量依赖性.光镜及流式细胞术分析表明,0.01μmol·L-1的紫杉醇处理后24 h,细胞即出现明显的凋亡形态特征及凋亡峰,对端粒酶活性的同步检测结果显示,紫杉醇在诱导细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调,且随紫杉醇浓度增大,抑制作用逐渐增强,12 h相对端粒酶活性为96,24 h为58,48 h为28,72 h起变为阴性.结论紫杉醇对胃癌细胞具有明显抑制作用,诱导细胞凋亡并抑制端粒酶活性可能是其发挥抗癌作用的机制之一.
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胃癌及癌前病变hTERT的表达与细胞免疫功能
目的观察在胃癌及癌前病变组织中端粒酶催化亚单位hTERT的表达与患者细胞免疫功能,探讨hTERT及细胞免疫功能对胃癌诊断、治疗、预后的临床意义.方法用原位杂交方法对¨6例内镜胃粘膜活检标本的端粒酶催化亚单位hTERT进行检测,包括慢性浅表性胃炎(CSG)30例,慢性萎缩性胃炎(CAG)27例、腺瘤型息肉8例、胃溃疡9例,胃癌(GC)42例,并按肿瘤部位、大体类型、有无淋巴结转移及分化程度分组.同时,用流式细胞技术(FCM)检测了30例慢性浅表性胃炎、27例慢性萎缩性胃炎、42例胃癌的外周血T淋巴细胞亚群及自然杀伤(NK)细胞,并与正常对照(NC)相比较.结果CSG的hTERT阳性率为0%(0/30),癌前病变为36%(13/44),GC为86%(36/42).胃癌组织hTERT阳性率与肿瘤部位、大体类型、有无淋巴结转移及分化程度无显著相关性.CSG组CD3+,CD4+较NC已有明显下降(P＜0.05),CAG组T细胞功能(CD3+,CD4+,CD4+/CD8+)及NK各值较NC及CSG组均明显降低(P＜0.05～0.01),GC组T细胞及NK细胞各值较CAG组显著异常(P＜0.05～0.01),并随着胃癌进展,CD3+,CD4+,CD4+/CD8+各值进一步降低.结论端粒酶活化可能是胃粘膜癌变的关键步骤,胃粘膜活检标本hTERT的表达是胃癌癌变过程中重要的生物学标志物.胃癌和癌前病变患者细胞免疫功能低下,对胃癌的发生发展有重要意义.
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不同病变胃粘膜的端粒长度与细胞内DNA含量
目的分析不同病变胃粘膜细胞内端粒长度的差异,以及细胞内DNA的含量,并探讨端粒行为异常、细胞内DNA含量与胃粘膜癌变的关系.方法对172例内镜活检和45例胃癌手术标本,应用Southern杂交分析细胞内端粒长度,应用流式细胞术测定细胞内DNA含量.结果在172例内镜活检标本中,正常胃粘膜,慢性浅表性胃炎,伴0,1,2度肠化的慢性萎缩性胃炎和胃癌组织的端粒长度分别是10.4Kb±0.2Kb,9.9Kb±0.4Kb,9.8Kb±1.2Kb,8.6Kb±1.0Kb,6.2Kb±1.2Kb,5.9Kb±2.6Kb.在45例胃癌手术标本中结果相似.流式细胞术分析细胞内DNA含量的结果是,在门诊内镜活检标本中,正常胃粘膜,慢性浅表性胃炎,伴0,1,2度肠化的慢性萎缩性胃炎和胃癌组织的异倍体DNA检出率分别为0.00%,0.00%,0.00%,10.00%,12.50%,33.33%.在45例胃癌手术切除标本中结果也相似.而且异倍体细胞内的端粒长度明显短于二倍体细胞内的端粒长度,同时异倍体细胞中的端粒长度与DNA指数呈负相关(r=-0.91,P＜0.01),也就是端粒越短DNA指数越高.结论端粒长度从正常胃粘膜、不同程度肠化胃粘膜到癌变胃粘膜而逐渐缩短.在正常胃粘膜和慢性浅表性胃炎中未检出异倍体DNA,从1度肠化、2度肠化到癌变的胃粘膜异倍体DNA检出率逐渐增高,而且在异倍体细胞中端粒长度和DNA指数呈负相关,推测可能存在端粒愈短DNA扩增愈活跃的情况,端粒缩短伴有DNA指数增加可能是胃癌发生的预兆.
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人胃癌细胞端粒酶RNA组分hTR基因片段的克隆及其正反义真核表达载体的构建
目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础.方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列.将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分(hTR)基因正义真核表达载体(pEF-hTR).随后采用EcoRV和SpeⅠ从pEF-hTR上切下该目的基因片段并反向插入pBluescript Ⅱ KS载体上的EcoRV/SpeⅠ酶切位点上.后采用KpnI和NotⅠ从pBluescript Ⅱ KS载体上切下该目的基因片段并正向插入pEF-hTR的KpnI/NotI酶切位点上从而构建出人端粒酶RNA组分(hTR)基因反义真核表达载体(pEF-ahFR).对所构建的载体均进行酶切鉴定和测序确认.结果所克隆的基因片段其碱基序列与文献报道完全一致,且插入载体的方向完全正确.结论本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因的部分序列并成功构建其正义、反义真核表达载体,从而为研究反义抑制人胃癌细胞端粒酶活性对胃癌细胞生物学行为的影响奠定了基础.
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细针肝穿刺标本检测端粒酶诊断肝癌的意义
目的检测肝癌穿刺活检标本中的端粒酶活性,探讨其在肝癌诊断中的临床意义.方法采用TRAP-ELISA技术检测42例肝脏活检穿刺标本肝细胞中的端粒酶.结果 25例经组织病理学诊断的肝癌标本中,16例细针穿刺阳性标本中14例端粒酶阳性;5例细针穿刺可疑阳性标本中4例端粒酶阳性,4例细针穿刺阴性标本中2例端粒酶阳性,端粒酶阳性率为80%(20/25).两者同时应用可使术前肝癌确诊率由64%(16/25)升至88%(22/25).9例肝硬变病变标本中有3例端粒酶阳性,2例肝血管瘤病变和6例慢性肝炎标本中均为阴性.结论肝癌穿刺活检标本中端粒酶活性明显高于其他良性病变(肝硬变、慢性肝炎、肝血管瘤),配合细胞学检查,可提高肝癌的早期诊断率,并有可能作为肝癌诊断的生物学指标.
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胃癌患者术后端粒长度变化与预后观察
目的分析原发性胃癌组织中的端粒长度变化与患者术后预后的关系.方法以琼脂糖DNA杂交检测58例手术切除的原发性胃癌与邻近胃组织中端粒限制性内切酶片段(TRF)的长度,并观察术后患者的临床状况及生存期.结果发现原发性胃癌组织中的平均TRF长度均比相应邻近胃组织缩短.其中原发性胃癌有14例TRF缩短,5例TRF延长;且在胃癌中TRF的这种异常状态与肿瘤的大小、转移、临床病理分期及患者的生存率相一致.结论 TRF长度不仅参与了胃癌的发生与发展,而且也为胃癌的诊断及预后判断提供了一种新的手段.
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以端粒酶为靶点的天然抗癌药物筛选策略
0 引言肿瘤是一系列基因异常累加的遗传性疾病.人类癌基因的激活是由于基因数量的增加或结构的变化所致[1].随着人类基因组草图的初步完成,接下来的工作重点必然是找出疾病相关基因及利用这些基因提供治疗疾病的新手段.
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hTERT基因启动子区单体型遗传变异对转录活性影响的研究
目的 个体的端粒长度受到遗传和环境因素的共同调控,遗传度为35％～80％.人类端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT是端粒酶活性的限速成分,hTERT基因的序列变异与人类衰老相关的疾病风险密切相关,本研究拟探讨hTERT基因启动子区遗传变异对转录活性影响的功能研究.方法 根据生物信息学预测和文献分析,本研究选择hERT基因启动子区的两个单核苷酸多态性位点rs2735940 (-1327T/C)和rs2853669 (-190T/C),构建含有4种单体型的荧光素酶报告载体,包括野生型T-T,突变型T-Z,C-T,C-C.由于rs2853669位于转录因子Ets2和c-Myc的结合位点,与c-Myc、Ets2真核表达载体共转染Hela细胞,检 测荧光素酶活性变化,比较不同单体型对hTERT基因启动子转录活性的影响.结果 研究结果表明,hTERT启动子区rs2853669携带C等位基因的单体型荧光素酶活性较低.与野生型T-T比较,单体型T-C的荧光素酶活性降低31％,单体型C-C的荧光素酶活性降低43％(P＜0.001).转录因子Ets2和c-Myc协同作用,显著增强hTERT基因启动子的活性(P＜0.001).结论 hTERT基因启动子区单体型遗传变异C-C (rs2735940-rs2853669)通过影响与转录因子Ets2和c-Myc的结合效率,降低该基因的转录活性和表达.
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端粒－端粒酶与衰老退行性变的关系
衰老是一种多因素复合调控的过程，表现为DNA损伤、DNA的甲基化、染色体端粒长度的改变以及细胞的氧化损伤等。近几年的研究也形成了许多有关衰老机制的学说，其中端粒学说成为衰老研究的热点之一。我们已知细胞衰老是器官衰老和机体衰老的基础，而细胞衰老是由于细胞在不断分裂的过程中，端粒长度逐渐缩短、结构功能发生改变所引起的。现对端粒－端粒酶的结构功能及其与衰老关系的研究进展进行综述，并阐明端粒－端粒酶在抗衰老方面有着十分重要的理论价值及实际意义，为攻克医学领域中癌症、衰老和特定遗传病提供新的治疗靶点及治疗方案。
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老年人身体功能退行性变的机理研究新进展
近的研究发现了端粒介导衰老的一些新机制“不同的通路…交叉和汇合到线粒体的模型”，即：端粒缩短和相关的DNA损伤反应，会促使线粒体功能障碍的发生，减少氧化损伤的防御，并破坏ATP的产能过程。这可以解释干细胞、祖细胞和有丝分裂后组织的能量生成，普遍下降的现象。
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1型及2型糖尿病患者外周血白细胞端粒长度减短与氧化应激关系的研究
目的 分析糖尿病氧化应激对DNA损伤程度与端粒长度的相关性,探讨糖尿病时端粒减短的原因. 方法 选取T2DM患者(T2DM组)62例,T1DM患者(T1DM组)34例,对照(NC)组41名,提取外周血白细胞,ELISA法检测白细胞中8羟基脱氧鸟苷(8-OHdG),定量PCR检测端粒长度.结果 8-OHdG水平T2DM组(2.97±0.85)与T1DM组(1.97±0.87)高于NC组(0.90±0.44)；端粒长度T2DM组(1.67±0.50)与T1DM组(1.47±0.50)均较NC组(2.39±0.55)减短,且T1DM组端粒长度较T2DM组进一步减短.在T2DM组中,年龄及8-OHdG与端粒长度呈负相关(P=0.001,β=-0.018；P=0.023,β=-0.158)；在T1DM组中,8-OHdG与端粒长度呈负相关(P=0.001,β=-0.358).结论 糖尿病患者外周白细胞端粒长度均缩短,T1DM患者端粒长度减短更为明显.糖尿病时端粒的减短主要与氧化应激、年龄及胰岛素分泌水平有关.
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外周血白细胞端粒长度与早发冠心病的相关性及其影响因素分析
目的：探究外周血白细胞端粒长度（LTL）与早发冠心病的相关性及其影响因素。方法：纳入早发冠心病患者128例（早发冠心病组，其中急性冠状动脉综合征患者88例，稳定性冠心病患者40例），非冠心病患者128例（非冠心病组），两组≤30岁、31~40岁、41~50岁、51~60岁年龄段患者均为2、14、65、47例。采用荧光定量方法测定外周血LTL，采用Spearman相关及多元线性回归，分析LTL与早发冠心病的相关性及其影响因素。结果：早发冠心病组中急性冠状动脉综合征患者的男性比例、Gensini评分较稳定性冠心病患者高，端粒与单拷贝基因比率（T/S比率）、LTL较稳定性冠心病患者低，差异有统计学意义（P均＜0.05）。早发冠心病组外周血T/S比率较非冠心病组显著降低（0.88±0.86 vs 1.10±0.57，P<0.05），但两组10年T/S比率变化值差异无统计学意义（-0.17±0.10 vs -0.25±0.07，P=0.63）。早发冠心病组和非冠心病组T/S比率与年龄均呈负相关（r=-0.275，P=0.002；r=-0.316， P=0.000）。Spearman相关分析显示，早发冠心病组患者LTL与高脂血症（r=-0.415，P=0.049）、糖尿病（r=-0.472， P=0.036）均呈明显负相关。多元线性回归分析显示，早发冠心病组LTL与年龄呈负相关（B=-0.023，P=0.038）；非冠心病组LTL与年龄（B=-0.027，P=0.000）、吸烟史（B=-0.278，P=0.012）、高密度脂蛋白胆固醇（B=-0.297，P=0.046）水平均呈负相关。结论：在早发冠心病患者中，急性冠状动脉综合征患者男性更多见、LTL更短、冠状动脉病变更加严重。与非冠心病组比较，早发冠心病患者的外周血LTL明显缩短但缩短速率并未增加。早发冠心病患者LTL与高脂血症、糖尿病明显负相关，年龄的增长是导致其端粒缩短的主要因素；而对于非冠心病患者，除了年龄增长外，吸烟、高密度脂蛋白胆固醇水平改变也是引起端粒缩短加速的主要因素。
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端粒长度与心血管疾病关系的研究进展
端粒是位于染色体两端的帽状结构,其长度受细胞分裂次数、端粒酶活性、遗传、种族等因素影响.近年来的研究显示,心血管疾病发生、发展过程中伴随氧化应激及持续炎症反应,这些病理过程均可促进端粒进一步缩短.临床研究证实,动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭等心血管疾病患者外周血白细胞端粒长度较健康对照人群显著缩短.此外,端粒长度和心血管事件之间也有一定的相关性,提示端粒可能参与了心血管疾病的发生、发展,也可能是心血管疾病治疗的新靶点.但端粒缩短和心血管疾病之间的因果关系尚不明确,目前的研究结论也不完全一致,需要更多的研究明确端粒在心血管疾病中扮演的角色.
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外周血白细胞端粒长度与急性心肌梗死严重程度和心血管危险因素的关系
目的 探讨外周血白细胞端粒长度与急性心肌梗死(AMI)严重程度和传统心血管危险因素的关系. 方法 连续入选2014年12月至2017年1月在空军军医大学西京医院住院的AMI患者114例,并选择同期经冠状动脉造影显示冠状动脉狭窄＜50％的患者117例作为对照组.应用Gensini评分评估入选患者的冠状动脉狭窄程度,根据Gensini评分的四分位数间距将入选患者分为4组;应用Framingham危险因素评分综合评估入选患者的心血管危险因素,根据未来10年心脏病风险将入选患者分为低危组、中危组和高危组.收集所有患者在接受冠状动脉造影前的外周动脉血,采用荧光实时定量PCR检测外周血白细胞端粒长度.比较不同组间外周血白细胞端粒长度的差异及端粒长度与不同心血管危险因素的关系. 结果 AMI组与对照组患者外周血白细胞端粒长度比较,差异有统计学意义[1.04(0.67,1.50)比1.26(0.83,1.67),Z=-2.47,P=0.014];Gensini评分4组间外周血白细胞端粒长度比较,差异有统计学意义(x2=7.93,P＜0.05),且外周血白细胞端粒长度与Gensini评分呈负相关(r=-0.175,P＜0.01);Framingham评分低危组、中危组和高危组患者 的外周血白细胞端粒长度比较,差异无统计学意义(P＞0.05);外周血白细胞端粒长度与收缩压(r=0.14,P=0.04)和高密度脂蛋白胆固醇(r=0.16,P=0.03)相关,与其他心血管危险因素均无相关性(均为P ＞0.05). 结论 AMI患者外周血白细胞端粒长度明显降低;随着冠状动脉狭窄严重程度的增加,外周血白细胞端粒长度进一步降低.外周血白细胞端粒长度可作为AMI的预测因子,提示AMI患者的冠状动脉狭窄程度.
关键词： 心肌梗死 白细胞 端粒 Gensini评分 Framingham危险因素评分 -
端粒复合体与冠心病的研究进展
端粒复合体由端粒DNA、端粒相关蛋白、端粒酶共同构成,是维持染色体DNA稳定的重要结构.多种心血管危险因素和不良生活方式均可造成端粒缩短加快,而健康的生活方式及他汀类药物则可减缓端粒缩短.在细胞、动物等研究基础上,多项端粒复合体与冠心病相关的临床研究,阐明了端粒复合体功能失调在冠心病的发生、发展、预后中起到的重要作用.冠心病患者外周血白细胞端粒长度明显缩短,端粒长度短是心血管事件再发的一个独立的危险因素,具有预测心血管事件预后的价值.目前,针对端粒长度缩短与冠心病相关的机制、端粒相关蛋白与冠心病的相关性以及白细胞亚群的研究等方面尚有研究空间.
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端粒与自身免疫性疾病
端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构,其功能是保护染色体末端结构完整和功能稳定,染色体末端失去保护将出现染色体重组、融合、降解.端粒酶是维护端粒的核蛋白复合体,端粒酶缺乏会导致端粒长度随细胞分裂不断缩短而失去稳定性.端粒蛋白由端粒保护蛋白和端粒相关蛋白组成,是参与维护染色体结构稳定的蛋白复合体,在参与调节端粒长度、保护端粒结构和功能中发挥着重要作用.端粒的相关研究主要集中在肿瘤、遗传性疾病等领域,但越来越多的研究认为端粒与自身免疫性疾病的发病同样有着密切的关系.通过对端粒的研究可能对自身免疫性疾病的发病和治疗等提供新的方向.
