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NR2B反义寡核苷酸对大鼠海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响
目的观察NMDA受体2B亚单位(NR2B)反义寡核苷酸(ANR2B)对海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响,筛选有效的反义寡核苷酸,为探讨针对NR2B的新药物提供形态学基础.方法设计、筛选、合成ANR2B.正常SD大鼠,海马CA1区立体定位注射ANR2B,灌注取脑,连续冰冻切片,ABC免疫组织化学方法染色,光镜下观察NR2B蛋白质的表达变化.结果注射ANR2B后,注射区及其周围NR2B免疫组织化学染色强度明显下降,仅有少量锥体细胞和颗粒细胞散在分布;而在注射NR2B正义寡核苷酸(SNR2B)、生理盐水及生理盐水插针不注射的海马切片上,海马CA1区的染色特征与注射ANR2B者有明显差别,其作用区锥体细胞、颗粒细胞及顶树突的NR2B免疫组织化学染色强度无明显变化.结论 ANR2B能够降低NR2B蛋白质在正常大鼠海马CA1区的基础性高表达.
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NMDA诱导神经元胆囊收缩素mRNA表达及其机制研究
目的 探讨NMDA诱导神经元胆囊收缩素mRNA表达及其机制。方法 利用体外培养的胚胎大鼠大脑皮层神经元和Northern Blot技术，观察NMDA诱导神经元胆囊收缩素mRNA的表达以及c-fos、c-jun反义寡聚核苷酸对该作用的影响。结果NMDA刺激神经元2h后，胆囊收缩素mRNA的表达量与对照相比升高317％(P＜0.01)，而预先给予50uMol～100uMol的c-fos、c-jun反义寡聚核苷酸后该作用被明显抑制(抑制率分别为71.5％、216.5％，P＜0.01)。结论 NMDA可通过c-fos、c-jun的介导作用诱导神经元合成胆囊收缩素，该结果在小剂量NMDA对谷氨酸兴奋性神经毒性的拮抗作用中具有重要意义。
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反义寡核苷酸类药物治疗神经系统疾病的基础研究
目的 建立一种高效毛细管电泳技术测定反义寡核苷酸含量的新方法.方法 采用高效毛细管电泳法,熔融石英毛细管柱,50 cm×75 μm (有效长度37 cm);运行缓冲液:电泳缓冲液为50 mmol/L TBE缓冲液(pH 7.2),压力进样(1.0 psi,5 s);柱温25℃;检测波长260 nm,分离电压10 kV,用峰面积外标法定量.结果 反义寡核苷酸浓度在6.25～100.0 μg/mL内与峰面积比呈良好的线性关系,相关系数r=0.9950,反义寡核苷酸的检测限为1.0 μg/mL.结论 本方法可用于测定聚赖氨酸与反义寡核苷酸缩合体溶液中游离反义寡核苷酸的含量.
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HIF-1α反义寡核苷酸增强胃癌细胞对顺铂的敏感性
目的研究缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)反义寡核苷酸(antisense oligodexynucleotide,ASODN)对人胃癌细胞凋亡及化疗药物敏感性的影响.方法人工合成HIF-1αASODN经阳离子脂质体包裹后瞬时转染人胃癌SGC-7901细胞系.采用RT-PCR和免疫细胞化学检测转染后HIF-1α基因表达情况,MTT法观察化疗药物敏感性的变化,AO/EB染色及TUNEL检测SGC-7901细胞转染后顺铂诱导的凋亡.结果经HIF-1αASODN处理的SGC-7901细胞HIF-1α基因表达明显下调,HIF-1α ASODN处理的SGC-7901细胞加顺铂作用后与对照组比较,细胞凋亡率明显增加,化疗药物敏感性增强.结论阳离子脂质体转染HIF-1α ASODN具有促进化疗药物诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡及增强化疗药物敏感性作用.
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荷乳腺癌小鼠c-myc mRNA反义寡核苷酸显像研究
目的 建立99mTc标记寡核苷酸的方法并用于荷乳腺癌小鼠反义寡核苷酸显像研究.方法 利用双功能螯合剂N-羟基琥珀酰亚胺-巯乙苷肽(S-Acetyl-NHS-MAG3)对一段15碱基c-myc mRNA反义寡核苷酸片段进行99mTc标记;对荷乳腺癌昆明种小鼠进行标记反义寡核苷酸生物学分布与显像研究.结果 生物学分布结果表明,相对于正义核酸而言,反义核酸在肿瘤组织中的摄取明显增高(P<0.05).在反义寡核苷酸显像组,肿瘤组织显像剂摄取活跃,肿瘤/肌肉比值高可达5.5.在正义寡核苷酸显像组及阻断组,肿瘤组织均未出现明显的显像剂浓聚.结论 99mTc标记反义寡核苷酸有望成为一种新的显像剂,在分子水平上用于恶性肿瘤的早期、特异和无创性诊断.
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PCNA的反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌HeLa细胞的研究
目的检测脂质体介导增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡聚核苷酸抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性效果.方法应用细胞生长曲线和MTT比色法检测细胞增殖活性,并采用免疫组织化学方法(sABC法)检测PCNA蛋白的表达.结果反义寡聚核苷酸处理组细胞与对照组比较生长曲线差异有显著性,增殖显著受抑(P＜0.05),PCNA蛋白表达完全抑制.而正义寡聚核苷酸组则无此作用(P＞0.05).结论提示PCNA反义寡聚核苷酸可以显著抑制子宫颈癌细胞体外增殖活性,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现.
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EBV-LMP1通过NFκB介导的信号传导途径活化CyclinD1机制初探
目的:探讨EBV-LMP1促进细胞增殖,参与EBV相关疾病致瘤的分子机制和EBV-LMP1通过NFκB介导的信号传导途径活化细胞周期重要正性调节因子CyclinD1表达的机制.方法:利用已建株的,LMP1表达受四环素衍生物强力霉素严密调控的pTet-on-LMP1-HNE2稳定鼻咽癌细胞系,用强力霉素诱导LMP1的表达,Western blotting从蛋白质水平分析LMP1诱导CyclinD1表达的表达动力学,包括时间效应及剂量效应,进一步在LMP1稳定表达的鼻咽癌细胞系CNE-LMP1中,用反义硫代磷酸化寡聚核苷酸分别从LMP1,NFκBp65及CyclinD1三个层次阻断,结合报导基因分析法分析从转录水平阻断后,CyclinD1报导基因强度的差异,结合流式细胞仪分析这三个层次的阻断对细胞周期产生的影响,从而探讨在鼻咽癌中,EVB-LMP1促进CyclinD1表达的机制.结果:在pTet-on-LMP1-HNE2细胞中,Western blotting方法显示,较未经诱导比较,随着LMP1的诱导表达,CyclinD1的表达明显增强,且表达具有时间依赖性,但是剂量诱导表达效果不显著.在CNE-LMP1细胞系中,导入LMP1、p65及CyclinD1的反义寡聚核苷酸从三个层次分别阻断各自的表达后,报导基因分析结果显示,CyclinD1的报告基因活性均被抑制,分别下降7.1倍,13.7倍,及35.7倍,流式细胞仪分析结果显示,较之未处理的CNE-LMP1细胞,反义LMP1、P65及CyclinD1均可抑制细胞进入增殖期,分别抑制了35%,26%及7%.结论:EBV-LMP1可能经NF-κΒ介导的信号传导途径活化CyclinD1表达,导致细胞周期紊乱,进而赋于鼻咽癌细胞恶性增殖特性.通过本研究将信号传导与细胞周期这两个当前活跃的研究领域交叉起来,为阐明EB病毒致瘤机制开辟了一个新的视野.
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反义技术--高血压治疗新策略
本文阐明了反义技术的原理以及用反义技术治疗高血压的候选基因及其筛选方法;并介绍了反义寡聚核苷酸的化学修饰、特异性、作用靶点、转染方式以及用反义技术治疗高血压的前景.
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反义HER-2/neu寡聚核苷酸对卵巢肿瘤细胞增殖的影响
在卵巢肿瘤发生、发展过程中HER-2/neu基因呈高水平表达状态[1,2],通过其反义寡聚核苷酸处理卵巢肿瘤细胞株3ao 10/3以探讨靶基因表达水平降低对卵巢肿瘤细胞增殖的影响.
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STAT3反义寡聚核苷酸对人脑胶质瘤细胞系U251细胞侵袭和凋亡的影响
目的 探讨敲低信号转导及转录活化因子3(STAT3)表达对人胶质瘤细胞系U251细胞功能的影响及相关作用机制. 方法 脂质体介导STAT3反义寡聚核苷酸转染人胶质瘤细胞系U251细胞,同时设无义序列组和空白对照组,48 h后MTT检测STAT3反义核苷酸对U251细胞增殖的影响,流式细胞仪检测各组细胞周期、细胞凋亡的变化,Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力,Western blotting检测STAT3和磷酸化STAT3(pSTAT3)蛋白、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达水平. 结果 与空白对照组、无义序列组比较,STAT3反义核苷酸组细胞的相对存活率降低,G1/G0期细胞比例、细胞凋亡增加,Transwell实验显示滤膜细胞数明显减少,STAT3、pSTAT3、uPAR和Bcl-2蛋白的表达降低、Bax蛋白表达增加,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 反义STAT3可能通过调节相关基因表达抑制U251细胞侵袭能力并诱导其调亡,STAT3可作为胶质瘤基因治疗的有效靶点.
关键词： 信号转导及转录活化因子3 反义寡聚核苷酸 神经胶质瘤 uPAR -
反义miR-21抑制异种移植U87人脑胶质瘤生长的体内研究
目的 探讨敲低miR-21表达抑制裸鼠皮下荷U87人脑胶质瘤生长的疗效和机制.方法 原位注射miR-21反义寡聚核苷酸(AS-miR-21)治疗裸鼠皮下荷U87人脑胶质瘤.定时测量肿瘤大小评估原位注射AS-miR-21的治疗效果.使用RT-PCR和原位杂交方法 鉴定治疗后miR-21表达水平,采用HE染色和免疫组织化学染色(增殖细胞核抗原、细胞周期抑制因子-21、基质金属蛋白酶-9和隔蛋白-7)评价治疗后肿瘤生物学性状的变化,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡. 结果 肿瘤生长曲线显示AS-miR-21治疗组肿瘤生长速度及体积明显小于对照组与无义序列治疗组,差异有统计学意义(F=6.056,P=0.007);RT-PCR检测显示AS-miR-21治疗组miR-21表达下调为对照组的(0.031±0.008)%;原位杂交显示AS-miR-21治疗组miR-21表达水平较对照组与无义序列治疗组下调:组织病理学检测表明AS-miR-21治疗后肿瘤恶性度降低;TUNEL法检测可见AS-miR-21治疗组细胞凋亡数明显高于对照组与无义序列治疗组,差异有统计学意义(F=141.021,P=0.000). 结论 以miR-21作为靶点治疗异种移植U87人脑胶质瘤效果令人满意,miR-21可作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.
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纳米氧化铁介导的mdr1反义寡核苷酸对人肠癌细胞的靶向投递作用
目的:以氧化铁磁性纳米颗粒(PLL-DCIONP)作为载体介导多药耐药基因1(mdr1)反义寡核苷酸(asODN)作用于人肠癌细胞,评价mdr1 asODN对人肠癌细胞的靶向投递作用.方法:荧光显微镜观察PLL-DCIONP-asODN-FAM复合物、asODN-FAM体外转染LS174T、HCT-8/VCR细胞,普鲁士蓝(Perle's blue)铁染色观察PLL-DCIONP-asODN复合物、PLL-DCIONP体外转染LS174T、HCT-8/VCR细胞,MRI测定体外转染细胞磁化率.结果:LS174T、HCT-8/VCR细胞在PLL-DCIONP-asODN-FAM复合物转染组荧光强度明显高于asODN-FAM转染组,LS174T、HCT-8/VCR细胞在PLL-DCIONP-asODN复合物转染组细胞内的蓝色铁颗粒明显多于PLL-DCIONP转染组,PLL-DCIONP-asODN复合物转染后的细胞T2随着细胞数的增加而逐渐缩短,呈明显的衰减势态.结论:PLL-DCIONP-asODN对HCT-8/VCR细胞有靶向投递作用.
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SHNH法和NHS-MAG3法标记的99mTc-寡聚核苷酸的比较
比较研究采用联肼尼克酰胺(Hydrazino Nicotinamide Derivative, SHNH)法和N-羟基琥珀酰胺基S-乙酰巯基乙酰三氨基乙酸(N-hydroxysuccinimidyl S-acetylmercaptoacetyltriglycline,NHS-MAG3)法以99mTc标记反义寡聚核苷酸(Antisense Oligonucleotide,ASON)的标记物的放射化学和生物学特性.合成SHNH和NHS-MAG3后,分别以SHNH和NHS-MAG3为双功能络(螯)合剂,用99mTc标记ASON;比较标记物99mTc-SHNH-ASON和99mTc-MAG3-ASON的体内外稳定性、兔血浆蛋白结合、正常BALB/C小鼠体内分布及结肠腺癌HT29细胞摄取的情况.结果显示,采用NHS-MAG3法标记的标记物99mTc-MAG3-ASON的标记率和稳定性明显高于SHNH法标记的标记物99mTc-SHNH-ASON(P＜0.05)、血浆蛋白结合率显著低于99mTc-SHNH-ASON(P＜0.05);99mTc-MAG3-ASON在血液、心脏、胃、肠的分布显著低于99mTc-SHNH-ASON(P＜0.05),而在肝、脾的分布略低于99mTc-SHNH-ASON(P＞0.05),但在肾的分布显著高于99mTc-SHNH-ASON(P＜0.05);99mTc-MAG3-ASON的HT29细胞摄取率显著高于99mTc-SHNH-ASON(P＜0.05).因此,采用NHS-MAG3法的标记物99mTc-MAG3-ASON的放射化学和生物学特性明显优于SHNH法的标记物99mTc-SHNH-ASON.
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99mTc-反义寡聚核苷酸DNA肿瘤显像的实验研究
拟探讨放射性标记反义寡聚核苷酸(Antisense oligonucleotide, ASON)DNA在荷瘤裸鼠体内显像的可行性.采用两种不同肿瘤细胞系KB-G2 和KB-31,并肿瘤内注射的方法;设立ASON的对照正义寡聚核苷酸(Sense oligonucleotide, SON);用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定所用经MAG3偶联的寡聚核苷酸的杂交活性;完成99mTc-MAG3-ASON和99mTc-MAG3-SON DNA肿瘤内注射后在荷瘤裸鼠体内的显像及其生物分布研究.经MAG3偶联的寡聚核苷酸与天然寡聚核苷酸具有相同的杂交活性.在荷KB-G2瘤裸鼠肿瘤内,99mTc-MAG3-ASON DNA的分布明显高于其对照99mTc-MAG3-SON DNA的分布(14.7 vs 8.5% ID/g).但在荷KB-31瘤裸鼠肿瘤内,两者的分布无显著性差异(8.6 vs 4.3% ID/g).全身显像显示99mTc-MAG3-ASON DNA较其对照正义DNA寡聚核苷酸在荷KB-G2瘤裸鼠肿瘤内的靶向分布增高,但在荷KB-31瘤裸鼠肿瘤内的靶向分布则未见显著性差异.结果表明:99mTc-MAG3-ASON DNA较其对照正义DNA寡聚核苷酸在荷瘤裸鼠肿瘤内的分布有显著性统计学差异,本研究证实了活体动物体内肿瘤反义显像的可行性.
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99mTc-MDR1寡聚核苷酸DNAs的制备及质量控制
研究99mTc标记多药耐药基因(MDR1)mRNA反义DNAs寡聚核苷酸及其正义DNAs寡聚核苷酸的佳标记方法并制备其二步法冰冻试剂盒,完成99mTc标记MDR1反义DNAs寡聚核苷酸和正义DNAs寡聚核苷酸及其二步法冰冻试剂盒的的质量控制.合成20个碱基单链的MDR1 mRNR的反义DNA寡聚核苷酸(ASON)及其正义DNA寡聚核苷酸(SON),全程硫代修饰并在5′末端附加氨基酸以修饰,分别将ASON和SON DNA 与MAG3偶联后用99mTc标记,制备了99mTc-寡聚核苷酸DNA二步法冰冻试剂盒.通过改变ASON-和SON-MAG3 DNAs、氯化亚锡及缓冲液的用量,调整反应介质的pH值条件,探讨其佳标记方法.用高压液相色谱仪(HPLC)测定该药盒化合物的放射化学纯度、标记物的体内外稳定性、药盒的稳定性.99mTc-ASON-和SON-MAG3 DNAs标记化合物的放射化学纯度＞92%,标记物室温放置24 h后其放射化学纯度＞90%;药盒在-20℃条件下放置6个月,标记物的放射化学纯度仍＞90%.99mTc-寡聚核苷酸DNAs二步法冰冻试剂盒性能优良,标记方法简单、可行、有效,且标记物稳定性良好.
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探讨人胶质瘤细胞系U87细胞中反义miR-21诱导凋亡机制
目的 探讨下调miR-21诱导人胶质瘤细胞系U87细胞凋亡机制.方法 应用化学方法合成的反义miR-21寡聚核苷酸(anti-miR-21),通过瞬转法转染U87细胞,检测U87细胞凋亡、增殖、侵袭等变化,并结合生物信息学分析、Western印迹验证在U87细胞中miR-21和PTEN基因及caspase间关系.结果 体外转染反义miR-21寡聚核苷酸能明显抑制U87细胞生长,诱导其凋亡,降低侵袭能力;增加caspase-3表达活性,活化caspase-9表达,但不影响PTEN和caspase-8表达.结论 miR-21可能是人胶质瘤U87细胞的抗凋亡微RNA(microRNA,miRNA),反义miR-21可能通过easpase-9、3而不是PTEN诱导肿瘤细胞凋亡.
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脂质体介导的99mTc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸的反义作用效果的研究
目的探讨脂质体介导的99mTc标记癌基因c-myc mRNA的反义寡核苷酸能否抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.方法合成15 bp的癌基因c-myc mRNA的反义、正义及无义寡核苷酸,用99mTc标记后(简称99mTc-DNA),一部分用脂质体包裹,以不同放射性强度的99mTc-DNA及脂质体包裹的99mTc-DNA转染细胞,于转染后不同时间测定细胞摄取率,在转染后18 h测定细胞返流比率,用四唑盐比色实验检测反义抑制细胞的生长状况,用流式细胞术测定癌蛋白的表达.结果在1～5 h内,细胞的摄取率随时间的延长而增加,脂质体包裹的99mTc-DNA的细胞摄取率明显高于未用脂质体包裹的99mTc-DNA.四唑盐比色实验,随着脂质体介导的99mTc-反义DNA剂量的增加,细胞数量逐渐减少,而正义、无义寡聚核苷酸组,细胞数量则没有减少的趋势.细胞的返流比率,反义、正义、无义寡核苷酸分别为39.51%、44.12%、63.92%.测定癌蛋白的荧光强度,反义寡核苷酸组2.9860±0.3733、正义寡核苷酸组4.2600±0.2218、无义寡核苷酸组5.2620±0.8562,反义寡聚核苷酸组的荧光强度明显低于正义和无义寡聚核苷酸组.结论脂质体介导的99mTc标记的反义寡核苷酸能抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达.
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NR2B反义寡核苷酸对脑缺血海马CA1区NR2B mRNA表达的影响
为研究NMDA受体2B亚单位(NR2B)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotideto NR2B,ANR2B)对短暂性脑缺血后海马CA1区NR2B mRNA表达的影响,分别向成年SD大鼠海马CA1区内立体定位注射ANR2B、NR2B正义寡核苷酸(SNR2B)、无菌生理盐水(NS),或者插针不注射(NSNO),24 h后行四动脉阻断前脑缺血手术(缺血15 min、再灌注24 h),经心冲灌固定取脑,连续冰冻切片,原位杂交组织化学方法染色,光镜下观察各组每侧鼠脑NR2B mRNA的表达变化,并用LEICA QWin进行图像分析.结果显示,单纯缺血组海马各区的NR2B mRNA显色强度明显增加;缺血再灌组、假手术组和正常组海马CA1区内ANR2B注射点及其周围的NR2B mRNA显色明显下降;而在注射SNR2B、NS或NSNO的各组海马切片上,NR2B mRNA显色均无明显变化.结果表明ANR2B可以特异性地在体局部防止缺血后NR2B mRNA的高水平表达.
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c-fos反义寡聚核苷酸对亚硒酸钠引起的皮质神经元凋亡的保护作用
本文利用c-fos ASO(反义链全部硫代磷酸化修饰)技术阻断c-fos的表达,观察此项处理对亚硒酸钠在体外培养皮质神经细胞致凋亡作用和相关基因表达改变的影响.结果显示:(1)c-fos ASO可阻断亚硒酸钠的致凋亡作用,且有一定的剂量和时间依赖性;用琼脂糖凝胶电泳分析由各个时间点提取的DNA片段,与对照组比较,c-fos ASO能明显阻断亚硒酸钠诱导的典型的DNA梯型;用流式细胞仪检测得到的DNA含量直方图也显示,在c-fosASO处理后,与对照组比较,亚硒酸钠引起的亚二倍体峰变小;(2)用RT-PCR法检测表明,在用c-fos ASO和亚硒酸钠处理皮质神经细胞后,不仅阻断了c-fos表达的上调,对其它几种基因表达的改变也有不同的影响,与对照组比较,c-fos mRNA在各个时间点(0.5、1、2、4和24 h)不再上升,bcl-2 mRNA则不再下降,baxmRNA和AChEmRNA都不再上升;唯一不同的是,p53mRNA的变化趋势则与未经c-fos ASO预处理时基本相同,在多数时间点两组p-53mRNA水平之间无显著性差异(P＞0.05),说明此基因的表达基本不受c-fos ASO作用的影响.上述结果提示,亚硒酸钠诱导的神经元凋亡可能是一组级联式基因表达更变的结果,c-fos是其中的一个组成成员,它的表达改变被阻断后,处于它下游的基因bcl-2、bax,和AChE基因表达的改变不再发生或减弱,而处于c-fos上游的p-53可因亚硒酸钠的作用而依旧发生表达的上调.由以上结果推断,p-53和c-fos基因可能是亚硒酸钠诱导的新生小鼠皮质神经元凋亡的早期发生表达改变的基因;其它基因则在随后发生改变,后导致凋亡发生.
