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聚合酶链反应检测疟疾的研究
目的建立能鉴别诊断恶性疟原虫间和日疟原虫的PCR检测方法.方法根据红内期疟原虫SSUr-RNA基因序列,设计合成两对引物,采用PCR技术,检测89份门诊"四热"病人血样,并与镜检法进行比较研究.结果恶性疟原虫血样能扩增出205bp的特异带,间日疟原虫血样能扩增出120bp的特异带,PCR检测的阳性率为74.16%,镜检法为68.54%,PCR法与镜检法的符合率为94.38%.结论PCR检测的敏感性和特异性均优于镜检法,对于诊断恶性疟原虫和间日疟原虫以及恶性疟原虫的问日疟原虫的混合感染具有一定的应用价值.
关键词： 聚合酶链反应 小亚单位核糖体核糖核酸基因 诊断 恶性疟原虫 间日疟原虫 -
间日疟原虫乳酸脱氢酶GST融合表达载体的构建及表达
目的 构建间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)融合表达载体.并表达PvLDH的GST融合蛋白.方法 将PvLDH基因片段克隆到表达载体pGEx-4T-1中,构建PvLDH/pGEX-4T-1融合表达载体,IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,Western blot检测其抗原性.结果 成功构建了PvLDH/pGEx-4T-1融合表达系统,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物能与恶性疟原虫和问日疟原虫感染患者血清反应,而不与正常人血清反应.结论 间日疟原虫LDH蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有良好的抗原性.
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IL-17和IFN-γ在红内期间日疟原虫感染者外周血T细胞亚群中的表达
目的：观察分析间日疟原虫感染患者外周血T细胞亚群中分泌IL-17和IFN-γ的细胞的表达水平。方法采用流式细胞术检测分析患者组（PV）和健康对照组（HD）外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD8-和γδT细胞中分泌胞内因子IL-17、IFN-γ的细胞的百分比。结果在所有检测的细胞亚群中，分泌IFN-γ的CD3+CD8-和γδT细胞在其所属亚群中所占比例明显高于健康对照组，分泌IL-17的γδT细胞的比例明显高于健康对照组。结论本研究对于理解机体抗疟原虫的细胞免疫的功能状态具有一定意义。
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间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定
目的 研制间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)单克隆抗体,并对抗体特性进行了初步鉴定.方法 用纯化的重组PvLDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,测定其免疫球蛋白亚类及效价,结合ELISA、Western blot 试验分析其特异性.结果 共获得5株稳定分泌抗PvLDH重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别为6D1、6D2、5A10、5C7、4A8.5株单抗培养上清的ELISA效价为1: 512～1: 1 024,腹水效价为1: 12 800～1: 25 600,其中5C7、6D1经Western-blot鉴定能与天然的恶性疟原虫和间日疟原虫的LDH发生特异性反应.结论 本研究方法成功制备并获得了针对PvLDH的单克隆抗体,为进一步研究疟疾诊断试剂奠定了基础.
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清城区10年疟疾发生特点与防治措施分析
本区地处广东省中部,属平原地区,夏秋季高温多雨,是个典型的亚热带地区,是以中华按蚊为传播媒介的疟疾高发区,流行虫种为间日疟原虫,无恶性疟原虫及三日疟原虫.
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重症恶性疟1例
1病历简介患者,孙某,男,36岁,广西隆林县人,不明原因发热、全身酸痛、乏力、大汗淋漓,同时伴头痛、上腹痛,于2008年5月10日到当地卫生院治疗,未见明显好转,仍反复发热,食欲、睡眠欠佳,尿呈浓茶样.5月13日到县疾病预防控制中心诊治,初诊为疟疾,取血涂片,给氯喹(1.5g)加伯氨喹(22.5mg)4天治疗,于2008年5月16日入县人民医院治疗.体检:患者神智清、精神状态差,全身皮肤粘膜、巩膜轻度黄染,皮肤无紫绀,无皮下出血点、淤斑,肝脾肋下未触及.T39.1℃,P96次/min,R23次/min,Bp12/8KPa.实验室检查:WBC3.9×10 9/L,RBC3.54×10 12/L,HGB2103 g/L,ALT132 IU/L,AST178 IU/L,GGT68IU/L,TP52.6g/L,ALB30.6g/L,GLO22.0g/L.血涂片-显微镜检查发现间日疟原虫和恶性疟原虫.用药前疟原虫密度112 000个/μL血.入院后使用青蒿琥酯针剂60mg用所附的5%碳酸氢钠注射液1mL溶解后加5%葡萄糖注射液5mL静脉缓慢推注,每天注射1次,第1天剂量加倍,并结合临床表现对症处理.用药后24小时疟原虫密度从112 000个/μL下降至 73732/μL,48小时降至3453个/μL,72小时降至938个/μL,86小时降至320个/μL,104小时降至111个/μL,5月20日血检疟原虫阴转,病情痊愈出院.
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食蟹猴疟原虫动物模型的研究进展
人类恶性疟原虫体外连续培养的成功及人恶性疟原虫灵长类(Aotus monkeys)动物模型的建立推动了疟疾各方面的深入研究,而人类间日疟原虫由于其生物学特性比较复杂,在体外连续培养及动物模型的建立方面却十分的困难,科学家做了多方面的研究但是进展不明显[1],因此,间日型的猴疟动物模型在疟疾研究中的位置就显得十分的突出.
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不同地理株间日疟原虫SSUrRNA基因序列比较
目的 测定我国间日疟原虫不同地理株红内期SSUrRNA基因序列,比较分析其分子特征.方法 收集深圳、海南、湖北和河南四地间日疟患者血样5份(其中海南2份),并提取核酸DNA,采用PCR从核酸提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后分别与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAST和MEGA4软件分析序列相互关系特征.结果 5株间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小一致,约为998bp;核酸序列测定结果显示,所克隆的SSUrRNA基因片段均含有998个核苷酸,不同地理株间SSUrRNA基因序列有9个位点存在变异的可能,两两比对的同源性均高于99.5%,其中河南与湖北株序列的同源性为100.0%;与GenBank中报道的国外6株间日疟原虫相同序列作分子系统进化分析,国内5株间日疟原虫SSUrRNA基因序列与Sal 1株遗传距离小,亲缘关系接近.结论 测定的国内间日疟原虫SSUrRNA基因序列在不同地理株间相对保守,其间存在的单核苷酸多态性与地理变化有一定程度的关系.
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间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析
目的 克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸(SSUrRNA)编码基因片段,并进行序列特征分析.方法 采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征.结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%.结论成功克隆问日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守.
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间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用
目的 体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段,分析其分子特征,评价其核酸诊断应用效果.方法 根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物,采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定分析其序列特征;以SSUrDNA为靶基因,建立间日疟PCR诊断方法,并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果.结果 从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp;阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有267个核苷酸,与间日疟原虫Sal1株孢子期SSUrRNA基因序列比较,同源性为99.3%,其中第220位为插入了1个碱基"T",243位碱基由"G"取代了"T".将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板,PCR扩增结果显示检测灵敏度至少达102copy/μl;特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267 bp的特异性基因片段,而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带.以镜检法为参照标准,PCR敏感性为100%(102/102),特异性为100%(76/76).结论 所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定,不同地理株间存在单核苷酸多态性,以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异,具有良好的推广使用价值.
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艾康疟原虫检测试剂盒现场应用效果观察
目的 评价国产艾康疟原虫(pf/pv)检测试剂盒现场应用效果.方法 以镜检方法作为金标准比较艾康疟原虫检测试剂盒现场应用效果.结果 336例样本均用镜检方法和艾康疟原虫试剂盒诊断,镜检阳性155例,阴性181例;试剂盒诊断阳性156例,阴性180例,试剂盒诊断疟疾的灵敏度为99.4%,特异度为98.9%.试剂盒诊断间日疟的灵敏度为98.8%、特异度为100.0%;试剂盒诊断恶性疟的灵敏度为100.0%、特异性为99.3%.未发现交叉反应.结论 艾康试剂盒诊断疟原虫敏感性与特异性均高,且一次能测出单纯恶性疟或单纯间日疟的感染,操作简单,结果显示直观、快速,在常温下保存稳定,适合疟疾流行区的基层单位使用.
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间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用
目的在大肠埃希菌(E.coli)中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1 C端重组蛋白(rGST-PvMSP1C)作为诊断抗原,评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值. 方法将含有重组质粒pGEX-4T-2/PvMSP1C的工程菌E.coli BL21(DE3) 以IPTG进行诱导表达,表达产物以SDS-PAGE与Western-blot免疫印迹进行鉴定;采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化;以纯化重组蛋白包被酶标板,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体. 结果含有重组质粒pGEX-4T-2/PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST-PvMSP1C重组蛋白大小约63ku,能够被间日疟患者的血清所识别.纯化的重组蛋白SDS-PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带;以重组蛋白作诊断抗原,67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性,55份健康人血清ELISA均为阴性,5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性. 结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST-PvMSP1C蛋白具有免疫反应性,以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性,在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值.
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云南省一类疟区间日疟原虫IgG抗体血清流行病学调查
目的 监测云南省一类疟区人群的间日疟原虫抗体(IgG)水平,为云南省消除疟疾行动的流行预测和防控效果评价提供科学依据.方法 2013-2014年在云南6个一类疟区县(市)采用分层随机抽样采集居民滤纸血膜,采用ELISA试剂盒检测间日疟原虫特异性抗体,采用SPSS 20.0统计软件进行抗体阳性率及抗体滴度检验,变量间相关性进行Pearson分析.结果 共检测腾冲、盈江、耿马、瑞丽、孟连、盐津6县(市)的7 050份血样,间日疟原虫抗体(IgG)阳性率为9.05％,各县间抗体阳性率差异有统计学意义(P＜0.05),且5个边境县的平均抗体阳性率显著高于内地县盐津的阳性率,差异有统计学意义(P＜0.05);女性的阳性率9.98％显著高于男性7.95％,差异有统计学意义(P＜0.05);学生的阳性率10.79％显著高于居民7.74％,差异有统计学意义(P＜0.05);少年儿童、青壮年和中老年组的阳性率分别为9.52％、7.59％和9.40％,各组间差异无统计学意义(P＞0.05);全省合计及6个县(市)2013年和2014年的抗体阳性率差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 云南省一类疟区的人群间日疟原虫抗体(lgG)水平能反映前期的疟疾流行强度,女性、学生人群间日疟原虫抗体水平高的现象值得重视.
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间日疟原虫引起的脑损害1例报告
1 病例资料1.1 首次住院患者,男性,30岁,原籍河南,3年前来琼打工,近3月在乐东县种植香蕉.2002年1月26日～2月5日因间断性寒战、高热4d,一过性意识障碍、抽搐30min入院治疗.2002年1月21日出现畏寒、低热,2d后出现寒战、高热,体温在39℃～41℃,多在每日中午开始发热,持续数小时后体温降至正常,偶有中午、夜间均出现寒战、高热,在当地乡医院按疟疾给每日肌注蒿甲醚,具体剂量不详,效果欠佳.于1月26日出现一过性意识障碍、四肢强直抽搐,持续时间不详,从0.5m高的床上摔下后被家人发现,醒后患者感头部胀痛,对刚发生的事记不清,30min后来院就诊.查体:T 39.1℃,脾轻度肿大,左侧上睑下垂,左眼球呈外斜视,向上、向内、向下运动困难,瞳孔散大,直径5mm,直接、间接光反射消失,右侧Babinski征阳性,四肢肌力、肌张力正常,颈软,Kernig征阴性.头颅CT示左侧额、顶部高密度影呈半月型(图1).以①硬膜下血肿;②疟疾;③病毒性脑炎?收入脑外科住院治疗,期间做腹部B超示脾肿大,血常规血小板减少(43×109/L),入院第1、2、4d做外周血涂片未找到疟原虫,仍给蒿甲醚80mg/日肌注,共10d.1月28日行硬膜下血肿清除术,1月31日头颅CT示手术局部可见条片状气体影,双侧额叶片状低密度影,脑组织轻度肿胀(图2).入院后仅第1、2、4d出现寒战高热,于2月5日出院.
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不同检材微量血间日疟原虫PCR检测模板制备方法的研究
目的 探寻不同检材微量血间日疟原虫PRC检测模板制备的方法.方法 全血标本采用酚/氯仿抽提法、洗涤沉淀法、Chelex煮沸法和洗涤水煮法；滤纸干血滴及厚血膜标本以Chelex煮沸法和洗涤沉淀法制备模板.以间日疟原虫特异性引物作PCR扩增检测模板制备的效果.结果 采用上述4种不同的方法制备的全血间日疟原虫DNA模板与采用Chelex法和洗涤沉淀法制备的滤纸干血滴以及厚血膜疟原虫DNA模板均可被扩增出1条341bp的间日疟原虫特异性DNA条带,与预期的扩增片断大小一致；不同方法制备的10份间日疟患者血样DNA模板用于PCR扩增检测,结果无明显差异.其中,Chelex煮沸法和洗涤沉淀法对不同检材的疟原虫感染血样DNA模板均能有效制备,且可在同一离心管中进行,减少了交叉污染的机会.结论 Chelex法和洗涤沉淀法简便、实用,适用于不同检材微量血疟原虫PRC模板的制备.
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海南省间日疟原虫CSP基因型虫株对氯喹敏感性和复发特征的初探
目的了解海南省间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因型虫株对氯喹的敏感性和复发特征.方法通过常规剂量氯喹治疗间日疟病例观察其临床疗效和复发情况,并用套式等位PCR技术对观察病例间日疟原虫进行CSP基因分型.结果观察22例间日疟病例,平均退热时间为(25.4±4.3)h,平均原虫转阴时间为(40.2±5.5)h,各间日疟原虫CSP基因型虫株病例间的平均退热时间和平均原虫转阴时间差异无统计学意义(P＞0.05).间日疟原虫热带族虫株病人复发率为77.6%,平均首次复发时间为(61.0±16.4)d;温带族虫株病人复发率为100%,平均首次复发时间为(278.6±214.5)d,两族虫株病例的首次复发时间差异有高度显著性(P＜0.01).结论海南省流行的间日疟原虫CSP基因型虫株均对氯喹敏感,各虫株间临床疗效无明显差异.热带族虫株病例比温带族虫株病例的首次复发时间短.
关键词： 间日疟原虫 环子孢子蛋白(CSP)基因型 氯喹 敏感性 复发特征 -
应用双重PCR检测海南疟区发热病人的效果
目的评价双重PCR检测疟区发热病人的效果.方法对疟区求诊发热病人,手指取血分别制作厚薄血膜片和滤纸血斑作为检测血样.参照文献用恶性疟原虫PF1-2和间日疟原虫PV3-5为特异性引物,同在一个反应体系常规进行PCR,扩增片段分别为206bp和431bp.同时镜检厚血膜作对照.结果该反应体系低可检出原虫血症为1个恶性疟原虫/μl血和10个间日疟原虫/μl血的感染;检测132例疟区发热病人血样的阳性率为65.1%,而镜检法为64.4%,且有1例漏诊和3例误诊,两法符合率为97%.结论双重PCR用于疟区发热病人检测,较镜检敏感、特异,适合我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断,还可用于血检质量的监控.
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PCR检测食蟹猴疟原虫的实验研究
目的建立一种特异、敏感、简捷的PCR检测食蟹猴疟原虫(P.C)的方法.方法检测样品来自人工接种感染P.C的阳性猴血膜及滤纸血斑.根据P.CSSUrRNA基因序列,设计P.C特异引物Pc1和Pc3,用PCR常规操作对P.CDNA模板扩增.同时用多对间日疟原虫(P.V)特异引物对照比较.结果从P.C血样中扩增出425bp特定扩增带,而P.V红内期和子孢子、恶性疟原虫、伯氏疟原虫、人基因组DNA和健康猴血均未见扩增带;敏感度可检测1.68×10-6的原虫感染水平.同时发现P.C对多对P.V特异引物均出现阳性扩增带,以往一直未被注意.结论该方法检测P.C特异、敏感和简捷,提供了鉴别P.V与P.C的准确诊断.建议在PCR的P.V引物设计和特异性的检测过程,把应用P.CDNA检测列为常规对照,以提高检测质量.
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疟疾双重PCR检测方法的建立和初步应用研究
目的建立一种适合于我国恶性疟、间日疟和两者混合感染地区,一次性检测人体内或蚊体内的恶性疟原虫(P.f.)和间日疟原虫(P.v.)的双重聚合酶链反应(PCR)法.方法根据疟原虫红内期SSUrRNA基因特定片段,设计合成3条寡核苷酸特异引物,在一个反应体系中,同时检测P.f.与P.v.的双重PCR技术,操作方法按PCR常规.结果从P.f.和P.v.感染血样中,分别扩增出274bp和412bp的特异片段,检出水平达1～5个虫/μl血,而人基因组DNA、约氏疟原虫、伯氏疟原虫均未见扩增条带;但食蟹猴疟原虫(P.c.)与P.v.相似,在412bp可见扩增条带.经对采自不同疟区发热待查病人的滤纸干血滴和确诊疟疾病人的静脉血检测,344例血样中,检出阴性112例、P.f.109例、P.v.114例、P.f.+P.v.9例,阳性率67.4%;比常规镜检的阳性率66.3%稍高,尤以检出P.f.+P.v.感染病例高.分别检测人工感染P.f.与P.v.各10只大劣按蚊的阳性唾腺,均被检出同种的阳性结果.结论一次性检测P.f.DNA与P.v.DNA的双重PCR法,敏感性高,特异性强,稳定性好,具有简化操作、提高工效、降低耗费的优点.对发热待查病人诊断和蚊媒感染疟原虫调查,以及疟疾病原学的检测质控方面,均有实用价值.
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青蒿素类药物治疗间日疟的研究进展
疟疾作为一种致死性很高的全球性寄生虫病,一直被全世界所关注,疟疾的控制也被列入全球三大公共卫生问题之一.由于长期抗疟药的使用,目前恶性疟原虫对主要抗疟药物普遍产生抗药性,青蒿素类药物是在氯喹、奎宁抗药性产生后的主要替代治疗药.而对于间日疟原虫引起的疟疾的治疗,却与恶性疟原虫大不相同,本文针对间日疟的青蒿素治疗现状及进展情况进行了综述.
