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不同地理株间日疟原虫SSUrRNA基因序列比较
目的 测定我国间日疟原虫不同地理株红内期SSUrRNA基因序列,比较分析其分子特征.方法 收集深圳、海南、湖北和河南四地间日疟患者血样5份(其中海南2份),并提取核酸DNA,采用PCR从核酸提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后分别与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列,采用BLAST和MEGA4软件分析序列相互关系特征.结果 5株间日疟原虫SSUrRNA基因扩增片段大小一致,约为998bp;核酸序列测定结果显示,所克隆的SSUrRNA基因片段均含有998个核苷酸,不同地理株间SSUrRNA基因序列有9个位点存在变异的可能,两两比对的同源性均高于99.5%,其中河南与湖北株序列的同源性为100.0%;与GenBank中报道的国外6株间日疟原虫相同序列作分子系统进化分析,国内5株间日疟原虫SSUrRNA基因序列与Sal 1株遗传距离小,亲缘关系接近.结论 测定的国内间日疟原虫SSUrRNA基因序列在不同地理株间相对保守,其间存在的单核苷酸多态性与地理变化有一定程度的关系.
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间日疟原虫孢子期SSUrRNA基因扩增、鉴定及其诊断应用
目的 体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期SSUrRNA编码基因特异性片段,分析其分子特征,评价其核酸诊断应用效果.方法 根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物,采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定分析其序列特征;以SSUrDNA为靶基因,建立间日疟PCR诊断方法,并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果.结果 从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp;阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有267个核苷酸,与间日疟原虫Sal1株孢子期SSUrRNA基因序列比较,同源性为99.3%,其中第220位为插入了1个碱基"T",243位碱基由"G"取代了"T".将纯化的含有SSUrRNA靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板,PCR扩增结果显示检测灵敏度至少达102copy/μl;特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267 bp的特异性基因片段,而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带.以镜检法为参照标准,PCR敏感性为100%(102/102),特异性为100%(76/76).结论 所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定,不同地理株间存在单核苷酸多态性,以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异,具有良好的推广使用价值.
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间日疟原虫红内期SSUrRNA基因片断的扩增、测序及诊断应用
目的体外扩增间日疟原虫(深圳株)红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段,克隆测序分析,并探讨其诊断应用.方法设计1对特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段;用PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109;阳性克隆双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定序列;以SSUrDNA为靶基因,PCR诊断间日疟,双盲法检测40份血样(28份镜检阳性的血样,12份健康人血).结果间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为341bp;阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;序列测定插入片段为341bp,与SalI株顺序相比,仅在第151位处缺失1个碱基C;以SSUrDNA为靶基因,双盲法检测镜检阳性及健康人血样,结果完全正确.结论所克隆的间日疟原虫SSUrDNA片段序列在间日疟原虫虫株间高度保守,以其为靶基因建立的PCR检测方法适用于间日疟的诊断.
