用微卫星分析我国不同地区间日疟原虫的种群结构

目的 了解我国不同疟疾流行区间日疟原虫种群结构和遗传多样性特征,积累我国间日疟原虫遗传相关数据.方法 收集云南、海南、河南流行区间日疟患者血样,血涂片鉴定间日疟原虫阳性者抽提血液基因组,采用巢式/半巢氏PCR方法扩增特异性2.21微卫星片段,对扩增阳性产物进行基因扫描检测,根据检测微卫星的重复序列进行STR分型,并应用GENALEX软件计算等位基因频率、等位基因数目以及期望杂合度(expected heterozygosity,He).结果 间日疟原虫2.21微卫星在不同地区间日疟原虫样本中呈现高度的多态性,其等位基因数目变化范围为4～9,期望杂合度为0.613～0.853,比较不同地区,云南地区间日疟原虫等位基因数目为9,期望杂合度为0.853,变异度高.结论我国不同地区间日疟原虫基因组具有较高的遗传多样性,其种群结构具有地区特征,这可能与各种群传疟媒介种类不同及地理环境差异等相关.

Ni-NTA蛋白芯片技术检测间日疟原虫感染的体液免疫应答

目的 建立检测间日疟感染的Ni-NTA蛋白芯片技术.方法 采用无细胞蛋白合成体系表达问日疟原虫重组蛋白,建立原位纯化重组蛋白和检测间日疟原虫感染患者血清中抗体反应的Ni-NTA蛋白芯片技术.并对3个裂殖子表面蛋白(merozoite surface proteins,MSPs)MSPl-42、MSP8和MSP10的免疫应答进行分析.结果 应用Ni-NTA蛋白芯片技术检测问日疟原虫感染患者血清抗体,鉴定出具有免疫原性的15个间日疟原虫蛋白,主要包括10个MSPs、2个Cys6蛋白以及其他3个未知蛋白,结果与以往报道的抗体芯片类似.MSPl-42、MSP8和MSP10依次识别出100.0%(20/20)、90.0%(18/20)和70.0%(14/20)的间日疟原虫感染患者血清,特异性均为100%(10/10),且曲线下面积(area under the curve.AUC)达到0.87～1.00.结论 成功建立了检测间日疟原虫感染的Ni-NTA蛋白芯片技术.该方法有助于从间日疟原虫基因组中快速筛选鉴定具有免疫原性的蛋白以及应用于功能蛋白质组学研究.

感染恶性疟原虫或间日疟原虫蚊体内子孢子和环子孢子抗原的定量测定

印度加尔各答和奥里萨地区的间日疟原虫氯喹敏感性调查

164巴西亚马孙地区三个疟疾流行区间日疟原虫变异株(VK210,VK247及类间日疟原虫株)的分布以及与氯喹治疗的相关性

018间日疟原虫Duffy结合蛋白功能区的表达、纯化及鉴定

054 间日疟原虫网织红细胞结合蛋白-2(PvRBP-2)与PvRBP-1及约氏疟原虫235kDa棒状体蛋白家族具有共同结构特征

不同感染来源间日疟原虫抗叶酸类药物相关基因的研究

目的 分析云南省不同感染来源间日疟原虫抗叶酸类药物抗性相关基因二氢叶酸还原酶基因(Pvdhfr)和二氢叶酸合成酶基因(Pvdhps)的突变特点.方法 收集2012年8月-2016年12月寄生虫病防治信息管理系统登记报告的云南省间日疟病例血样和流行病学史等信息.提取疟原虫DNA,巢式PCR扩增Pvdhfr和PPvdhps基因并测序,测序序列与GenBank中的间日疟原虫Pvdhfr(登录号为X98123)、Pvdhps基因(登录号为PVX_ 123230)参比序列比对.用MEGA 5.04、Arlequin 3.5.1分析Pdfr和Pvdhps基因的单倍型、期望杂合度(He)、遗传分化指数(Fst)等.用Network 4.6.0、Arc Gis10.1构建单倍型网络进化图和突变型分布图.结果 共收集1 203份疟疾病例血样,缅甸、非洲、云南本地感染病例血样分别为1 060、79和64份.Pvdhfr、Pvdhps 基因PCR扩增产物分别测序成功272份和708份.分析结果显示,Rdhfr基因的272条序列存在53种单倍型,He为0.243,其中云南本地分离株群体的He高,为0.667;12个位点均为野生型的频率是8.1％ (22/272),其余52种单倍型在12个位点上存在单点或双重、三重、四重、五重、六重错义突变的不同突变型.Pvdhps基因的708条序列存在35种单倍型,He为0.153,其中缅甸感染分离株群体的He高,为0.142;5个位点均为野生型的频率是36.2％ (256/708),其余34种单倍型在5个位点形成29种错义突变,产生单点、双重、三重、四重等多种突变型.Pvdhfr及Rdhps基因均以野生型为起始,再按单重突变到多重突变的路径逐步进化.Pvdhfr基因的野生型和突变型血样中,Pvdhps基因突变型的比例分别为18.2％ (4/22)和65.6％ (147/224).Pvdfps、Pvdhfr基因突变型的血样分别分布在14和9个州(市),且以缅甸感染血样占多数,分别占97.3％ (440/452)和95.4％(144/151).结论 云南省不同感染来源间日疟原虫抗叶酸类药物抗性相关基因Pvdhfr、Pvdfps的突变率、突变程度均高.

云南省输入性及本地感染间日疟原虫裂殖子表面蛋白1基因5区序列的多态性分析

目的 分析云南省输入性及本地感染间日疟病例的疟原虫裂殖子表面蛋白1(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1,PvMSP-1)基因5区序列及其等位基因的多态性. 方法 2012年8月-2015年9月,收集云南省输入性及本地感染间日疟病例的滤纸血样和流行病学史等相关信息.提取疟原虫DNA,PCR扩增PvMSP-1基因5区并测序,与M75674、AAN86237、M60807、ABJ53045、AAN86238、BAA18977等参比序列进行比对,用Mega 5.04、Arlequin3.5.1软件分析PvMSP-1基因5区的序列多态性,计算序列间保守位点、遗传距离和多样性指数,并根据氨基酸序列间的遗传距离绘制聚类树状图. 结果 2012年8月-2015年9月,共收集间日疟病例血样847份.其中,云南省本地感染61份,非洲、缅甸感染的分别为66和720份.847份血样中278份扩增出Pv MSP-1基因5区片段,206份测序成功.PvMSP-1基因5区片段编码氨基酸长193～222 aa.氨基酸序列比对分析显示,Sal-1、Belem和Recombine基因型分别占59.2％(122/206)、23.3％ (48/206)和17.5％(36/206),缅甸、非洲感染和云南本地感染血样中Sal-1基因型分别占58.8％ (104/177)、11/15和7/14.Sal-1、Belem、Recombine基因型分别有51、9和6个亚型.这66个亚型的Shannon-wiener指数(H')和期望杂合度(He)分别为0.955和0.567.206条DNA序列的同源位点为665 bp、保守位点为11.3％ (75/665)、变异位点为88.7％ (590/665),不同感染来源地的分离株与不同的氨基酸参比序列的遗传距离均小于0.4.聚类分析显示,206条PvMSP-1基因5区氨基酸序列按基因型聚类成2个大类,有3个次级分支,其中,Recombine与Belem基因型的相似度为91％～92％,高于与Sal-1基因型的82％～83％. 结论 云南省输入性及本地感染的间日疟原虫分离株PvMSP-1基因5区存在多种亚型,在Sal-1、Belem、Recombine等3种基因型中,Sal-1型占优势.

云南省边境地区疟原虫18S rRNA基因种类鉴定与序列分析

目的 使用基于18S rRNA基因的巢式PCR方法对云南省边境地区镜检为恶性疟和间日疟的患者血样进行鉴定,分析该地区疟原虫18S rRNA基因序列之间的差异. 方法 2004-2011年在云南省边境地区西双版纳勐腊、保山腾冲和德宏盈江,及缅甸那威、南卡江、芒东和拉咱等7个县(市)收集镜检为单一感染恶性疟原虫或间日疟原虫的全血或滤纸血样品.采用基于18S rRNA基因的巢式PCR方法对所有血样进行鉴定,阳性PCR产物进行测序.所获序列进行Blastn比对.应用MEGA 6.06软件采用邻接法构建系统进化树. 结果 475份镜检为恶性疟原虫(256份)和间日疟原虫(219份)感染的血样中,经18S rRNA基因检测为恶性疟原虫感染的有242例,间日疟原虫感染176例和混合感染57例.镜检法和巢式PCR法检测结果一致的血样占81.7％(388/475).两法检测不一致的血样发生频率与其原虫密度显著相关(Spearman's r=-0.408,P＜0.05).多序列比对分析结果显示,共计得到11条、10条恶性疟原虫、间日疟原虫18S rRNA基因同源序列,变异位点分别占2.9％ (6/205)和22.5％ (27/120).所获恶性疟原虫18S rRNA基因序列与来自喀麦隆(GenBank登录号KC428742)等基因序列聚在一个大的分支,与来自荷兰和巴西的3个恶性疟原虫S型18S rRNA基因序列(GenBank登录号U36465、U36466和U36467)的亲缘关系较远.所获间日疟原虫序列与来自泰国的间日疟原虫A型小亚单位核糖体核糖核酸(SSU rRNA)基因序列(GenBank登录号U07367)等聚在一支,与来自泰国的间日疟原虫C型基因序列(GenBank登录号U07368)等参考序列亲缘关系较远. 结论 镜检为单一感染的血样中,巢式PCR检出 57例混合感染.云南省边境地区7个县(市)疟原虫18S rRNA基因序列之间无明显差异.

两种疟疾快速诊断试剂盒检测效果的比较

目的 比较两种疟疾快速诊断试剂盒(RDTs)检测疟疾患者血样的效果. 方法 在云南采集流行区疟疾患者血样200份,上海地区采集健康者血样60份,以显微镜镜检为金标准,比较胶体金免疫层析法(GICA)和瑞士产OptiMAL试剂盒检测疟原虫的敏感性和特异性.并用这两种RDTs试剂盒分别检测10份原虫密度梯度样品,比较其疟原虫低检出限并分析检测效果. 结果 本次共检测血样260份,镜检确诊为恶性疟原虫阳性100份,间日疟原虫阳性100份,阴性60份.GICA检测疟疾患者血样的敏感性和特异性分别为87.5％ (175/200)和93.3％ (56/60),恶性疟和间日疟患者血样的敏感性和特异性分别为83.0％ (83/100)、89.0％ (89/100)和96.9％(155/160)、98.8％ (158/160).OptiMAL的敏感性和特异性分别为95.5％ (191/200)和100.0％ (60/60),恶性疟、间日疟的敏感性和特异性分别为90.0％ (90/100)、96.0％ (96/100)和99.4％ (159/160)、97.5％ (156/160).两种试剂盒检出疟原虫的差异具有统计学意义(x2=8.23,P＜0.05).两种试剂盒检测恶性疟(x2=2.10)和间日疟钟=3.53)的差异无统计学意义(P＞0.05).GICA检测恶性疟原虫和间日疟原虫3个级别原虫密度血样的检出结果差异均无统计学意义(P＞0.05)；OptiMAL检测间日疟原虫不同密度的差异无统计学差异(P＞0.05),检测恶性疟原虫不同密度的差异有统计学意义(P＜0.05),高密度原虫检出率较高.两种试剂盒检测疟原虫的低检出限约为100～～200个/μl血. 结论 OptiMAL试剂盒检测疟原虫的敏感性、特异性和检出率均高于GICA试剂盒,GICA检测疟原虫的低检测限较低,且重复性较好.

间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的序列和重组抗原表位分析

目的 对间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)基因的序列及重组抗原的表位进行比较分析. 方法 根据GenBank中已知的pLDH基因序列(登录号为DQ198262和DQ060151)设计特异性引物,体外扩增间日疟原虫和恶性疟原虫LDH的全长基因,对两序列进行比对分析,用SYFPEITHI软件进行表位预测分析.将Pv-LDH和Pf-LDH基因克隆入pET28a表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Western blotting和中和ELISA法鉴定重组蛋白. 结果 Pv-LDH和Pf-LDH基因的编码区全长均为951 bp,编码316个氨基酸,Pf-LDH与参考序列DQ198262完全一致,而Pv-LDH与参考序列DQ060151仅在第666位有一个核苷酸的变异;两者的核苷酸和氨基酸序列的一致性分别为75.1%和90.2%.T细胞表位预测分析结果显示,能识别pLDH抗原表位的人类白细胞抗原(HLA)分子类型共28种,预测的表位数约为180个,相同或相似的表位约占总表位数的75%,Pv-LDH和Pf-LDH特异性表位分别为38个和45个.Western blotting分析显示,Pv-LDH重组抗原可被疟疾患者血清识别,但反应强度明显低于Pv-LDH重组抗原免疫兔血清.中和ELISA试验结果显示,Pv-LDH抗原对多克隆抗体高抑制率可达70.3%,而Pf-LDH抗原的高抑制率仅为30.5%. 结论 Pv-LDH和Pf-LDH基因的核苷酸序列及其重组抗原均有差异,特异性表位诱导的抗体在整个抗体谱中相对较少.

外源性一氧化氮体外杀伤红内期间日疟原虫的实验研究

目的 探讨外源性一氧化氮(NO)对红内期间日疟原虫的杀伤作用.方法 采集以早期滋养体期为主,原虫密度>0.5%的患者血样,配成含2%红细胞的虫血混悬液.96孔板中每孔加100μl虫血混悬液,再加入各组试剂,亚硝基铁氰化钠(SNP,分别为0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mmol/L),SNP+血红蛋白(Hb)0.15mmol/L,SNP+硫酸亚铁(FeSO4)0.15 mmol/L,SNP+L-半胱氨酸([-cyst)1.00 mmol/L,SNP+FeSO4 0.15 mmol/L+L-cyst 1.00 mmol/L.后4组SNP浓度均为1.00 mmol/L,设对照组,每组重复3次,置37℃ 5%CO2培养箱中培养.根据虫龄,估计发育至裂殖体时间,提前3 h取空白对照孔涂片镜检,确定终止培养时间,培养终止后吉氏染色,镜检计数成熟裂殖体,计算NO对红内期间日疟原虫的抑制率.统计分析各组对间日疟原虫抑制率的差异. 结果 SNP 0.02 mmol/L组,间日疟原虫抑制率为(0.84±1.69)%,对培养的红内期间日疟原虫无杀伤作用(P>0.05);SNP 0.05 mmol/L组,间日疟原虫抑制率为(1226±3.04)%,对培养的红内期间日疟原虫存在杀伤作用(P<0.01).且抑制率随SNP浓度上升而升高.在含有1.00mmol/L SNP的孔中分别加入Hb、L-cyst、FeSO4和FeSO4+L-cyst与只添加SNP 1.00 mmol/L孔相比,红内期间日疟原虫抑制率自(85.40±2.90)%下降为(5.90±2.90)%、(25.86±4.02)%、(30.16±2.75)%和(16.71±2.30)%.结论 外源性NO对体外培养的红内期间日疟原虫有杀伤作用,而Hb、L-cyst和FeSO4可以逆转这种杀伤作用.

我国南方五省间日疟原虫环子孢子蛋白基因型与疟疾防治效果关系的探讨

目的探讨我国南方间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因型种群结构、疟区分类及其防治意义.方法应用单管-套式/多重PCR对采白海南、云南、广西、广东、贵州等5省(自治区)共346份间日疟原虫阳性患者滤纸血样作环子孢子蛋白(CSP)基因型鉴定,结合5省(自治区)疟疾历史资料和近年流行状况进行分析.结果广东、广两和贵州等3省(自治区)疟原虫PV-1型温带族虫株均占90%以上,热带族仅有个别发现,未见PV-2型;云南省疟原虫PV-1温带族占714%、热带族占28.6%,PV-2型仅个别发现;而海南省PV-1型温带族、热带族和Pv-2型等3大基因型类群分别约占1/3.结论广东、广西和贵州等3省(自治区)间日疟原虫PV-1型温带族占绝对优势,疟疾控制效果好,而海南、云南两省间日疟原虫基因型类群较复杂,疟疾控制难度大,说明间日疟原虫种群基因型结构复杂性和多重感染程度是影响当地间日疟流行势态及其防治效果的重要因素,是防治与监测中重要的流行病学指征之一.

标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的研究

目的建立简便、灵敏、低本底、可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫的套式/多重聚合酶链反应(PCR)系统.方法应用标签引物扩增技术、Primer Premier 5.0软件、美国生物信息中心(NCBI-BLAST)网络资源和矩阵试验法优化套式/多重PCR,检测疟疾患者滤纸血样并与镜检结果进行比较.结果新建立的标签引物套式/多重PCR,检测模拟现场滤纸血样的敏感性为恶性疟原虫1～2个虫/μl血,间日疟原虫5～10个虫/μl血.检测71份现场采集的镜检疟原虫阳性滤纸血样(恶性疟24份和间日疟47份)的结果与镜检结果的符合率分别为87.5%和100%.结论通过标签引物扩增技术优化的套式/多重PCR系统,适用于检测现场采集的滤纸血样,其检出低原虫血症的敏感性和鉴定虫种的准确性均优于镜检法,是很有潜力的疟疾诊断技术.

间日疟原虫裂殖子表面蛋白的等位基因型检测

目的建立一种间日疟原虫裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)基因型检测技术.方法设计针对PvMSP-1ICB5～ICB6多态区的引物进行PCR,其产物用PvuⅡ内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测,鉴别我国间日疟原虫现场分离株基因型.结果98份间日疟血样经套式PCR扩增均出现大小约为400 bp(Belem型)或470 bp(Sal-1型)的特异性片段.酶切消化后,45份470 bp样本出现120 bp和350 bp酶切片段,为Sal-1型;40份400bp的样本中3份仅出现1条400bp片段,为Belem型;35份出现120 bp和280 bp两种酶切片段,为Ⅲ重组型;2份120 bp和240 bp片段,为朝鲜型.结论套式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术可用于检测我国间日疟原虫的3种PvMSP-1等位基因型.

间日疟原虫传播阻断疫苗候选抗原Pvs25中国分离株高度保守

目的研究我国单纯间日疟流行区31例患者(湖北18例、浙江13例)间日疟原虫分离株传播阻断疫苗候选抗原Pvs25基因多态性,并与14例孟加拉间日疟原虫株进行比较分析.方法从干燥滤纸血膜提取疟原虫基因组DNA,对Pvs25基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增、纯化和直接序列分析.结果与间日疟原虫标准株Sal-I相比,获得的45个Pvs25全长序列中有3处点突变,引起相应氨基酸的替换.并且核苷酸多态性(π值)检验结果显示,Pvs25在不同流行区或同一流行区不同分离株之间核苷酸及其相应的氨基酸序列高度保守.结论与红前期和红内期候选抗原相比,Pvs25具有有限的抗原多态性,提示以Pvs25为基础构建的传播阻断疫苗在我国流行区具有普遍应用的可能性.

我国间日疟原虫基因型种群结构及其地理分布

目的用分子技术调查中国间日疟原虫种群结构与地理分布. 方法用滤纸血滴法采集我国10个省(自治区)间日疟现症病人血样,用套式-、半套式-等位特异PCR基因分型法鉴定其型、族归属及其CSP基因型,并作流行病学统计分析.结果在384个间日疟原虫分离株中,检出温带族258株,分为14个不同的(等位变异)基因型,遍布全国各省,其中主带≤731 bp的基因型仅见于南方5省;热带族79株,分为5个不同基因型,分布于北纬25°以南的5个省(自治区);PV-2型16株,包括2个基因型;另33个分离株为不同型(族)或不同基因型虫株的重复(混合)感染.结论目前我国北纬25°以北各省是单一温带族间日疟原虫分布区,北纬25°以南地区是温带族与热带族间日疟原虫重叠分布区,其中海南和云南两省局部地区同时尚存在PV-2型;温带族内存在地理分布明显不同的2个基因类群.

间日疟原虫环子孢子蛋白基因型的鉴别研究

[目的]建立间日疟原虫环子孢子蛋白(CSP)基因分型法用于地理株的鉴定.[方法]Chelex-100离子交换法提取滤纸血样中的微量DNA;套式PCR和等位特异PCR技术、琼脂糖电泳分析法、斑点印迹和Southern印迹-探针杂交技术分别用于判别性片段的扩增、分析和鉴定.[结果]用本文描述的套式-等位-特异PCR分型法,从一小片滤纸血样提取的微量DNA中,扩增出不同长度范围的3种判别性片段:650～770bp(间日疟种特异),150～230 bp(温带族特异),588～615 bp(PV-2型特异).用本法检测参考虫株出现的带型和长度与设计的靶序列完全吻合.检测59份国内感染血样,42份鉴定为温带族虫株,15份为热带族虫株,2份为PV-2型虫株.4份境外感染血样中,2个巴基斯坦分离株均为温带族,缅甸和老挝各1株均为热带族虫株.[结论]①本法能同时区分PV-1型,PV-2型以及温带族与热带族虫株,且较现有(PCR-探针杂交)法更为简便、快捷;②现场血样初步检测结果显示:我国存在PV-1型(温带族与热带族)虫株和PV-2型虫株,也可能存在温带族东南亚组虫株.

一个红细胞内同时寄生不同期间日疟原虫输入性病例1例

2012年对云南省腾冲市1例间日疟患者血样采用CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒、吉氏染色镜检和巢式PCR方法进行鉴定.CareStartTM疟疾快速诊断试剂盒检测结果判定为除恶性疟原虫以外的间日疟原虫、三日疟原虫或卵形疟原虫感染.镜检结果显示,患者血样厚、薄血片中可见间日疟原虫环状体多核、多重感染现象,1个环状体有2个及以上核的占14.68％ (188/1 280);同时寄生2个及以上环状体的红细胞占22.50％ (288/1 280);1个红细胞内同时寄生环状体和滋养体、环状体和配子体.巢式PCR结果显示,患者血样为间日疟原虫特异性DNA片段阳性.结合检测结果、流行病学资料和临床表现,确诊该患者为输入性间日疟原虫感染病例,且一个红细胞内同时寄生不同期间日疟原虫.