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人枯否细胞在同种肝移植免疫中作用机制初步探讨
目的 探讨肝脏枯否细胞(KC)在肝移植后早期免疫反应中的可能作用.方法 将KC和(或)异体PBMC共培养,收集细胞上清液,培养结束时分别收获培养的KC和PBMC.检测HLA-G在细胞表面的表达;测定上清液中NO、IFN-γ、IL-10和TGF-β1的浓度;MTT试验观察KC对淋巴细胞增殖的影响.结果 实验组及对照组中KC和PBMC表面均未检测到HLA-G的表达.与不含KC实验组相比,含KC实验组中,NO、IL-10和TGF-β1的产量显著升高,而IFN-γ呈相对偏低趋势;对照组中未能检测到IL-10和IFN-γ的分泌,仅含KC的对照组中含少量NO及TGF-β1,且显著低于实验组.MTT实验发现,不含KC实验组OD值显著高于含KC实验组及对照组.结论 体外KC接触异体PBMC后早期,各细胞膜表面均无HLA-G表达,但参与了NO及Th2/Th3样细胞因子的分泌调节,并能抑制淋巴细胞增殖反应,可能促进肝脏移植早期免疫耐受的形成.
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转FasL基因的树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究
目的观察转FasL基因的树突状细胞(DC)体内注射诱导大鼠肝移植免疫耐受作用,并研究其机制.方法用"二袖套法"行受体为Wistar大鼠肝移植36例,并随机分为3组:①对照组(n=12);②环孢霉素治疗组(n=12);③转FasL基因治疗组(n=12),腹腔注射转FasL基因的树突状细胞.手术后7 d分别杀死各组4只大鼠,用原位末端标记法及透射电镜观察移植肝细胞及肝脏内淋巴细胞凋亡,其余大鼠用于观察生存期.结果对照组大鼠在9～15 d迅速死亡,TUNEL及电镜观察发现肝细胞变性坏死明显;而环孢霉素治疗组及转FasL基因治疗组免疫排斥反应轻微,移植后大鼠已存活超过6个月,原位末端标记法及透射电镜均发现FasL基因治疗组肝脏内浸润淋巴细胞凋亡明显.结论转FasL基因DC细胞治疗能有效地诱导肝移植免疫耐受,其机制是诱导了肝脏内浸润淋巴细胞凋亡.
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近交系大鼠肝移植自发免疫耐受模型的建立及其CD8+CD28-T细胞的作用
目的建立近交系大鼠原位肝移植自发免疫耐受模型,并研究CD8+CD28- T细胞在自发免疫耐受形成中的作用.方法双袖套法建立原位肝移植模型;流式细胞技术检测CD8+CD28- T抑制细胞含量变化;利用补体细胞毒和免疫磁珠方法分离CD8+CD28- T细胞,通过体外混合淋巴细胞反应验证其抑制功能.结果我们成功建立了BN(供体)LEW(受体)原位肝移植自发免疫耐受模型,并发现自发免疫耐受模型大鼠脾脏CD8+CD28- T细胞含量(23.7%±7.2%)显著高于正常大鼠(5.4%±1.5%)和急性排斥组大鼠(6.0%±1.3%),而且,分离纯化后的自发免疫耐受组大鼠脾脏CD8+CD28- T细胞可以抑制混合淋巴细胞反应的增殖,但急性排斥组大鼠脾脏CD8+CD28- T细胞无抑制功能.结论 BN(供体)LEW(受体)原位肝移植模型为自发免疫耐受;脾脏CD8+CD28- T细胞作为一种T抑制细胞,在自发免疫耐受的形成过程中具有重要作用.
关键词： 肝移植 免疫耐受 CD8+CD28- T细胞 T抑制细胞 -
大鼠辅助性肝移植诱导免疫耐受模型的建立
目的利用PVG(TR-1c)和DA(RT-1a)大鼠分别为供受体,联合进行辅助性肝移植和异位心脏移植,建立大鼠辅助性肝移植诱导免疫耐受模型.方法辅助性肝移植采用重建门静脉法,异位心脏移植采用腹腔吻合法.结果同品系对照组和实验组动物及其移植心脏存活超过100d,而异品系对照组移植心脏只存活7 d.结论在受体肝脏存在的情况下,辅助性供肝依然发挥其诱导耐受的效应.经长期观察,供肝无萎缩,耐受诱导效应持续存在,指示心脏搏动良好.因此,该模型在肝移植基础研究中具有实用价值.
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辅助性T细胞17及其在器官移植中的作用
辅助性T细胞17(T helper cell,Th17)是近发现的一类CD4阳性T细胞亚群.Th17分泌以IL-17A为主的多种细胞因子,并通过这些细胞因子实现其生物学效应.本文系统回顾分析了Th17及其分泌的细胞因子在免疫调节中的作用及机制.研究表明,Th17与急、慢性排斥反应密切相关,有望成为治疗排斥反应的新靶点,并为免疫耐受的诱导提供新思路.
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T细胞表达MHCⅡ类分子在器官移植免疫耐受中的意义
传统认为抗原提呈细胞表达MHCⅡ类抗原.但是,有研究发现部分T细胞也可以在特定条件下表达MHCⅡ类抗原,其发生机理及生物学效应受到众多学者的关注.本文就表达MHCⅡ类抗原的T细胞亚群的产生、作用机制及其与免疫耐受的关系等方面的研究进行综述,旨在为临床诱导器官移植免疫耐受提供参考.
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肝移植术后急性排斥反应及免疫耐受的标志物
肝移植患者免疫抑制状态评估对移植术后管理及个性化免疫抑制治疗至关重要.目前,肝移植术后免疫学监测多依赖临床医生的诊断及对移植肝的病理学检查,仍然没有一个合适且准确的评估方法.既往研究已经提出了多种肝移植术后急性排斥反应(AR)和免疫耐受的标志物.就AR而言,大多数标志物为促炎性因子、免疫调节细胞因子及一些炎症相关蛋白.然而,这些标志物大多与其他很多疾病标志物有一定的重叠,而且只有少数得到过证实.由于缺乏特异性和灵敏性,标准肝功能检测结果已不能作为AR和免疫耐受诊断的依据.本综述在现有文献的基础上总结了近年来可用于预测肝移植术后AR和免疫耐受的标志物,以便为临床诊断提供参考.
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临床器官移植免疫耐受诱导的发展和突破
器官移植后长期使用免疫抑制剂具有一系列毒副作用,影响患者和移植物的长期存活.对于患者和器官移植医生而言,诱导免疫耐受是终极的研究目标.然而,目前对此临床尚缺少有效的实验方案、合适的免疫检测手段,对于完全停药面临的一些伦理和安全问题亦缺乏成熟的建议,因此器官移植”可控耐受”在临床上很难实现.尽管面临种种困难,目前仍然有一些中心谨慎构建了以长期存活为目标的诱导器官移植免疫耐受的处理方案,并取得部分成功.本文对目前临床成功诱导器官移植免疫耐受的方案进行简要综述,包括主动逐渐停药诱导移植免疫耐受,通过混合嵌合诱导器官移植免疫耐受以及调节性T细胞在临床免疫耐受中的应用.
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微RNA-548ah和微RNA-4804在慢性HBV感染者外周血单核细胞中的表达及临床意义
目的 探讨微RNA-548ah (miR-548ah)和微RNA-4804 (miR-4804)在慢性HBV感染不同阶段的患者外周血单核细胞(PBMC)中的表达及临床意义.方法 选取南通大学附属泰州市人民医院2012年9月至2013年8月住院和门诊HBV感染者85例,其中慢性乙型肝炎(CHB)患者29例,慢性HBV携带者(HBVC) 30例,非活动性HBsAg携带者(IASC) 26例.另选同期健康体检者28名作为对照.采用反转录-实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术检测PBMC中miR-548ah和miR-4804的表达.miRNA分子诊断HBV感染免疫耐受期和清除期的价值采用受试者工作特征(ROC)曲线分析,微RNA (miRNA)分子与临床主要指标丙氨酸转氨酶(ALT)和HBV DNA的相关性采用Pearson分析.结果 miR-548ah和miR-4804在CHB组、HBVC组、IASC组和健康对照组患者PBMC中的表达差异有统计学意义(F=28.16和83.17,P＜0.01).与健康对照组比较,miR-548ah的表达在CHB组明显上调(P＜0.01),在HBVC及IASC组明显下调(P＜0.01);miR-4804的表达在CHB组明显上调(P＜0.01),在HBVC组明显下调(P＜0.01),但在IASC组的表达与健康对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).miR-548ah和miR-4804区分慢性HBV感染免疫耐受期和清除期的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.966和0.997,敏感度分别为89.7％和96.6％,特异度分别为99.6％和100.0％.miR-548ah和miR-4804的表达水平与ALT和HBV DNA水平均无相关性(r=0.14,0.18,-0.20和-0.19,P＞0.05).结论 miR-548ah和miR-4804的异常表达可能与CHB的免疫发病机制有关,且有助于区分CHB的免疫耐受期和清除期.
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HBeAg阳性慢性HBV感染者免疫耐受期和免疫清除期的误判
慢性乙型肝炎病毒（ HBV ）感染的自然史分为5期，分别是免疫耐受期、免疫清除（活动）期、低复制期、HBeAg阴性慢性乙型肝炎（ CHB）和HBsAg阴性期［1］。免疫耐受期的特征是 HBeAg 阳性、HBV DNA 高水平、丙氨酸转氨酶（ ALT）正常或稍高、肝脏无或存在轻微炎症以及无或存在轻微纤维化；免疫清除期的特征是HBeAg阳性、HBV DNA水平较免疫耐受期稍低、ALT升高、肝脏炎症和（或）纤维化程度明显［1］。肝脏穿刺活检（肝活检）主要用于CHB疾病阶段的判定［2］，这其中包括免疫耐受期和免疫清除期的判定，以决定下一步的诊疗方案。然而，临床上并不是每位患者均进行肝活检，再加上HBV DNA水平高低没有一个准确的界限较难把握，ALT水平可能会受多种非HBV因素影响，因此在无肝活检的情况下，慢性HBV感染免疫耐受期和免疫清除期可能会被误判，导致后续治疗失败、耐药和疾病进展恶化等不良后果。本研究拟对郑州大学与延安大学附属医院两个中心的394例经肝活检确定免疫耐受期和免疫清除期的HBV感染者进行分析，研究在有或无肝活检时免疫耐受期和免疫清除期诊断准确率的差别。
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FK506预处理下骨髓移植诱导同种异体小鼠皮肤移植耐受的实验研究
目的探讨短期大剂量FK506作为宏嵌合诱导供体特异性耐受中,骨髓移植前对受体预处理方法的可行性及临床实用性. 方法 100只雄性C57BL/6和60只雌性BALB/C小鼠分别作为皮肤移植的供体和受体,雄性ICR小鼠15只作为无关第三品系用以检测移植耐受状态的特异性.将60只受体小鼠随机分为5组,即无处理对照组、单纯FK506组、单纯骨髓细胞移植(BMT)组、实验组(FK506+BMT)和无关供体对照组,每组12只.FK506诱导及维持方案是皮肤移植前对受体小鼠先给予大剂量FK506腹腔注射(3 mg/kg×2 d),移植当天尾静脉输注2×107个骨髓细胞,再以小剂量FK506(0.5 mg/kg×7 d)短期维持治疗.观察皮肤移植存活时间、对第三方皮肤的排斥反应及对供体鼠的单向混合淋巴细胞反应,并用多聚酶链式反应(PCR)检测嵌合体的形成. 结果常规剂量的骨髓输注或短期FK506治疗并不能延长移植物的存活时间,也没有宏嵌合形成.实验组皮肤移植物存活时间(24.0±1.5)d比无处理对照组(9.6±1.1)d、单纯FK506组(10.5±1.6)d、单纯骨髓细胞移植组(10.3±1.5)d、无关供体对照组(9.8±1.1)d明显延长(P<0.05).混合淋巴细胞反应实验组供者特异性抑制率80.55%±14.10%明显高于单纯FK506组38.65%±12.43%及单纯骨髓细胞移植组35.41%±8.99%(P<0.05),实验组宏嵌合呈阳性. 结论采用短期大剂量FK506这一温和的非照射预处理方法,可获得一定程度的免疫耐受,延长移植物存活.移植前输注供体骨髓细胞能够促进宏嵌合的形成及移植物的存活.
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通过PD-1/PD-L1共刺激通路诱导小鼠胰岛移植免疫耐受的研究
目的 观察重组腺病毒Ad-PD-L1对诱导小鼠胰岛移植免疫耐受的作用.方法 酶切含有小鼠全长PD-L1 cDNA的pSport 1-mCD274质粒,亚克隆到穿梭质粒pShuale-GFP-CMV(-)上,再通过酶切、连接等方法构建腺病毒骨架质粒pAdxsi-GFP-CMV-PD-L1,转化DH5α感受态细菌,筛选阳性克隆.经酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒.链脲霉素(250 mg/kg)腹腔注射诱导C57BL/6(H-2b)小鼠糖尿病模型,将C57BL/6小鼠随机分为3组,A为对照组,B为Ad-EGFP处理组,C为Ad-PD-L1处理组,在进行胰岛移植的前1天,经尾静脉输注5×108 pfu的Ad-PD-L1.将DBA/2(H-2d)小鼠的胰岛移植在糖尿病小鼠肾被膜下.术后监测不同时间各组小鼠的血糖变化及胰岛移植物的存活时间,并观察混合淋巴细胞反应的特异性.结果 酶切及测序证实Ad-PD-L1构建成功.Ad-PD-L1在小鼠体内可以高效地表达PD-L1,Ad-PD-L1治疗组胰岛移植物的存活时间明显延长到27.63±3.51 d(P<0.01),混合淋巴细胞反应表明小鼠对供体反应特异性降低. 结论通过PD-L1/PD-1共刺激通路可以抑制T细胞的活化,从而延长了胰岛移植物的存活时间.
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转化生长因子-β1基因修饰树突状细胞诱导异种胰岛移植耐受
目的探讨转化生长因子(TGF)-β1基因修饰的树突状细胞(dendritic cell,DC)对异种胰岛移植的免疫耐受诱导作用.方法分别从BALB/C小鼠骨髓培养未成熟DC及成熟DC,将TGFβ1-pcDNA3质粒转染未成熟DC.分别将成熟DC和TGFβ1-DC负载Wistar大鼠胰岛抗原回输糖尿病小鼠体内,7 d后将大鼠胰岛移植于左肾包膜下,观察移植物存活、T细胞增殖反应和细胞毒效应.结果以Wistar大鼠为供体,正常小鼠的移植物存活时间为(10.2±1.1)d,成熟DC预处理后移植物存活时间明显缩短(7.0±1.3)d,P＜0.05,而TGFβ1-DC预处理后存活时间显著延长(45.2±4.5)d,P＜0.05.以SD大鼠作为供体时,移植物存活时间与对照组之间相比差异无统计学意义(11.3±1.2)d,P＞0.05.成熟DC预处理鼠T细胞增殖活性和细胞毒效应显著增强(SI=6.92,KRmax=73%,P＜0.05),TGFβ-DC预处理后上述效应明显降低(SI=1.13,KRmax=6.9%,P＜0.05),但两组对SD大鼠的效应无明显差别.结论TGF-β1基因修饰DC回输受体可诱导异种胰岛移植耐受,其机制与T细胞无能相关.
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CNOT7基因参与诱导HepG2细胞对Vγ9Vδ2T细胞的免疫耐受
目的 研究人CCR4-NOT转录复合体亚基7(CCR4-NOT transcription complex subunit 7 human,CNOT 7)在HepG2肝母细胞癌系(hepatoblastoma G2 cell line,HepG2 cells)对Vγ 9V82T淋巴细胞免疫耐受中的作用及相关机制.方法 用CNOT 7重组质粒(recombinant plasmid of CNOT,shCNOT7)及相应对照组载体质粒转染HepG2细胞,用Vγ 9V82T细胞因子干预转染前后的各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,Western blot方法检测CNOT7及信号传导及转录激活因子1(signaltransducer and activator of transcription 1,STAT1)、STAT3的蛋白表达水平.Western blot法检测HepG2肝癌细胞系及人正常肝细胞系L02中CNOT7、STAT1和STAT3蛋白的表达水平. 结果 Vγ9Vδ2T细胞因子干预后,CNOT 7基因敲减后的HepG2细胞组凋亡率由(7.55％±2.63％)增加至(20.59％±3.12％).与L02细胞组比较,HepG2细胞组中的CNOT7蛋白高表达(F=28.76,P＜0.01),STAT3蛋白高表达(F=110.29,P＜0.01),STAT1蛋白低表达(F=35.67,P＜0.01).CNOT7基因敲除后,HepG2细胞组的STAT1蛋白表达上调(=6.69,P＜0.05). 结论 CNOT7基因参与诱导HepG2细胞Vγ9Vδ2T细胞的免疫耐受,敲减CNOT7基因可逆转HepG2细胞对Vγ 9Vδ2T细胞的免疫耐受.
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CD80mAb协同imDC诱导同种异体大鼠胰十二指肠移植免疫耐受
目的 观察共刺激分子阻断剂CD80单克隆抗体(CD80mAb)在协同未成熟树突细胞(imDC)诱导同种异体大鼠胰十二指肠移植免疫耐受中的作用.方法 建立糖尿病大鼠胰十二指肠移植动物模型;4E5杂交瘤细胞株BABL/C小鼠腹腔注射,抽取腹水,分离纯化后获得CD80mAb;分离供体大鼠骨髓来源DC细胞前体,经GM-CSF、IL-4体外刺激后,再加入IL-10共培养,鉴定为imDC;移植前7 d,将2×106 imDC经静脉途径注射至受体体内,同时分别给予生理盐水1 ml、CD80mAb 5 mg连续14 d.结果 四组受体大鼠移植后中位生存时间分别为12.7 d、32.4 d、50.2 d、92.0 d,实验组存活时间明显延长;组织学观察发现移植后7 d CD80mAb+imDC组移植物形态尚完整,淋巴细胞浸润减少;混合淋巴细胞反应证实移植后7 d CD80mAb+imDC组供受体间呈低反应性.结论 共刺激分子阻断剂CD80mAb能够协同imDC诱导受体T细胞对移植物的免疫耐受,降低宿主对移植物的急、慢性排斥反应,延长移植物的存活时间.
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长期生存的肝移植受者外周血免疫细胞分析
目的 探究肝移植术后长期生存受者外周血免疫细胞的变化趋势及特征,拟在研究免疫细胞在临床免疫耐受中的指示作用. 方法 通过流式细胞术对肝移植术后5年以上生存者30例,术后1年以上生存者15例和健康对照组15例的外周血T淋巴细胞亚群(Thl、Th2、Thl7、Th22、Tregs),NK细胞、NKT细胞,Bregs、髓系来源的免疫抑制性细胞(myeloid derived suppressor cell,MDSC)细胞表达水平.结果 流式细胞术结果显示Th17在长期组中明显升高,较短期组与健康对照组差异有统计学意义(P＜0.01),长期组中的Tregs与短期组相比明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01),但与健康对照组的Tregs比较差异无统计学意义(P＞0.05).长期组中NK细胞较短期组和对照组相比均明显升高(P＜0.01).长期组与短期组、健康对照组比较MDSC水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01).三组的T淋巴细胞亚群、NKT、Bregs比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 外周血Th17、Tregs、NK、MDSC细胞水平在长期生存受者中明显升高,可能和临床免疫耐受相关.
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体外光化学疗法的临床研究新进展
目前器官移植已获得长足的发展,已经成为终末器官衰竭患者的主要治疗方法.移植术后如何减少移植后排斥反应的发生是器官移植成功的关键.解决移植排斥反应的主要方法在于诱导受体对供体细胞组织或器官产生免疫耐受.体外光化学疗法作为一种新的免疫调节疗法,可诱导器官移植负向免疫调节,减轻器官移植排斥反应,从而使患者产生免疫耐受.体外光化学疗法也已经被广泛应用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤和多种免疫系统疫病.但其确切机制目前尚未清楚.但其在治疗过程中可明显减轻药物的毒害作用,应用安全性高且范围广泛,在临床应用中有广阔的前景.该文就体外光化学疗法在临床新的研究进展作一综述.
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大鼠T细胞疫苗的制备及其抗移植皮肤排斥作用的实验研究
目的 探讨T细胞疫苗(TCV)的制备方法及其抗移植皮肤排斥反应的作用.方法 制备针对特定SD大鼠的供体特异性T细胞疫苗,将其免疫受体Wistar大鼠;然后取免疫前和每次免疫后第五天的受体Wistar的淋巴细胞(反应细胞)与供体SD的淋巴细胞(刺激)进行体外单向混合淋巴细胞反应(MLR),以MTT法检测细胞免疫增值反应情况,比较疫苗接种后诱导淋巴细胞反应受抑制的情况:再将SD大鼠皮肤移植到TCV免疫后的Wistar大鼠,观察皮肤移植反应并统计移植物存活的时间.排斥反应的移植物行病理检查.结果 TCV组受体淋巴细胞反应程度比接种前显著减弱(P＜0.05);特异性TCV组皮肤移植物存活时间较非特异性TCV组及对照组延长(P＜0.05).移植皮肤排斥反应病理表现更轻.结论 TCV经腹腔接种可以诱导出针对同种抗原特异性免疫耐受,TCV能够延长同种异体移植皮肤的存活时间,有一定抗移植排斥反应作用.
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亲属间异体皮肤移植的免疫耐受机制
临床研究表明,大面积深度烧伤患者中,感染是主要的致死原因,烧伤早期创面切痂、皮肤移植覆盖可以显著降低感染的发生率.鉴于大面积深度烧伤患者自体皮源的相对不足,在临床治疗过程中,亲属间异体皮肤移植受到临床医师的重视,其应用也在进一步扩大.但是亲属间异体皮肤移植依然需要解决免疫耐受问题,才能使移植效果达到理想状态.现阶段已知的免疫耐受可能与异体真皮胶原、自体表皮细胞、未成熟树突状细胞、角质形成细胞等有关.本研究可用于指导临床应用,在自体皮源缺少的情况下,应用亲属间异体皮肤移植,覆盖创面,缩短病程、减少住院费用等.
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免疫耐受期HBV感染的孕妇产后肝功能变化
目的观察免疫耐受期HBV感染的孕妇产后肝功能的变化。方法通过医院信息系统（HIS）对在本院妇产科产检、生育并完成产后随访的免疫耐受期HBV感染妊娠妇女共378例的临床资料进行回顾性研究，观察其产后肝功能异常的发生率及可能的影响因素。结果本研究中免疫耐受期HBeAg阳性，且HBV DNA载量≥6 log10拷贝/ml的妊娠妇女产后ALT升高的发生率为32.6%（47/144），一般发生在产后42～60 d。19.1%（9/47）患者肝病较严重，需住院治疗。48.9%（23/47）患者需要接受抗病毒治疗，自发性HBeAg血清学转换仅为10.6%（5/47）。产后ALT与孕期HBV复制水平及其波动均无显著相关；但与孕期患者的平均ALT和AST水平有关，ALT和AST水平较高的患者产后容易发生肝功能异常，产后肝功能异常的发生时间多在产后2个月内，其机制与HBV的免疫清除有关。结论免疫耐受期的HBV感染女性孕期肝功能的监测十分重要，应加强对孕期ALT有较大波动或有升高趋势的女性产后肝功能和HBV病毒学的监测和随访，必要时给予抗病毒治疗，预防肝病进展。
