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转小鼠TNFα基因大鼠脑缺血时细胞凋亡、c-JUN、p-JUN与p-JNK表达的研究
目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)过度表达时对细胞凋亡、c-JUN、p-JUN与p-JNK表达的影响.方法:采用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型,用TNFα、TUNEL、c-JUN、p-JUN与p-JNK免疫组化染色观察SD大鼠与转小鼠TNFα基因大鼠缺血1 h再灌注24 h时的细胞凋亡、c-JUN、p-JUN与p-JNK的表达.结果:与SD大鼠相比,转小鼠TNFα基因大鼠缺血1 h再灌注24 h后,脑组织凋亡细胞显著增多,c-JUN、p-JUN与p-JNK过度表达显著,以上指标变化均显著高于SD大鼠.结论:TNFα的过度表达加剧缺血性脑损伤,其机制可能为c-JUN、p-JUN与p-JNK的过度表达.
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粒细胞集落刺激因子对急性脊髓损伤中小胶质细胞的作用
目的 探讨粒细胞集落刺激因子对急性脊髓损伤条件下小胶质细胞神经保护/损伤功能转变的影响.方法 建立小鼠半切脊髓损伤模型.体内实验是造模成功术后第1天开始给予粒细胞集落刺激因子,连续3d,进行Basso-Beattie-Bresnahan( BBB)评分后处死,取脊髓切片进行免疫荧光检测小胶质细胞的募集.体外实验是取小鼠脊髓的组织上清液,加到小胶质细胞株BV-2培养基中共培养24h,治疗组加入粒细胞集落刺激因子12h后收集细胞.采用RT-PCR和免疫印迹法,检测小胶质细胞炎症因子的分泌及信号通路的改变.结果 粒细胞集落刺激因子能够促进急性脊髓损伤后运动功能的恢复,促进小胶质细胞募集.体外实验结果显示,粒细胞集落刺激因子可以降低小胶质细胞NF-κB信号通路p65的活性,改变小胶质细胞因子的分泌,促炎性因子IL-1B表达降低,抗炎因子TGFβ表达升高.结论 应用粒细胞集落刺激因子治疗脊髓损伤可以促进小鼠运动功能的恢复并调节小胶质细胞的分布和功能,诱导小胶质细胞向神经保护的方向转化.
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糖基化终产物对小胶质细胞分泌IL-1β和TNF-α的影响
目的 研究糖基化终产物(AGEs-BSA)对原代培养的小胶质细胞分泌白细胞介素113(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响,在细胞水平探讨AGEs-BSA在阿尔茨海默病(AD)发生中的作用及其可能机制.方法 体外培养小胶质细胞,用AGEs.BSA干预,用免疫细胞化学方法,进行鉴定并观察其形态变化;用AGEs-BSA300μg/mL激活和抗RAGE中和抗体阻断的方法对原代培养的小胶质细胞进行处理,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清液中IL-lβ和TNF-α的水平.结果 AGEs-BSA干预后小胶质细胞胞体变大,形态不规则,呈"阿米巴样",细胞上清液中IL-1B、TNF-α浓度均明显升高(P<0.001),抗RAGE中和抗体+AGEs-BSA组细胞上清液IL-1β、TNF-α浓度较AGES-BSA组呈下降趋势(P<0.01),但仍高于正常对照组(P<0.01).结论 AGEs-BSA可激活小胶质细胞,诱导其释放IL-1β和YNF-α,并呈时间依赖性.提示糖基化终产物能直接或通过作用其受体激活小胶质细胞介导的免疫炎性反应.
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环氧合酶2特异性抑制剂对小胶质细胞激活介导的神经元损伤的保护作用
目的 观察环氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)特异性抑制剂NS398对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活小胶质细胞介导的海马神经元损伤是否具有保护作用.方法 分离培养新生SD鼠脑小胶质细胞,采用含有l μg/ml的LPS培养基培养,观察小胶质细胞形态学变化.检测小胶质细胞培养液中IL-1β、TNF-α水平变化.采用不同培养基培养原代新生SD鼠海马神经元:空白组(C组),采用正常小胶质细胞培养基、LPS刺激小胶质细胞后的条件培养基组(L组)、条件培养基加NS398(N组).MTT法测定各组神经元存活率.测定各组海马神经元内乳酸盐与丙酮酸盐比值以评价神经元内氧利用状况.结果 LPS刺激后,小胶质细胞突起明显缩短变粗、浓染,培养基中IL-1β、TNF-α较对照组明显增高(P＜0.01).LPS刺激小胶质细胞后条件培养基作用海马神经元存活率为64.37％,而加入NS398后神经元存活率为80.25％,差异有统计学意义(P＜0.01).L组乳酸盐/丙酮酸盐比值(27.34±8.53)明显高于C组(14.95±4.72),N组(20.32±6.05),组间比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 COX-2特异性抑制剂NS398对小胶质细胞激活后介导的海马神经元的损害具有保护作用.
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电针对阿尔茨海默病大鼠额叶免疫炎性反应的调节作用
目的 观察电针(EA)对阿尔茨海默病(AD)大鼠额叶小神经胶质细胞、白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响.方法 正常24月龄SD大鼠48只,随机分成正常组、假手术组、模型组和EA组,每组大鼠12只.在立体定位仪下向双侧Meynert核注射微量凝聚态A1β．40(1 μl,10μg/μl)制备AD动物模型,选取百会、太溪、足三里穴电针治疗,频率2 Hz,强度1 mA,留针15 min,每天1次,6 d为1个疗程,疗程间隔1 d,治疗2个疗程.免疫组化法观察额叶活化小神经胶质细胞、IL-1β、TNF-α的表达.结果 模型组额叶活化小神经胶质细胞、IL-1β、TNF-α的表达增加,经EA治疗后,EA组活化小神经胶质细胞、IL-1β、TNF-α的表达较模型组减少,且差异具有统计学意义(P<0.01).结论 EA能阻抑AD模型大鼠额叶炎性反应,调整机体的免疫状态.
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小胶质细胞的慢性激活在多巴胺能神经元损伤中的作用
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,发病率仅次于阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD),主要表现为中脑黑质及纹状体区域多巴胺能神经元胞体及神经末梢退变,导致静止性震颤、肌肉强直、运动过慢及步态不稳等症状.尽管个别基因的突变已证实与某些家族性PD有关,但绝大部分PD的病因尚不明确.环境因素(如感染、杀虫剂、MPTP、重金属物质)可能在PD的发生过程中起关键作用.
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Dynamic motility of microglia:Purinergic modulation of microglial movement in the normal and pathological brain
小神经胶质细胞具有高分支且可以动态移动的细胞突起,在生理条件下监控脑的活动.在病理刺激下,小神经胶质细胞表现出形态学变化,向损伤部位迁移,并在此处的炎性反应和神经元损伤中发挥重要作用.在脑损伤发生的数分钟内,小神经胶质细胞突起很快延伸至损伤部位.这种趋化作用为损伤部位的ATP释放和随之发生的小神经胶质细胞嘌呤能受体-P2Y12R活化所触发.除嘌呤能信号之外,大量神经元信号分子正向或负向调控小神经胶质细胞的移动,这对调节病理条件下的小神经胶质细胞功能性活化起重要作用.本综述重点讨论小神经胶质细胞的动态移动过程,并描述几种在正常和病理脑组织中调节小神经胶质细胞移动的重要信号分子及其作用.
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14-3-3蛋白在BV-2细胞中的表达及LPS对其表达的影响
目的 研究14-3-3蛋白在中枢神经系统小神经胶质细胞中的表达分布情况及LPS刺激后其表达变化;探讨14-3-3蛋白与小神经胶质细胞释放炎症因子的关系.方法 应用小鼠小神经胶质细胞株BV-2作为体外小神经胶质细胞的模型,以LPS刺激其活化,应用免疫荧光检测14-3-3蛋白ζεθγ亚型在BV-2细胞中的表达、免疫印迹技术检测14-3-3蛋白在LPS刺激后的表达变化,ELISA检测IL-1β的表达.结果 14-3-3ζεθγ蛋白亚型在BV-2细胞中均有表达,主要分布在细胞浆;LPS刺激BV-2细胞活化后释放IL-1β,同时14-3-3蛋白表达下降.结论 BV-2细胞高表达14-3-3蛋白,LPS刺激后表达下降,提示14-3-3蛋白参与了中枢神经系统免疫应答的调节.
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活化小胶质细胞对骨髓间充质细胞分化方向影响的研究
[目的]为探讨小胶质细胞激活后对骨髓间充质细胞(MSC)转化方向的影响.[方法]采用原代培养法分别培养小胶质细胞及骨髓基质干细胞,不同浓度脂多糖(LPS)激活小胶质细胞,免疫荧光法检测神经胶原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞及神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞.[结果]高浓度LPS组激活的小胶质细胞显著提高了MSC的GFAP阳性细胞数,同对照组相比差异有显著性(P＜0.05),而NSE阳性细胞在各组之间均差异无显著性.[结论]激活小胶质细胞能够促进干细胞向胶质细胞的转化.
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帕瑞昔布钠对老年大鼠脾切除术后海马炎症反应及记忆功能的影响
目的:探讨帕瑞昔布对脾切除术后老年大鼠海马炎症反应及短期记忆功能的影响.方法:老年雄性Sprague-Dawley大鼠90只,随机分为9组(均n=10):空白对照组(C组)、麻醉1d组(A1组)、手术1d组(O1组)、生理盐水1d组(S1组)、帕瑞昔布1d组(P1组)、麻醉3d组(A3组)、手术3d组(O3组)、生理盐水3d组(S3组)、帕瑞昔布3d组(P3组).A1和A3组只接受1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉;O1组和O3组麻醉后行脾切除术;P1组和P3组在手术组基础上术前1h经尾静脉注射10mg/kg帕瑞昔布钠;S1组、S3组给予等量生理盐水对照.大鼠行穿梭箱训练5d后进行麻醉、手术及药物处理.术后1和3d穿梭箱测试结束后处死大鼠,取海马,分别行CD11b免疫荧光染色,测定TNF-α,IL-1β及环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2,COX-2) mRNA的表达.结果:与C组比较,O1和O3组电击时间增加,主动逃避时间缩短,主动回避反应(active avoidance reaction,AAR)降低(均P＜0.01).与O1和O3组比较,P1和P3组电击时间缩短,主动逃避时间增加,AAR提高(均P＜0.05).O1,O3,S1和S3组海马小胶质细胞阳性数目和海马TNF-α,IL-1β及COX-2 mRNA表达明显高于C组(均P＜0.01),但P1,P3组较O1,O3组明显降低(均P＜0.01).结论:帕瑞昔布可能通过抑制COX-2表达而减轻老年大鼠脾切除术后海马炎症反应,提高短期记忆能力.
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迷走神经切断对大鼠术后持续痛脊髓小胶质细胞活化的影响
目的 探讨胆碱能抗炎通路对大鼠术后持续性痛及脊髓小胶质细胞活化的影响.方法 成年健康雄性SD大鼠36只,按随机数字表法分为三组(n=12).(1)假手术组(S)组;(2)皮肤肌肉切口牵拉组(SMIR);(3)迷走神经切断疼痛模型组(SV).S组分离暴露肌肉和迷走神经,SMIR组及SV组采用皮肤肌肉切口牵拉法建立大鼠术后持续性痛模型,SV组在制备疼痛模型前切断颈部双侧迷走神经.于术后1、3、5d时测定机械缩足反射阈值(MWT),各时点测定完机械缩足反射阈值后,随机选取4只大鼠测定脊髓背角小胶质细胞特异性标记物Iba-1的表达和计数小胶质细胞.结果 SMIR组及SV组术后1、3、5d的MWT各时点值(10.3±0.6,9.7±0.8,9.6±0.5;8.0±0.7,7.7±0.4,7.6±0.3)均低于假手术组(P＜0.05);而SV组低于SMIR组(P＜0.05);SMIR组与SV组脊髓背角小胶质细胞Iba-1的表达各时点值(1428±134,1345±129,1301±117;1989±127,1747±134,1668±113)、小胶质细胞计数各时点值(187±13,164±11,162±14;241±21,230±21,202±19)均高于假手术组(P＜0.05).而SV组高于SMIR组(P＜0.05).结论 迷走神经参与了大鼠术后持续性疼痛及脊髓小胶质细胞活化.
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转化生长因子β1降低大鼠自发性癫痫发作并抑制胶质细胞活化
目的:观察经鼻给予转化生长因子β1(TGF-β1)是否能减少匹罗卡品致痫大鼠慢性自发性癫痫的发作并探讨其可能机制.方法:经鼻给予大鼠重组人TGF-β1或等量PBS溶液,以匹罗卡品建立癫痫持续状态模型,癫痫持续状态后7 d经动态视频记录其活动,通过胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和离子钙结合接头分子1(Iba1)免疫组化观察癫痫大鼠海马组织胶质细胞的活化,采用尼氏染色观察海马区神经元的死亡.结果:TGF-β1有效降低自发性癫痫的平均频率、发作程度和持续时间.癫痫持续状态后14 d TGF-β1治疗组海马区活化的胶质细胞明显少于匹罗卡品模型组(P<0.05);TGF-β1显著降低海马CA3区神经元的死亡(P<0.01).结论:经鼻给予TGF-β1可降低大鼠自发重复性癫痫发作,抑制胶质细胞活化,从而减少神经元的死亡.
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小胶质细胞体外吞噬模型的建立及相关炎症因子的研究
目的:建立以细胞凋亡信号-磷脂酰丝氨酸(PS)介导的小胶质细胞体外吞噬模型,研究小胶质细胞发挥吞噬功能时炎症因子的表达变化.方法:用N-乙基马来酰胺(NEM)预处理红细胞,随后整合氧化PS,制备含氧化PS信号的红细胞凋亡模型,并测定小胶质细胞对整合氧化PS信号红细胞吞噬率的变化.同时,real-time PCR检测小胶质细胞中炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达情况,研究小胶质细胞吞噬功能与炎症功能之间的关系.结果:小胶质细胞对整合氧化PS红细胞的吞噬率显著高于对照组(P<0.01),同时炎症因子IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平明显减少.结论:成功制备小胶质细胞体外吞噬凋亡细胞模型,小胶质细胞的吞噬作用可能是自身炎症因子IL-1β和TNF-α在转录水平上降低的诱因.
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神经肽Y对小神经胶质细胞活化状态和生成IL-1β的影响
目的：探讨神经肽Y(NPY)对原代小神经胶质细胞生物活性及生成IL-1β的影响。方法培养的原代大鼠皮层小胶质细胞，将细胞分为Control组、LPS组、NPY+LPS组、NPY组和BIBP3226+NPY+LPS组，每组3个样本，培养各组细胞6h。经免疫细胞化学荧光染色后，显微镜下观察小胶质细胞的形态学变化。Eli?sa方法检测培养液中IL-1β蛋白含量，RT-PCR方法检测小胶质细胞中IL-1βmRNA表达水平。结果孵育各组小胶质细胞6h后，LPS组培养液中IL-1β蛋白的含量及细胞中IL-1βmRNA表达水平分别为（961.00±83.50）pg/mL和5.59±0.87，显著高于Control组的96.33±24.58 pg/mL和1.05±0.12（P＜0.05），小胶质细胞处于活化状态；LPS+NPY组IL-1β蛋白含量和mRNA表达水平分别为(411.33±55.00)pg/mL和1.93±0.45，与LPS组相比显著降低（P＜0.05），小胶质细胞活化水平降低；IBP3226+NPY+LPS组IL-1β蛋白含量和mRNA表达水平分别为(886.00±97.53)pg/mL和4.51±0.71，与LPS+NPY组相比显著增高（P＜0.05）；LPS组和IBP3226+NPY+LPS组之间无统计学意义。NPY组与对照组无统计学意义。结论 NPY通过作用于NPY Y1受体降低小神经胶质细胞的生物活性，抑制其生成IL-1β。
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AM1241预处理对脂多糖所致小胶质细胞活化及损伤的影响
目的 探讨大麻素CB2受体激动剂AM1241预处理对联用脂多糖(LPS)和γ-干扰素(IFN-γ)所致小胶质细胞活化和损伤的影响.方法 选择小鼠小胶质细胞进行实验,细胞分为对照组、AM1241组、LPS/IFN-γ组和AM1241+LPS/IFN-γ组.对照组细胞正常培养;AM1241组细胞经AM1241预处理2 h后正常培养;LPS/IFN-γ组细胞用含1 μg/mL LPS和50 U/mL,IFN-γ的培养基培养24 h;AM1241+LPS/IFN-γ组细胞经AM1241预处理2 h后,更换正常培养基培养2 h,后用含1 μg/mL LPS和50 U/mL IFN-γ的培养基培养24 h.采用MTT法检测细胞代谢率,NO检测试剂盒检测细胞培养液中NO释放量,倒置相差显微镜观察细胞形态.结果 AM1241+LPS/IFN-γ组细胞代谢率为92.55%±8.37%,明显高于LPS/IFN-γ组(75.04%±3.01%),差异有统计学意义(P<0.05).AM1241+LPS/IFN-γ组细胞培养基中NO浓度为(43.44±5.52) μmol/L,明显低于LPS/IFN-γ组[(90.87±4.28)μmol/L],差异有统计学意义(P<0.05).LPS/IFN-γ组大量细胞结构被破坏,胞体增大,伪足增粗、变短或消失;AM1241+LPS/IFN-γ组少量细胞结构被破坏,胞体稍增大,伪足较明显.结论 大麻素CB2受体激动剂AM1241预处理可减轻联用LPS和IFN-γ所致的小胶质细胞活化和损伤.
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一种连续获取大量高纯度小胶质细胞的培养方法
目的 建立一种简易、高产量高纯度的连续获得小胶质细胞的培养方法.方法 原代培养新生1～3 d Wistar大鼠大脑皮层中混合胶质细胞,第8～9天采用振摇法和玻璃吸管吹打法分离获得Yield 1小胶质细胞,按1∶2传代培养剩余贴壁的混合胶质细胞,分别继续培养10～12 d、12～14 d后应用同样方法获得Yield 2、Yield 3小胶质细胞;采用流式细胞仪分析所获小胶质细胞CD11b/c、CD45、CD80、CD86、GFAP的表达,免疫荧光染色和CCK-8法分别检测小胶质细胞CD11b/c的表达和增殖情况,应用扫描电镜观察其超微结构,应用吞噬红色乳胶微球实验评价其吞噬功能.结果 本实验所用培养方法连续稳定地获得了大量高纯度的小胶质细胞;流式细胞仪检测结果显示Yield 1与Yield 3小胶质细胞CD11b/c、CD45、CD80、CD86表达阳性;免疫荧光染色显示Yield 1、Yield 2、Yield 3小胶质细胞CD11b/c表达均阳性;CCK-8法结果显示3代小胶质细胞增殖活力相比较差异无统计学意义(P＞0.05);扫描电镜显示3代小胶质细胞形态均呈胞体饱满、胞突细长等细胞形貌特点.相同条件下Yield 1、Yield 3小胶质细胞之间吞噬功能比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 以本实验方法可以连续获得大量高纯度的小胶质细胞,且这些不同代次小胶质细胞的抗原表型、增殖活力及吞噬功能无明显差异,可为相关的实验研究提供细胞来源.
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鞘内注射硫酸镁对胫骨骨癌痛大鼠脊髓小胶质细胞活化的影响
目的 探讨鞘内注射硫酸镁对胫骨骨癌痛大鼠机械痛行为及脊髓小胶质细胞活化的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠72只,220 ～ 250 g,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=24):对照组(C组)、骨癌痛组(B组)和硫酸镁组(M组).B组和M组采用胫骨骨髓腔内注射Walker256乳腺癌细胞制备胫骨骨癌痛大鼠模型.于造模后第14天进行鞘内给药,M组注入硫酸镁375 μg,B组和C组注入等容量人工脑脊液.分别于造模前(T0),给药前1h及给药后1、2、4、8、12、24 h(T1 ～T7)记录大鼠机械痛行为学改变,并于T7时行为学测试结束后处死大鼠,测定脊髓背角OX-42表达,并计数小胶质细胞.结果 与C组比较,B组机械刺激缩足阈值(PWMT)降低,热刺激缩足潜伏期(PWTL)缩短,脊髓背角OX-42表达及小胶质细胞计数增加(P＜0.05);与B组比较,M组PWMT升高,PWTL延长,脊髓背角OX-42表达及小胶质细胞计数减少(P＜0.05).结论 鞘内注射硫酸镁可减轻大鼠胫骨骨癌痛,其机制可能与抑制脊髓小胶质细胞活化有关.
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视网膜铺片小胶质细胞2种染色计数方法的比较
目的 比较2种视神经损伤后行视网膜铺片小胶质细胞染色计数方法的准确性.方法 取Long Evans大鼠6只,荧光金经双侧上丘及外侧膝状体逆行标记视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs),7d后制作视神经钳夹伤模型.钳夹伤后2周麻醉处死大鼠,将大鼠灌注固定后取眼球剥离完整视网膜,置于4％多聚甲醛中后固定2h,3只大鼠行视网膜铺片对荧光金标记的小胶质细胞进行计数,其余3只在视网膜固定后运用CD11b单克隆抗体免疫组化双重标记小胶质细胞后再行铺片计数.结果 视神经损伤后,活化的小胶质细胞吞噬了死亡RGCs碎屑而被荧光金着色,联合小胶质细胞免疫组化的染色方法能够更加清楚地在视网膜铺片上分辨出活化的小胶质细胞和存活的RGCs,荧光金标记与双重标记小胶质细胞的计数分别为(240.0±7.9)、(406.0±9.1)个/mm2.结论 运用荧光金联合免疫组化双重标记小胶质细胞能够较为准确地对视神经损伤后活化的小胶质细胞进行计数,是研究小胶质细胞更准确有效的染色方法.
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丙泊酚对新生小鼠海马星形胶质细胞和小胶质细胞的影响
目的：观察丙泊酚麻醉对新生小鼠海马星形胶质细胞（AST）和小胶质细胞的影响。方法将健康同窝日龄7d（P7）C57小鼠15只，随机分为丙泊酚高剂量组、低剂量组和10％脂肪乳对照组，每组5只，所有小鼠从P7开始接受药物处理。高、低剂量组分别腹腔注射丙泊酚60、30mg／kg；对照组腹腔注射同等体积的10％脂肪乳。药物处理24h后取材，采用免疫组化方法检测AST标记物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）与小胶质细胞标记物离子钙接头分子（Iba1）在海马内的表达。结果丙泊酚高剂量组小鼠海马齿状回分子层中GFAP标记的AST数量较对照组明显减少（P＜0．01），低剂量丙泊酚对新生鼠海马中AST数量无显著影响；高剂量和低剂量丙泊酚均显著性降低海马小胶质细胞数量（P＜0．01）。结论丙泊酚抑制新生小鼠海马AST和小胶质细胞的发育，且存在剂量依赖关系。
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肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV2细胞环氧合酶2表达的影响
目的 探讨肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV2细胞的作用机制.方法 运用WST-8法检测肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV2细胞生存率的影响,倒置显微镜观察其形态学改变,Western Blot检测脂多糖(LPS)所诱导的小鼠小胶质细胞环氧合酶2(COX-2)的表达.结果 肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV2细胞无明显毒性;可抑制谷氨酸对小鼠小胶质BV2细胞的形态学损害;抑制LPS所诱导的小鼠小胶质BV2细胞COX-2的表达.结论 肉豆蔻提取物对小鼠小胶质BV2小胶质细胞具有保护作用.
