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内质网三磷酸肌醇受体在fractalkine诱发BV-2小胶质细胞p38MAPK信号通路激活中的作用
目的 探讨内质网三磷酸肌醇受体在fractalkine诱发BV-2小胶质细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路激活中的作用.方法 将BV-2小胶质细胞以1×105个/ml浓度接种于3.5 cm培养皿(5 ml/皿)、50 ml培养瓶(8 ml/瓶)、24孔培养板(1 ml/孔)或6孔培养板(2 ml/孔),采用随机数字表法,将其随机分为5组(n=25)∶正常对照组(C组)、fractalkine组(F组)、CX3C趋化因子受体1抗体anti-CX3CR1+ fractalkine组(CF组)、内质网三磷酸肌醇受体拮抗剂2-APB+ fractalkine组(AF组)及p38MAPK抑制剂SB203580+ fractalkine组(SF组).除C组外,其他4组加入10 nmol/L fractalkine,CF组、AF组及SF组于加入fractalkine前1h分别加入15 μmol/L anti-CX3CR1、50 μmol/L 2-APB及10 μmol/L SB203580.测定fractalkine孵育10 min期间细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的大值作为[Ca2+]i,于fractalkine孵育即刻、30、60、120、240 min时测定p38MAPK磷酸化水平,于fractalkine孵育24h时测定细胞培养液白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度.结果 与C组比较,F组、CF组、AF组和SF组[Ca2+]i、p38MAPK磷酸化水平、IL-1β和TNF-α浓度升高(P＜0.05)；与F组比较,CF组和AF组[Ca2+]i降低,CF组、AF组及SF组p38MAPK磷酸化水平、IL-1β和TNF-α浓度降低(P＜0.05).结论 内质网三磷酸肌醇受体参与了fractalkine诱发BV-2小胶质细胞p38MAPK信号通路激活.
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脊髓胶质细胞在小鼠骨癌痛形成中的作用
目的 评价脊髓胶质细胞在小鼠骨癌痛形成中的作用.方法 健康雄性C3H/He小鼠40只,周龄8～10周,体重18～22 g,随机分为4组(n=10):假手术组(S组)、骨癌痛组(B组)、PBS组(P组)和米诺环素组(M组).S组跟骨骨髓腔内注射PBS 10 μl;余3组跟骨骨髓腔内注射含2×105个骨纤维肉瘤细胞的PBS 10 μl制备骨癌痛模型,于造模前即刻开始PBS组鞘内注射PBS 5μl,M组鞘内注射米诺环素(用PBS溶解为0.2 mmol/L)5μl,1次/d,连续11 d.于造模前1 d、造模后即刻、3、5、7、9、11 d时测定机械痛阈;于造模后3、7、9、11 d机械痛阈测定结束后测定冷痛阈.痛阈测定结束后处死小鼠,取脊髓组织,测定神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和CD11b的表达水平.结果 与S组比较,B组和P组造模后3-11 d时、M组造模后3、5 d时机械痛阈升高,B组、P组和M组造模后7～11 d时冷痛阈升高,脊髓CD11b和GFAP表达上调(P<0.05).与B组比较,M组造模后3-11 d时机械痛阈降低,造模后7-11 d时冷痛阈降低,脊髓CD11b和GFAP表达下调(P<0.05).结论 脊髓胶质细胞(星形胶质细胞和小胶质细胞)的激活参与了小鼠骨癌痛的形成.
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脊髓趋化因子CXCL12在大鼠骨癌痛形成中的作用:与小胶质细胞活化的关系
目的 评价脊髓趋化因子CXCL12在大鼠骨癌痛形成中的作用及其与小胶质细胞活化的关系.方法 清洁级成年雌性SD大鼠32只,体重180 ～ 220 g,采用随机数字表法分为4组(n=8):假手术组(S组)、骨癌痛组(B组)、骨癌痛+ CXCL12中和抗体组(BC组)和骨癌痛+IgG对照抗体组(BI组).B组、BC组和B组大鼠右侧胫骨骨髓腔注入Walker 256乳腺癌细胞5μl(4×105个/ml)；S组大鼠右侧胫骨骨髓腔注入5μl生理盐水；于注射乳腺癌细胞后第12、13和14天,BC组鞘内注射CXCL12中和抗体(10 μg/15μl,1次/d),BI组鞘内注射IgG对照抗体(10 μg/15μl,1次/d).于注射乳腺癌细胞前(T0)、注射后3、5、7、10、12和14 d(T1-6)时测定机械痛阈,于T6时痛阈测定结束后取大鼠L45脊髓,采用免疫荧光技术检测脊髓背角小胶质细胞标记物Iba-1的表达.结果 与S组比较,B组、BC组和BI组T2-6时机械痛阈降低,T6时脊髓背角Iba-1表达上调(P＜0.01)；与B组比较,BC组T56时机械痛阈升高,T6时脊髓背角Iba-1表达下调(P＜0.01).结论 脊髓趋化因子CXCL12参与了大鼠骨癌痛的形成,其机制与小胶质细胞活化有关.
关键词： 骨肿瘤 疼痛 脊髓 趋化因子CXCL12 小神经胶质细胞 -
新斯的明对神经病理性痛大鼠脊髓小胶质细胞的影响
目的 评价新斯的明鞘内给药对神经病理性痛大鼠脊髓小胶质细胞的影响.方法 健康雄性SD大鼠,月龄1月,体重200～250 g,建立坐骨神经分支选择性损伤(SNI)致神经病理性痛模型.术后5 d行鞘内置管,取鞘内置管成功的SNI大鼠40只,恢复2 d后行鞘内给药.随机分为4组(n=10):SNI组、新斯的明组(N组)、阿托品+新斯的明组(A+N组)和美加明+新斯的明组(M+N组).SNI组鞘内注射生理盐水20μL,N组鞘内注射新斯的明10μg,A+N组和M+N组分别于鞘内注射阿托品10μg或美加明10μg后5min鞘内注射新斯的明10μg.分别于造模前2 d(基础状态)、造模后即刻(T_1)、1 d(T_2)、3 d(T_3)、5 d(T_4)、新斯的明给药前即刻(T_5)、给药后15 min(T_6)、30 min(T_7)、45 min(T_8)、60 min(T_9)时各组随机取5只大鼠测定机械痛阈,并确定给药后机械痛阈高点,在机械痛阈高点时另取5只大鼠麻醉后取脊髓,镜下计数阳性脊髓小胶质细胞.结果 与SNI组比较,N组给药后各时点机械痛阚升高,T_6时达峰值,A+N组和M+N组给药后各时点机械痛阈升高,N组和A+N组术侧阳性脊髓小胶质细胞数量减少(P<0.05),M+N组术侧阳性脊髓小胶质细胞数量差异无统计学意义(P>0.05).与N组比较,A+N组和M+N组给药后各时点机械痛阈降低(P<0.05).结论 新斯的明鞘内给药可抑制神经病理性痛大鼠脊髓小胶质细胞的激活,从而发挥镇痛作用,其机制与激活N胆碱能受体有关.
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脊髓胶质细胞在大鼠炎性痛形成中的作用
目的 评价脊髓胶质细胞在大鼠炎性痛形成中的作用.方法 清洁Ⅱ级成年雄性SD大鼠,体重180～220 g,取蛛网膜下腔置管成功的大鼠65只,随机分为5组(n=13),生理盐水组(NS组):右后肢踝关节外侧皮下注射NS 50μl;炎性痛组(IP组):采用右后肢踝关节外侧皮下注射完全弗氏佐剂50μl的方法制备炎性痛模型;氟代柠檬酸组(FC组):经蛛网膜下腔导管注射FC 1 nmol/10 μl,15 min后右后肢踝关节外侧皮下注射NS 50 μl;NS+IP组:经蛛网膜下腔导管注射NS 10 μl,15 min后制备炎性痛模型;FC+IP组:经蛛网膜下腔导管注射FC 1 nmol/10 μ,15 min后制备炎性痛模型.于模型制备前2 d(T_0)、皮下注射药物前(T_1)和注射药物后2、4、6、8、10、12、24、26 h(T_(2～9))时测定机械缩足阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL).皮下注射药物后8 h时采用免疫组化法测定脊髓背角星形胶质细胞标记物(GFAP)和小胶质细胞标记物(OX-42)的表达水平.结果 与NS组比较,IP组和NS+IP组T_(3～9)时MWT和TWL降低,FC+IP组T_(3～9)时MWT降低,T_(8,9)时TWL降低,IP组、NS+EP组和FC+EP组脊髓GFAP和OX-42的表达水平均上调(P<0.05);与IP组比较,FC组T_(3～9)时MWT和TWL升高,FC+IP组T_(3～7)时MWT和TWL升高,2组脊髓GFAP和OX-42的表达水平均下调(P<0.05或0.01).结论 脊髓胶质细胞的活化参与了大鼠炎性痛的形成.
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脊髓小胶质细胞CCR2在大鼠骨癌痛维持中的作用
目的 评价脊髓小胶质细胞CC趋化因子受体2(CCR2)在大鼠骨癌痛维持中的作用.方法 健康雌性未交配SD大鼠50只,2月龄,体重160～ 180 g,采用随机数字表法,将其分为5组(n=10):假手术组(Ⅰ组)、假手术+RS102895(CCR2拮抗剂)组(Ⅱ组)、骨癌痛组(Ⅲ组)、骨癌痛+DMSO组(Ⅳ组)、骨癌痛+RS102895组(Ⅴ组).左侧胫骨干骺端骨髓腔内接种Walker256乳腺癌细胞制备大鼠骨癌痛模型.于术后10-12 d,Ⅱ组和Ⅴ组分别鞘内注射3 μg/μl RS102895 10μl,Ⅳ组鞘内注射DMSO 10μl,Ⅰ组和Ⅲ组鞘内注射生理盐水10μl,1次/d.于术前1d、术后3、6、9、10、11、12 d时测定机械痛阈,术后12 d痛阈测定后,取L4-6脊髓组织,采用免疫组织化学法测定脊髓背角小胶质细胞激活标记物(ox-42)水平,采用ELISA法测定脊髓IL-1β、IL-6及TNF-α的含量.结果 与Ⅰ组比较,Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组术后6-12 d时机械痛阈降低,ox-42阳性细胞数、脊髓IL-1β、IL-6及TNF-α含量升高(P＜0.01),Ⅱ组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05);与Ⅲ组比较,Ⅴ组术后10-12 d时机械痛阈升高,ox-42阳性细胞数、脊髓IL-1β、IL-6及TNF-α含量降低(P＜0.01),Ⅳ组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 脊髓小胶质细胞CCR2参与大鼠骨癌痛的维持,其机制可能与激活小胶质细胞从而促进炎性细胞因子释放有关.
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脊髓小胶质细胞活化在大鼠术后持续性痛中的作用
目的 探讨脊髓小胶质细胞活化在大鼠术后持续性痛中的作用.方法选择鞘内置管成功的雄性SD大鼠72只,体重200～250 g,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=24):假手术组、皮肤肌肉切口牵拉组(SMIR组)和米诺环素组.采用皮肤肌肉切口牵拉法建立大鼠术后持续性痛模型,假手术组和SMIR组于术前30 min和术后1～3 d鞘内注射人工脑脊液20 μl,1次,d;米诺环素组于术前30 min和术后1～3 d鞘内注射米诺环素10 μl,1次/d,并在每次注药后经导管注射人工脑脊液10 μl冲洗导管.于术前1 d及术后3、7、12、22和32 d时测定机械缩足反射阈值(MWT),各时点MWT测定结束后,随机取4只大鼠,测定脊髓背角小胶质细胞特异性标记物Iba-1的表达和计数小胶质细胞.结果 与假手术组比较,SMIR组和米诺环素组术后3～22 d时MWT降低,术后3、7 d时脊髓背角Iba-1表达和小胶质细胞计数升高(P＜0.05);与SMIR组比较,米诺环素组术后3～22 d时MWT升高,术后3、7 d时脊髓背角Iba-1表达和小胶质细胞计数降低(P＜0.05).结论 脊髓小胶质细胞的活化参与了大鼠术后持续性痛的形成.
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GBM细胞来源外泌体促进小胶质细胞介导的炎症反应
目的 探讨胶质母细胞瘤来源外泌体(GBM cell-derived exosomes,GBM-exo)在小胶质细胞活化、炎症网络激活和肿瘤化疗耐药性中的作用及潜在机制.方法 培养U87胶质瘤细胞和BV2小胶质细胞,提取U87细胞来源外泌体(U87-exo)并进行鉴定,荧光示踪验证细胞间的外泌体传递.各实验组用1 mg/L脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激BV2小胶质细胞建立体外炎症模型,对照组加入PBS,4h后实验组加入不同浓度的U87-exo,根据U87-exo浓度不同分为4组:LPS组、LPS+exo(50 mg/L)组、LPS+exo(100 mg/L)组和LPS+exo(200 mg/L)组.加入外泌体后孵育24 h,倒置相差显微镜观察BV2细胞的形态变化.收集各组BV2细胞和上清液,ELISA检测各组上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)的浓度,RT-PCR检测CXC趋化因子受体5(CXC chemokine receptor type 5,CXCR5)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthesis,iNOS)mRNA的表达水平,Western blotting检测各组小胶质细胞iNOS、CXCR5蛋白表达的变化.结果 U87-exo可以转移到BV2小胶质细胞中,且能够促进小胶质细胞活化和细胞形态改变.LPS组、LPS+exo(50 mg/L)组、LPS+exo(100 mg/L)组、LPS+exo(200 mg/L)组的LDH、TNF-α、IL-1β和IL-6浓度,iNOS mRNA、CXCR5 mRNA表达明显高于对照组,LPS+exo(50 mg/L)组、LPS+ exo(100 mg/L)组、LPS+ exo(200 mg/L)组的LDH、TNF-α、IL-1β和IL-6浓度,iNOS mRNA、CXCR5 mRNA表达明显高于LPS组,LPS+ exo(100 mg/L)组、LPS+exo(200 mg/L)组的LDH、TNF-α、IL-1β和IL-6浓度,iNOS mRNA、CXCR5 mRNA表达明显高于LPS+ exo(50 mg/L)组,LPS+exo(200 mg/L)组的LDH、TNF-α、IL-1β和IL-6浓度,iNOS mRNA表达明显高于LPS+ exo(100 mg/L)组,CXCR5 mRNA表达明显低于LPS+ exo(100 mg/L)组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究证实GBM-exo能促进肿瘤微环境中小胶质细胞介导的炎症反应,增强肿瘤化疗耐药性,这将为进一步认识和治疗脑胶质瘤提供有力的依据.
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大鼠室周器官内小胶质细胞在实验性变态反应性脑脊髓炎不同时期的形态学观察
室周器官(circumvent ricular organs,CVOs)是指由室管膜特化形成的位于第三、四脑室壁上的一些微小器官,包括穹窿下器、正中隆起等.小胶质细胞是中枢神经系统中主要的宿主免疫细胞,关于CVOs处小胶质细胞的分布尚缺乏形态学报道.
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神经肽Y对小神经胶质细胞活化状态和生成TNF-α的影响及其作用机制
目的：探讨神经肽 Y（neuropeptide Y，NPY）对原代小神经胶质细胞生物活性及生成肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的影响及其作用机制。方法培养原代大鼠皮层小胶质细胞，将细胞分为 Control组、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）组、NPY＋LPS 组、NPY 组和 BIBP3226＋NPY＋LPS 组，分别用无血清胶质细胞培养液、含 LPS 的无血清胶质细胞培养液、含 NPY 和 LPS 的无血清胶质细胞培养液、含 NPY 的无血清胶质细胞培养液和含 BIBP3226、NPY 和 LPS 无血清胶质细胞培养孵育细胞6 h。经免疫细胞化学荧光染色后，显微镜下观察小胶质细胞的形态学变化。ELISA 方法检测培养液中 TNF-α蛋白含量，RT-PCR 方法检测小胶质细胞中TNF-αmRNA 表达水平。结果 LPS 组 TNF-α的含量及细胞中 TNF-αmRNA 表达水平显著高于 Control 组（P ＜0．05），小胶质细胞处于活化状态；LPS＋ NPY 组与 LPS 组相比，TNF-α蛋白和 mRNA 表达水平明显降低（P ＜0．05），小胶质细胞活化水平降低；BIBP3226＋NPY＋LPS 组与 LPS＋NPY 组相比，TNF-α蛋白和 mRNA 表达水平显著增高（P ＜0．05）；LPS 组与 BIBP3226＋NPY＋LPS 组差异无统计学意义；NPY 组与 Control 组差异无统计学意义。结论 NPY 可以降低小神经胶质细胞的生物活性，抑制其生成 TNF-α，作用机制可能与 NPY Y1受体有关。
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不同浓度CD46预先给药对鼠原代培养小胶质细胞补体蛋白表达的影响
目的 评价不同浓度CD46预先给药对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的鼠原代小胶质细胞补体蛋白表达的影响.方法 培养原代小胶质细胞,取分离纯化的小胶质细胞接种于24孔板,随机分为4组(n=6):正常对照组、LPS组、低浓度CD46组和高浓度CD46组.采用噻唑蓝法检测细胞活性,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定培养上清液补体C3浓度.结果 LPS组、低浓度CD46组、高浓度CD46组补体C3表达均较正常对照组增加(P＜0.01);低浓度CD46组、高浓度CD46组补体C3表达均较LPS组减少,且高浓度CD46组补体C3表达较低浓度CD46组减少(P＜0.05).结论 CD46可明显抑制LPS诱导的小胶质细胞激活,显著减少补体C3释放.
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甘草黄酮抑制脂多糖诱导的小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶表达
目的 探究甘草黄酮(Gla)对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞一氧化碳(NO)生成和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达影响.方法 将BV-2细胞分为对照组、LPS组和Gla处理组,并进行相应处理.采用NO试剂盒检测NO释放量;转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测iNOS mRNA表达量;免疫荧光染色显示iNOS蛋白在BV-2细胞表达情况.结果 LPS刺激可显著增加BV-2小胶质细胞NO释放量和iNOS mRNA生成量(P<0.01),造成大量i-NOS阳性细胞出现,细胞体积增大,突起变粗短.Gla处理则可显著降低BV-2细胞NO释放量和iNOS mRNA生成量(P<0.01),同时iNOS阳性细胞数明显减少,细胞体积缩小,突起变细长.结论 Gla可调节BV-2细胞i-NOS表达,抑制LPS诱导的小胶质细胞神经炎症.
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P物质刺激脊髓小胶质细胞释放肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的作用观察
目的：探讨P物质对脊髓小胶质细胞的作用。方法利用原代培养的脊髓小胶质细胞，P物质孵育后采用免疫组织化学方法观察细胞形态学改变，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法观察细胞释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的情况。结果 P物质孵育后，小胶质细胞表现出激活态的形态学改变，400μmol/L和800μmol/L的P物质孵育6 h后，TNF-α和IL-1β释放增多，12 h时达到高峰，之后逐渐下降。结论 P物质作为脊髓水平传递痛信号的重要神经递质，可以刺激活化脊髓小胶质细胞，促进小胶质细胞合成释放TNF-α和IL-1β，并终促进慢性痛敏的形成。
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左旋多巴对脂多糖诱导小胶质细胞产生致炎因子的影响及黄芪保护作用
目的 探讨左旋多巴(L-DOPA)对脂多糖(LPS)诱导小胶质细胞产生致炎因子的影响及黄芪多糖(ASP)的保护作用.方法 不同浓度LPS(1、5、10 ng/ml)和(或)L-DOPA(50、100、500 μmol/L)及ASP (20 μg/ml)+LPS(10 ng/ml)+L-DOPA(50 μmol/L)处理小胶质细胞培养液,于0、4、24、48 h动态观察一氧化氮(NO)的含量、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平及黄芪多糖对上述指标的影响.结果 LPS处理小胶质细胞培养液,当LPS浓度5 ng/ml 48 h、10 ng/ml 24 h、L-DOPA浓度为100 μmol/L 72 h、500 μmol/L 24 h以后、LPS+L-DOPA组各个时间点NO的含量均高于对照组(P＜0.05),LPS+L-DOPA组显著高于单独用LPS或L-DOPA处理组(P＜0.05).LPS 5 ng/ml 24 h、10 ng/ml 4 h、L-DOPA500 μmol/L 72 h、LPS+L-DOPA组各时间点TNF-α的含量均高于对照组(P＜0.05),LPS+L-DOPA组显著高于单独用LPS或L-DOPA处理组(P＜0.05),黄芪多糖处理组明显降低NO的含量和TNF-α的水平(P＜0.05).结论 LPS致炎作用有时间剂量依赖性,小剂量L-DOPA无致炎作用,但L-DOPA增强LPS的致炎作用,黄芪多糖通过抑制NO、TNF-α的释放发挥抗炎保护作用.
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构建一种高产量小胶质细胞体外纯化培养的方法
背景:小胶质细胞在一些神经系统疾病如帕金森病、阿尔茨海默病中有重要作用.体外原代培养是进行小胶质细胞功能研究的基础,但目前常用的一些经典培养方法存在步骤繁琐、产量过低的问题.目的:建立一种简易高产量的原代小胶质细胞体外纯化培养方法.设计:以细胞为单一样本的探索性研究.单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科.材料:实验于2004-04/10在协和医院中心实验室完成,新生(出生1 d)昆明小鼠10只,雄性.方法:改进的培养方法以McCarthy等的经典培养方法为基础,通过提高初次接种密度,减少细胞离心过滤过程,进行不换液的营养缺失培养等重要改进,并使用低浓度胰酶-乙二胺四乙酸消化法分离纯化小胶质细胞,经MAC-1抗体免疫化学染色标记,计算MAC-1抗原阳性细胞,观察小胶质细胞培养的产量和纯度.主要观察指标:①倒置显微镜观察小胶质细胞形态.②免疫组织化学鉴定比较两种方法下小胶质细胞纯度、激活状态.结果:经典的McCarthy培养方法小胶质细胞培养周期为20 d,产量为2×105个/瓶,细胞纯度为95%～97%;改进的方法小胶质细胞培养周期为15 d,产量为1×106个/瓶,得到的小胶质细胞纯度为96%～98%.与经典的McCarthy培养方法比较,改进的方法周期短,产量提高了3～10倍.两种方法培养的小胶质细胞纯度和细胞激活状态没有明显差别.结论:新方法得到的小胶质细胞纯度与激活状态均与经典方法相似,但由于其步骤简单,周期短和有效提高了培养产量,为进行小胶质细胞功能特性以及在神经修复中作用的深入研究提供了良好的方法学基础.
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电针刺激水沟、百会穴后对缺血再灌注大鼠脑内小胶质细胞的活化
背景:小胶质细胞是中枢神经系统的免疫效应细胞,正常情况下在脑内处于静息状态,一旦被激活,将释放一系列的神经毒性因子和炎性因子,对神经元产生致死性损害.目的:观察局灶性脑缺血再灌注对大鼠脑内小胶质细胞活化的影响以及电针刺激水沟、百会穴的调节作用.设计:随机对照动物实验.单位:解放军第四五八医院理疗科;上海同济大学附属东方医院;华中科技大学同济医学院组胚教研室.材料:实验于2002-03在华中科技大学同济医学院组织胚胎学教研室完成.取80只Wistar大鼠随机分为8组,每组10只.方法:①正常对照组:不干预,次日处死.②假手术组:仅分离动脉,不插线栓,次日处死.③再灌注6,12,24 h组:线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型,缺血30min后分别再灌注6,12,24 h处死.④再灌注6 h+电针组:同前造模,在栓线插入大脑中动脉造模成功后立即进行针刺(水沟、百会),加电刺激(疏密波,频率4 Hz/16 Hz,刺激强度从1 V起,每10 min增加1V,终强度为3 V,每次持续刺激30 min),缺血30 min后再灌注6h处死.⑤再灌注12h+电针组:造模后立即针刺,隔8 h后再针刺1次,参数同前.缺血30 min后再灌注12 h处死.再灌注24h+电针组:造模后立即针刺1次,每隔8 h针刺1次,缺血30min后再灌注24 h处死.主要观察指标:各组大鼠在相应时间点灌注固定处死取脑,采用免疫组化法以蓖麻凝集素标记小胶质细胞,计算小胶质细胞数量,观察其形态变化.结果:67只大鼠进入结果分析.正常对照组和假手术组未见显色,再灌注6,12,24 h组在缺血灶边缘可见大量小胶质细胞活化,数量增加,再灌注12 h达高峰,分别为(35.38±1.77),(54.25±1.67),(49.29±2.21)个/200倍视野;经电针治疗后,再灌注6,12,24 h+电针组均低于同时段模型组[(32.11±2.80),(50.88±2.64),(45.45±3.95)个/200倍视野,P＜0.05].结论:脑缺血再灌注后脑内小胶质细胞被活化,对神经元产生毒性作用.电针治疗可减少小胶质细胞活化,从而对神经元发挥保护作用.
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水通道蛋白4基因沉默与体外培养星形胶质细胞的形态生长及其增殖效应
目的:研究短发夹环质粒载体对体外培养的星形胶质细胞水通道蛋白4表达的基因沉默效果.方法:实验于2003-12/2005-05在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所完成.实验动物为SPF级Wistar新生3 d大鼠20只,进行大鼠星形胶质细胞分离、培养.实验使用传至第三代的星形胶质细胞.构建特异性抑制水通道蛋白4表达的短发夹环质粒载体水通道蛋白4RNAi pGenesil-2,将体外培养的星形胶质细胞分为水通道蛋白4基因沉默组、水通道蛋白4基因沉默对照组、脂质体组和正常对照组,运用脂质体法转染质粒载体,分别于转染后2,3,5,7 d通过观察细胞形态和数量的改变,应用反转录-聚合酶连反应、免疫组织化学分别检测水通道蛋白4 mRNA和蛋白的表达,水通透实验验证水通道蛋白4基因沉默后星形胶质细胞的水通透功能.结果:星形胶质细胞水通道蛋白4基因沉默后,水通道蛋白4 mRNA及蛋白的表达呈进行性减少,至第7天水通道蛋白4 mRNA和蛋白表达水平分别减少了(80.12±1.01)%和(80.2±2.54)%,细胞数量减少约60%,星形胶质细胞从扁平和多角形变成类纤维形胶质细胞.水通透实验证实经水通道蛋白4基因沉默的星形胶质细胞体积增大的速度慢于正常星形胶质细胞.结论:构建的水通道蛋白4基因沉默pGenesil-2质粒载体可抑制星形胶质细胞水通道蛋白4的表达;水通道蛋白4参与星形胶质细胞快速水转运过程;水通道蛋白4也对维持体外培养的星形胶质细胞形态、生长、增殖起重要作用.
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神经细胞移植对大鼠脑损伤修复及行为功能的影响
目的:观察神经胶质细胞、神经元颅内移植对大鼠脑损伤修复作用及其神经行为功能的变化.方法:实验于2005-04/11在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成.①选取出生24 h清洁级Wistar大鼠2只作为供体.另选用4月龄清洁级Wistar大鼠48只,随机分为4组:正常对照组3只,模型对照组3只,神经胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)移植组21只,5-溴脱氧尿嘧啶尿苷(5-bromo2'deoxy-uridine,Brdu)移植组21只.②取供体鼠脑组织进行神经干细胞的培养,经GFAP抗体、Brdu免疫荧光标记的阳性细胞分别制成单细胞悬液待移植.③除正常对照组外,其余组均建立脑损伤模型.造模后GFAP移植组进行神经胶质细胞移植,Brdu移植组进行神经元移植,正常对照组不接受任何细胞移植.④细胞移植后观察大鼠行为变化,并进行神经行为功能评分.采用免疫荧光法检测组织片GFAP、Brdu标记阳性细胞在脑皮质区、海马齿状回及纹状体区的动态变化.结果:实验选取清洁级4月龄Wistar大鼠48只,全部进入结果分析.①神经行为功能测试及等级评分:与模型对照组比较,GFAP移植组、Brdu移植组于移植1 d无明显变化,均呈重度损伤(15～16分);移植8 d差异明显,呈中度损伤(9～10分);移植12 d差异有显著性意义(P＜0.05),呈轻度损伤(4～5分);移植16 d差异有非常显著性意义(P＜0.01),呈完成不稳定或反射缺陷(1分),接近正常对照组;移植24 d呈稳定持续状态.②不同时间点各梗死区域GFAP标记阳性细胞的表达:GFAP移植组标记阳性细胞,第1天脑皮质区、海马齿状回、纹状体区的细胞表达无明显变化;第4天各区细胞表达略有增加;第16天细胞表达为高值;第20天细胞表达呈下降趋势;第24天细胞表达为低值.③不同时间点各梗死区域BrdU标记阳性细胞的表达:Brdu移植组标记阳性细胞,第1天脑皮质区、海马齿状回、纹状体区的细胞表达无明显变化;第4天各区细胞表达略有增加;第16天细胞表达为高值;第20天细胞表达呈下降趋势;第24天细胞表达为低值.结论:神经胶质细胞、神经元颅内移植能够促进大鼠脑损伤的修复,改善大鼠神经行为功能.
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实验性癫痫大鼠免疫分子的表达
背景:近年来,许多学者对癫痫与免疫的关系从细胞和分子水平进行了研究,发现癫痫患者存在细胞、分子及其功能的多种免疫学改变.目的:观察实验性癫痫大鼠海马神经元的变性,以及小胶质细胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和C3b受体的表达.设计:随机对照动物实验.单位:大连大学医学院;日本三重大学.材料:实验于2001/2002在吉林北华大学免疫学实验室完成.取成年Wistar大鼠40只,随机分为模型组和对照组两组,每组20只.方法:模型组大鼠皮下注射海仁酸(12 mg/kg)建立实验性癫痫大鼠模型,对照组不干预,观察模型组大鼠注射海仁酸6 h期间湿狗样变行为变化.给药后3 d处死大鼠,采用结晶紫染色方法观察实验性癫痫大鼠海马神经元的变性;采用免疫组织化学染色方法观察实验性癫痫大鼠MHC分子和补体C3b受体的表达.主要观察指标:两组大鼠大脑海马神经元变性,MHC-Ⅰ类分子、MHC-Ⅱ类分子和C3b受体的密度比较.结果:40只大鼠全部进入结果分析.①模型组大鼠注射海仁酸3h以内出现湿狗样变及抽搐发生,在第3～6小时出现更为剧烈的癫痫持续状态.②模型组大鼠大脑海马锥状细胞层可见到神经元的变性,对照组未见神经元损伤.③模型组大鼠大脑海马MHC-Ⅰ类分子、MHC-Ⅱ类分子和C3b受体的密度分别为(201.6±6.43),(493.8±7.92)和(362.5±3.18)个/视野,对照组未见明显表达,两组比较差异显著(P＜0.01). 结论:①皮下注射海仁酸可成功建立实验性癫痫大鼠模型.②实验性癫痫大鼠大脑海马硬化发生过程中,存在着补体系统参与的免疫炎症反应,说明癫痫的免疫炎症机制.
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氯胺酮对N-甲基-D-天冬氨酸诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞损伤的作用
背景:氯胺酮是临床常用的静脉全麻药,静脉或硬脊膜外腔用药都有镇痛作用,它是N-甲基-D-天冬氨酸受体非竞争性拮抗剂,可拮抗兴奋性氨基酸的毒性作用.目的:观察氯胺酮对N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞凋亡的影响,探讨其可能的作用机制.设计:随机对照观察.单位:郧阳医学院附属太和医院麻醉科.材料:实验于2003-09/2005-01在郧阳医学院基础医学研究所细胞生物学实验室完成.由武汉大学动物实验中心提供新生两三天Wistar大鼠.方法:取Wistar大鼠T11～L6脊髓背角星形胶质细胞原代纯化培养.胶质纤维酸性蛋白鉴定星形胶质细胞纯度达98%后用于实验.将培养细胞24孔板随机分为6组(每组9份):①对照组加Hanks液50μL.②N-甲基-D-天冬氨酸组加药浓度为100μmol/L.③氯胺酮组加药浓度为1 mmol/L.④100μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+0.1 mmol/L氯胺酮组.⑤100μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+0.5 mmol/L氯胺酮组.⑥100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+1mmol/L氯胺酮组.1 mmol/L氯胺酮为临床镇痛剂量.培养24 h后检测超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量,免疫细胞化学观察Bcl-2蛋白和形态学变化,流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率.主要观察指标:①Bcl-2蛋白免疫组织化学苏木精-伊红复染细胞着色及形态学变化.②流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率.③丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化.结果:①Bcl-2平均吸光度值(A)作为半定量测量Bcl-2蛋白表达水平:100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸组低于对照组,差异显著[分别为0.054±0.021,0.108±0.039,P＜0.01],100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+1 mmol/L氯胺酮组高于100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸组,差异显著[分别为0.148±0.045,0.054±0.021,P＜0.01].②流式细胞仪检测星形胶质细胞凋亡率:100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸组高于对照组,差异显著[分别为(25.26±6.13)%,(5.66±2.24)%,P＜0.01],100μmol/LN-甲基-D-天冬氨酸+1 mmol/L氯胺酮组低于100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸组,差异显著[分别为(24.41±4.82)%,(25.26±6.13)%,P＜0.01].③丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性变化:100 μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸使星形胶质细胞内丙二醛含量显著升高,而超氧化物歧化酶活性明显降低;1 mmol/L氯胺酮明显降低丙二醛含量,显著增强超氧化物歧化酶活性,该效应在临床镇痛剂量以内有明显量效关系,与N-甲基-D-天冬氨酸组相比差异显著(P＜0.01).1 mmol/L氯胺酮组与对照组相比、100μmol/L N-甲基-D-天冬氨酸+0.1 mmol/L氯胺酮组与N-甲基-D-天冬氨酸组相比差异均无显著性.结论:N-甲基-D-天冬氨酸受体过度激活可诱导大鼠脊髓背角星形胶质细胞大量凋亡,适量氯胺酮显著抑制细胞凋亡,其机制可能增强星形胶质细胞Bcl-2蛋白表达,同时抑制自由基的产生和增强超氧化物歧化酶活性.
