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Taqman MGB探针实时PCR快速检测副溶血性弧菌
[目的]建立一种对食品中副溶血性弧菌的快速检测方法.[方法]根据GenBank公布的副溶血性弧菌的toxR基因的保守序列,设计1对引物和Taqman MGB探针,建立基于Taqman MGB探针的实时PCR快速检测副溶血性弧菌方法.[结果]通过对20种细菌的DNA进行扩增,结果6株副溶血性弧菌均可产生特异性扩增,与其他细菌无交叉反应;对纯菌而言,菌液灵敏度为23/ml,DNA浓度为130pg.定量关系式为:y=3.353151 Ln(x)+43.797989,R2=0.947952.67份冷冻海产品中2份副溶血性弧菌实时PCR检测结果阳性,相对应的有1份样品副溶血性弧菌培养阳性,检测时间仅需2h.[结论]该反应体系具有高度的灵敏度和极高的特异性,可用于食品和食物中毒样品中副溶血性弧菌的快速检测.
关键词： 弧菌 副溶血性 Taqman MGB探针 toxR基因 快速检测 -
TaqMan MGB Real-time RT-PCR 检测西尼罗病毒方法的建立
目的 建立一种灵敏、特异、高效的西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)感染诊断和流行病学调查的实验室检测方法. 方法 用C6/36细胞培养WNV并用Vero细胞蚀斑法滴定病毒浓度;根据WNV C蛋白基因组保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针,用细胞培养病毒液进行方法的条件优化;用不同病毒评价方法的特异性,用系列浓度病毒稀释液和染毒蚊子评价方法的灵敏性. 结果 建立的TaqMan MGB Real-time RT-PCR方法可检出低于0.01 PFU的WNV RNA,并可检出只含3只染毒蚊的标本;用该方法检测4种血清型登革病毒标准毒株、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒均为阴性. 结论 新建TaqMan MGB Real-time RT-PCR方法具有极高的特异性和灵敏性,是实验室早期诊断WNV感染和调查媒介携带WNV情况的理想方法.
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TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测白纹伊蚊体内登革病毒
目的初步研究TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应(TaqMan MGB Real-time PCR)检测白纹伊蚊登革病毒的敏感性,建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue virus,DV)鉴定方法.方法在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den-2型病毒,设不同的感染蚊虫浓度(只/500μl或只/1 000μl)和不同的分组方法(不加未染毒的蚊虫、分别用未染毒的实验室饲养的雌性白纹伊蚊补加到每份标本10、25、50只/组),利用一步法和二步法TaqMan MGB PCR检测,根据荧光信号判断结果.结果二步法TaqMan MGB PCR可检测到标本中感染蚊虫的低浓度为2只/500μl和3只/1 000μl,一步法TaqMan MGB PCR可检测到标本中感染蚊虫的低浓度为5只/500μl,蚊自身的RNA对登革病毒RNA的检测敏感性并无明显的影响.结论 TaqMan MGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高,特异性好,是白纹伊蚊携带登革病毒指数较理想的监测方法,标本较好的处理方法为500 μl标本处理液研磨20～30只/组,TaqMan MGBReal-time PCR好采用二步法.
关键词： 白纹伊蚊 登革-2型病毒 Taqman MGB探针 实时聚合酶链反应 -
两种PCR方法检测白纹伊蚊体内登革热2型病毒的比较研究
目的 比较TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应(TaqMan MGB Real-time PCR)和巢式反转录聚合酶链反应(巢式RT-PCR)检测白纹伊蚊体内登革热病毒(Dengue virus,DV)的敏感性差异,建立一种敏感、特异、重复性好的DV鉴定方法.方法 在实验室使雌性白纹伊蚊人工感染Den-2,在50只/组情况下,设不同的感染蚊虫浓度(只/1000μl),利用TaqMan MGB Real-time PCR和巢式RT-PCR检测,根据荧光信号和电泳判断结果.结果 二步法TaqMan MGB Real-time PCR可检测到标本中感染蚊虫的低浓度为3只/1000 μl,一步法TaqMan MGB Real-time PCR和巢式RT-PCR可检测到标本中感染蚊虫的低浓度为5只/1000 μl.结论 二步法TaqMan MGB探针检测白纹伊蚊体内的DV敏感度高,特异性好,快速、科学,是白纹伊蚊携带DV指数较理想的监测方法.
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H5亚型禽流感灭活疫苗病毒基因的定量检测及其与HI抗体效价之间关系的分析
目的 建立H5亚型禽流感病毒灭活疫苗中病毒核酸的特异、敏感、快速的定量检测方法,分析其与HI抗体效价之间的相关性.探索禽流感灭活疫苗效力体外检验的方法.方法 选取H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,使用Primer Express 2.0软件设计了特异性引物和TaqMan MGB(minor groove binder)探针,利用实时荧光PCR技术来定量检测禽流感灭活疫苗,通过体外转录,制备含有选定检测序列的RNA标准品,绘制标准曲线.对50批H5亚型禽流感灭活疫苗进行了荧光定量PCR检测,测定了疫苗的HA基因拷贝数,同时测定了50批疫苗相应的HI抗体效价.进行了疫苗的HA基因拷贝数与HI抗体效价之间相关性的分析.结果 该方法的灵敏度为10拷贝/反应,标准曲线的相关系数为0.998 003,对H9亚型禽流感灭活疫苗和其他禽病疫苗无交叉反应,特异性好、重复性佳.疫苗的HA基因拷贝数与HI抗体效价不相关.结论 荧光定量PCR方法为H5亚型禽流感病毒灭活疫苗检测提供了一种特异、敏感、快速的定量检测方法.
关键词： 禽流感灭活疫苗 Taqman MGB探针 实时荧光PCR HI抗体效价 -
TaqMan-MGB探针实时荧光聚合酶链反应快速检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变
目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)瘤组织表皮生长因子受体(EGFR)基因突变及TaqMan MGB探针实时荧光PCR快速检测EGFR突变的诊断价值.方法 应用聚合酶链(PCR)反应,对80例手术切除NSCLC瘤组织EGFR基因的第18、19和21外显子片段进行扩增和测序,Chromas软件分析基因突变.设计EGFR突变位点的TaqMan MGB探针,采用实时PCR检测瘤组织EGFR突变,并与测序结果比较.实时PCR的敏感性与特异性评价,用不同混合数量的PC-9细胞(19外显子缺失)为阳性参照.结果 21例NSCLC瘤组织存在EGFR基因突变,总体突变率为26.3%.其中13例为EGFR第19外显子阅读框内多核苷酸的缺失,8例为第21外显子2573位核苷酸点突变.诊断的特异性与敏感性均为100%.当PC-9突变型细胞仅占10%时或PC-9细胞数低达50只时,PCR仍然检测到EGFR基因突变的存在.女性、不吸烟和肺腺癌患者EGFR基因突变率显著高于男性、吸烟和非腺癌患者(P＜0.05).EGFR基因突变与患者年龄、TNM分期等因素无关.结论 NSCLC存在EGFR基因的突变或缺失,其中以女性、腺癌和不吸烟患者突变率较高.TaqManMGB探针联合实时PCR可有效地检测出EGFR基因突变,操作简便,易于临床推广.
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鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究
目的 建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法.方法 针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性.对临床标本中的鼠痘病毒进行检测.结果 研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100％,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应.该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100-109拷贝),低检测限度为4拷贝.该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3％.测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好.将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证.整个检测过程可在2h内完成,可以用作快速诊断方法.结论 本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用.
关键词： 鼠痘病毒 HA基因 Taqman MGB探针 实时荧光定量PCR 快速检测 -
香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术研究
目的 利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便、快速、特异、灵敏的香港海鸥型菌检测方法.方法 根据香港海鸥型菌16S rDNA的保守区域设计特异性引物和探针.用不同浓度、不同温度对反应体系引物浓度、探针浓度及退火温度进行优化.用添加已知量的香港海鸥型菌样本验证方法敏感性;用香港海鸥型菌以及大肠杆菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性和稳定性.结果 当25μL反应体系中上、下游引物(10 μmol/L)各为0.6 μL,探针(10 μmol/L)为0.4μL,模板DNA量为5.0 μL,反应条件:预变性95℃20 s,变性95℃10 s,退火57℃40 s,40个循环时,香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系[Ct=3.538×log(菌浓度)+13.56,r=0.999],方法的低检测浓度达到36 cfu/mL.23株香港海鸥型菌检测Ct值均小于35,而104株非香港海鸥型菌检测Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线.隔天连续5d重复试验Ct值变异系数小于3.20件活鲤鱼、18件活草鱼香港海鸥型菌检测率实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法(P ＜0.01,X2=21.50).且后者所需时间为5d,前者仅需10h.结论 TaqMan实时荧光定量PCR法是一种快速简便、特异性强、灵敏度高的香港海鸥型菌检测方法,值得推广应用.
关键词： 香港海鸥型菌 Taqman MGB探针 实时荧光PCR -
TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测登革病毒
目的建立一种敏感、特异、重复性好的登革病毒(Dengue Virus, DV)鉴定方法.方法根据DV 3'端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan MGB探针.利用1998～2004年收集的26份登革热病人临床血清标本,15例乙脑病人血清,DV 4个血清型标准毒株及23株1978～1997年DV 地方流行株和相关西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒等毒株,同时用克隆了1型DV 基因组3'端非编码区序列片段的质粒DNA作为阳性对照,检测所建立方法的特异性、敏感性.结果所建立方法的低检测限约为每反应5个基因拷贝.用该方法检测4个血清型DV 标准毒株、23株DV 地方流行株和26例分离到DV 的阳性血清标本,检出率为100 %;用该方法检测15例乙脑病人血清、10例麻疹病人血清和西尼罗病毒、日本脑炎病毒、麻疹病毒、基孔肯亚病毒,结果均为阴性.结论新建的TaqMan MGB探针检测DV 方法是实验室早期诊断登革热较理想的方法.
关键词： 登革病毒 Taqman MGB探针 实时聚合酶链反应 -
荧光定量PCR鉴别检测U.Urealyticum和U.Parvum方法的建立
目的:建立定量检测U.Urealyticum(UU)、U.Parvum(UP)的灵敏、特异的荧光定量PCR方法.方法:选择uu和UP的尿素酶基因设计两对引物和对应的探针组建2个TaqMan PCR反应体系,应用克隆的质粒建立系列标准品,作为模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做重复性试验和特异性分析.结果:UU和uP两标准曲线具有良好的线性关系,相关系数分别为0.9895和0.9956,无非特异性扩增.结论:应用实时TaqMan PCR法定量检测UU、UP,具有快速、特异、灵敏、便捷的特点,为解脲脲原体感染的流行病学和病理机制的研究奠定了基础.
关键词： UU UP 实时TaqMan PCR Taqman MGB探针 标准曲线 -
诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR的检测研究
目的 建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法.方法 根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqManMGB探针,调整引物、探针浓度,优化佳反应条件,建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系,进行灵敏度、特异性、稳定性试验,以评价反应体系,并与引物P289/P290常规RT-PCR进行灵敏度比较.结果 诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测时限短,仅1h就出结果;低检出下限为100拷贝/mL,比引物P 289/P 290常规RT-PCR灵敏度高100倍;与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应;4份核酸含量不同的标本重复检测5次,平均Ct值变异系数范围0.96%～2.27%.结论 诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好,可应用于突发公共卫生应急检测,提高快速检测能力.
关键词： 人类杯状病毒 诺如病毒 实时荧光PCR 逆转录PCR Taqman MGB探针 -
应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究
目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.
关键词： 正粘病毒科 多重实时PCR Taqman MGB探针 -
用Taqman MGB探针研究中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性
[目的]了解中国人群肿瘤坏死因子α(the tumour necrosis factor α,TNF-α)基因启动子区多态性.[方法]随机选取20名深圳地区汉族健康体检者,采用两对引物PCR扩增TNF-α基因启动子区(-1389nt～+125 nt),对PCR产物进行序列分析,寻找单核苷酸多态性位点(single nucleotide polymorphisms,SNPs).采用Taqman MGB探针建立了-857nt(C/T)位点的实时定量PCR(the real-time PCR)分型方法,并对中国汉族、壮族、布依族,水族及苗族群体共1 108份样本进行了基因分型.[结果]在启动子区(-1322nt～+67 nt),发现6个SNP位点,即-885(A/G)、-863(C/A)、-646(G/A)、-648(G/A)、-568(G/C)和-857(C/T,其中位点-646 nt(G→A)为新发现SNP.-885、-648及-568nt位点碱基虽然与Genbank不同,但测序的20个个体基因分型相同.中国人群-857nt(C/T)位点基因型频率分别为0.79(CC),0.19(CT)和0.02(TT),中国汉族、壮族、布依族,水族及苗族群体间无显著性差异.中国人群-857T等位基因频率为0.116,与文献报道的韩国人群相同,但比日本人群低.[结论]中国人群TNF-α基因启动子区单核苷酸多态性可能较保守.采用Taqman MGB探针实时定量PCR技术对SNPs进行基因分型简便、快速及准确,易于自动化,为大规模的疾病相关性研究提供了有效的工具.
关键词： 多态性 肿瘤坏死因子α 单核苷酸多态性 实时定量PCR Taqman MGB探针 -
Taqman MGB探针实时荧光定量PCR检测布鲁菌病的研究
目的 建立血液标本布鲁菌DNA荧光定量检测方法,探讨其临床应用价值.方法 用PUCm-T载体和PCR纯化产物连接,转染DH5a菌,筛选阳性菌落,提取质粒,制作外标准品；在布鲁菌基因组IS711序列设计一对引物和TaqMan MGB探针,严格优化反应物的组成和扩增条件,并对该方法进行评价.结果 建立的布鲁菌DNA荧光定量PCR方法低检出率为400拷贝/ml；批内误差为1.8％～6.5％,批间误差为2.6％～9.1％；在4.0×102～4.0×108拷贝/ml之间与Ct值具有很好的线性(Ct =-1.391 1 Ln (x) +41.65,r=-0.995 8)；具有较好的稳定性.在布鲁菌临床监测中发现,157份血液标本,用荧光定量PCR检测与临床检查结果(临床阳性、慢性期患者、症状可疑、阳性畜周围人群与重点职业人群(重点人群)的阳性率和阴性对照的符合率分别为90.3％、40％、6.7％、12.2％和100％.结论 建立的荧光定量PCR检测方法能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.在临床布鲁菌基因诊断方面具有重要意义.
关键词： Taqman MGB探针 荧光定量PCR 布鲁菌 DNA -
应用TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR结合分离培养监测分析灰仓鼠细菌多样性
目的:监测分析中国灰仓鼠细菌的多样性,收集更多的质量信息,获得更全面的微生物背景知识,为灰仓鼠的种群建立、生物净化和动物模型的建立提供科学的数据依据.方法:60只成年灰仓鼠来自新疆地区,安乐死后剖解采集标本.应用TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR和常规微生物学方法进行细菌多样性研究.结果:本研究采用常规微生物学方法从灰仓鼠中鉴定出179株细菌,包括大肠埃希菌、鲍氏志贺菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、栖冷克吕沃尔菌、嗜肺巴斯德菌、溶血性巴斯德菌、产气巴斯德菌、铜绿假单胞菌、栖稻假单胞菌、门多萨假单胞菌、粪产碱杆菌、阴道加特纳菌、卡它莫拉菌、莫拉克斯氏菌、CDC group EF-4a、特氏纤维单胞菌、戊糖片球菌、金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、腐生葡萄球菌、模仿葡萄球菌、头状葡萄球菌、孔氏葡萄球菌、木糖葡萄球菌、鸡葡萄球菌、里昂葡萄球菌、山羊葡萄球菌、粘滑罗斯菌、麻疹孪生球菌、肺炎链球菌、咽峡炎链球菌、血链球菌、牛链球菌Ⅰ型、乳房链球菌、少酸链球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、黄肠球菌、浅绿气球菌、解酪蛋白巨大球菌、拥挤棒杆菌、人皮肤棒状杆菌、蜂房芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽胞杆菌.分离培养鉴定出12个科21个属48个种179株细菌,肠杆菌科是主要优势菌群,葡萄球菌科、肠球菌科、假单胞菌科、巴斯德菌科、链球菌科是次优势菌群.应用Taq-Man MGB探针实时荧光定量PCR方法从灰仓鼠中检出167份核酸阳性标本,包括支原体、泰泽氏菌、空肠弯曲菌、CAR菌、幽门螺杆菌、肝螺杆菌、嗜肺巴斯德菌.TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测结果显示支原体是主要的优势菌群,泰泽氏菌、空肠弯曲菌、CAR菌、幽门螺杆菌、肝螺杆菌是次优势菌群.结论:TaqManMGB探针实时荧光定量PCR结合分离培养能够更有效地监测分析灰仓鼠细菌多样性,获得更多更全面的微生物多样性信息,该信息对灰仓鼠质量控制标准的制定具有重要意义.研究结果为我国灰仓鼠微生物学监测以及质量标准的制定提供了科学依据.
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三重实时荧光RT-PCR检测三种鱼类弹状病毒的研究
鱼传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necros virus IHNV)、鱼病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus VHSV)和鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus SVCV)是同属弹状病毒科(Rhabdoviridae)的3种鱼类病毒,也是影响水产养殖业的3种重要病毒.通过对这3种病毒基因序列的分析,在病毒基因的高保守区域,设计了3条分别针对这3种病毒的TaqmanMGB探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记.以此为基础建立针对该3种病毒的三重实时荧光RT-PCR的检测方法.通过反应条件的优化,该三重实时荧光RT-PCR低可检测至102拷贝/反应的病毒量.同时.该方法还对病毒混合感染EPC细胞(Epithelioma papulosum cyprini)和攻毒斑马鱼进行了检测.实验结果表明,该方法是一种特异、灵敏、高效的病毒检测方法.
关键词： IHNV VHSV SVCV Taqman MGB探针 三重实时荧光RT-PCR
