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脓毒症常见病原菌多重实时PCR检测方法的建立
目的 建立可同时检测脓毒症患者血液中肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和白假丝酵母菌的多重实时PCR方法.方法 根据各病原菌基因组保守序列设计引物和探针,建立多重实时PCR检测方法.对建立的多重实时PCR检测方法进行特异性、敏感性和灵敏度分析,并使用该法对112份脓毒症血培养阳性标本进行验证.结果 成功建立脓毒症常见病原菌的多重实时PCR检测方法.此方法特异性、敏感性良好,灵敏度达10-5 ng/μl,与标准检测方法(血培养加生化鉴定)相比,缩短了20 h.112份临床血培养阳性标本中,目标病原菌83例,多重实时PCR检出80例阳性;非目标病原菌29例,多重实时PCR检测均为阴性.检测结果显示,该方法特异性达100％,敏感性达96.39％.结论 该多重实时PCR检测方法具有快速、高效、灵敏、特异的优点,可用于临床重症监护室患者血液常见感染病原菌的诊断.
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多重实时PCR及脉冲场凝胶电泳技术在一起食源性疾病暴发事件中的应用
目的 探讨多重实时PCR (multiplex real-time PCR,MRP)和脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)技术在食源性疾病检测中的应用.方法 利用多重实时PCR技术对39份样本增菌培养物进行沙门菌侵袭蛋白A基因(invA)、肠产毒素性大肠埃希菌不耐热肠毒素基因(elt)、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌侵袭力基因(ipaH)的检测,并根据多重实时PCR的结果有针对性的开展了常规的分离培养鉴定工作.应用PFGE对10株分离菌株进行分子分型.结果 10份患者肛拭检出沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因,并从这10份样本中分离到10株都柏林血清型沙门菌.39份样本均未检出肠产毒素性大肠埃希菌不耐热肠毒素基因(elt)、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌侵袭力基因(ipaH).10株都柏林血清型沙门菌PFGE条带完全一致.结论 多重实时PCR有助于提高细菌性食源性疾病的判明率,指导病原菌的常规分离培养,PFGE可用于细菌性食源性疾病的追踪溯源.
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多重实时PCR检测三种呼吸道病毒
目的 建立多重实时PCR检测体系可同时快速检测引起人呼吸道感染的甲型流感病毒(IAV)、呼吸道合胞病毒(RSV)和SARS冠状病毒(SARS-CoV).方法 通过对PCR反应条件的优化,建立了同时检测IAV、RSV和SARS-CoV的多重实时PCR方法.结果 经熔解曲线分析,证实了该法可同时或分别检测3种重要呼吸道病毒.检测灵敏度分别为100.7TCID50/ml、1 TCID50/ml和10-0.5TCID50/ml.采用相同的反应体系和条件,分别对其他7种呼吸道病毒(包括乙型流感病毒,副流感病毒2型,柯萨奇病毒B3和B5血清型及腺病毒2、3和7血清型)进行扩增,均未检测出扩增产物.此种方法可在4 h内完成.结论 建立的多重实时PCR检测方法适用于3种重要呼吸道病毒的快速检测.
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多重实时PCR技术对高危型人乳头瘤病毒感染检测的临床意义
目的 观察多重实时PCR技术对高危型人乳头瘤病毒感染检测的临床意义.方法 疑似宫颈病变以及感染HPV病例120例,分别采用HC2检测法以及多重实时PCR技术对高危型HPV感染情况进行检测,同时检测其亚型感染情况.结果 在检测高危型HPV方面,两种检测方法效能近似,差异无统计学意义(P＞0.05);而与湿疣以及宫颈炎相比,鳞状细胞癌、低度鳞状上皮内病变(LSIL)以及高度鳞状上皮内病变(HSIL)阳性检出率更高,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 多重实时PCR检测方法适用监测高危型HPV持续感染以及大规模筛查.
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维族宫颈病变HPV16存在状态及临床意义
[目的]检测新疆维吾尔族宫颈癌及癌前病变患者人乳头状瘤病毒16型(HPV16)存在状态,探索其与维族宫颈病变进展关系.[方法]对HPV16阳性维族宫颈鳞癌(SCC)和宫颈上皮内瘤变(CIN)活检标本采用多重实时PCR检测HPV16 E2和E6拷贝数,通过E2/E6比值判断HPV16 DNA的存在状态.[结果]随着宫颈病变程度加重,游离型HPV 16逐渐减少,并且随着宫颈病变级别的升高,HPV16整合比率(混合型+整合型)逐渐上升.在CIN Ⅰ、CINⅡ/Ⅲ、SCC以及宫颈癌Ⅰ～Ⅳ期中,整合率(1-E2/E6)都呈上升趋势,但无统计学差异.[结论]HPV16 E2基因断裂可能是新疆维吾尔族妇女宫颈癌的致病因素之一,但尚不能认为整合率是评价维吾尔族宫颈癌前病变进展的参考指标之一.
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多重实时PCR与常规方法检测主要性病病原体的比较
目的 比较多重实时PCR检测解脲支原体(UU)、沙眼衣原体(CT)和淋病奈瑟氏菌(NG)与常规检测方法(培养法,金标法)在结果上的差异,探讨多重实时PCR在临床上的应用.方法 用多重实时PCR法和常规检测方法分别检测可疑患者宫颈分泌物、尿道分泌物标本中的UU、CT和NG.结果 多重实时PCR检测UU、CT阳性率分别达到35.6%,14.4%,二种方法间有显著差异(P<0.05),NG阳性率6.7%也有提高.显示多重实时PCR具有良好的特异性和准确性,可以对患者进行灵敏、准确、快速的检测.
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应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究
目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.
关键词： 正粘病毒科 多重实时PCR Taqman MGB探针 -
多重实时PCR用于高危型人乳头瘤病毒感染检测的价值
目的 探讨多重实时PCR技术的应用对高危型人乳头瘤病毒感染检测的临床意义.方法 选择疑似HPV感染和宫颈病变的病例178例,分别应用多重实时PCR检测法与HC2检测法检测高危型HPV及其亚型的感染情况.结果 多重实时PCR检测法与HC2检测法用于高危型HPV的检测,差异无统计学意义(P＞0.05),表明两种检测方法在检测效能上相近；两种检测方法中,低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)与鳞状细胞癌的阳性率均高于宫颈炎与湿疣,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 多重实时PCR法适用于大规模筛查和高危型HPV持续感染的监测.
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多重实时荧光PCR检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌
[目的]建立多重实时荧光PCR方法以检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌.[方法]通过设计引物和探针,优化反应条件,建立多重实时PCR,检测金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽胞杆菌16S rRNA保守区基因及其ces基因(编码致呕毒素cereulide).该多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,比较其与菌株鉴定结果及ces基因普通PCR检测结果.[结果]多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,与菌株鉴定结果的符合率为100%.蜡样芽胞杆菌的ces基因检测结果也与普通PCR结果相符.[结论]建立了同时检测金黄色葡萄球菌nuc、蜡样芽胞杆菌168保守区基因及ces基因多重实时PCR方法,可应用于金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌在种水平上的菌株鉴定、以及蜡样芽胞杆菌cereulide毒力菌株的鉴定.
