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副溶血性弧菌快速检测方法研究
目的 以检测toxR基因作为副溶血性弧菌种水平上的特异性基因鉴定,建立一种快速、准确、简便的副溶血性弧菌(VP)筛选方法.方法 根据toxR基因序列设计合成引物,扩增被检VP所含的相应基因.分别用标准株及地方株做对照,同时与常规鉴定方法比较.结果 对浙江省2005年收集的286株来自临床病人和海产品的可疑VP鉴定,用常规方法鉴定出VP占总数的62.24%;用toxR基因检测,鉴定率占所有菌株的61.54%;两者差异无统计学意义(x2=0.03,P＞0.05),对40份海产品增菌液直接检测toxR基因与常规增菌分离鉴定法,均有37份标本检出VP,检出率为92.5%.结论 该检测方法快捷、特异性好、敏感性高,可以作为VP快速筛选方法.
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Taqman MGB探针实时PCR快速检测副溶血性弧菌
[目的]建立一种对食品中副溶血性弧菌的快速检测方法.[方法]根据GenBank公布的副溶血性弧菌的toxR基因的保守序列,设计1对引物和Taqman MGB探针,建立基于Taqman MGB探针的实时PCR快速检测副溶血性弧菌方法.[结果]通过对20种细菌的DNA进行扩增,结果6株副溶血性弧菌均可产生特异性扩增,与其他细菌无交叉反应;对纯菌而言,菌液灵敏度为23/ml,DNA浓度为130pg.定量关系式为:y=3.353151 Ln(x)+43.797989,R2=0.947952.67份冷冻海产品中2份副溶血性弧菌实时PCR检测结果阳性,相对应的有1份样品副溶血性弧菌培养阳性,检测时间仅需2h.[结论]该反应体系具有高度的灵敏度和极高的特异性,可用于食品和食物中毒样品中副溶血性弧菌的快速检测.
关键词： 弧菌 副溶血性 Taqman MGB探针 toxR基因 快速检测 -
免疫磁珠-环介导等温扩增联用技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立
目的 建立一种快速且质优价廉的检测副溶血性弧菌的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法.方法 制备副溶血性弧菌跨膜转录调控蛋白toxR多克隆抗体,鉴定纯化后,进行磁珠包被制成免疫磁珠.利用免疫磁珠分离法和环介导等温扩增联用完成对副溶血性弧菌的检测,扩增产物经SYBR Green I染色肉眼观察和电泳鉴定.将副溶血性弧菌菌液作一系列稀释后,运用LAMP法进行敏感性检测,利用副溶血性弧菌和非副溶血性弧菌来验证LAMP方法的特异性.结果 LAMP检测副溶血性弧菌的检测下限为105 CFU/ml.副溶血性弧菌出现LAMP特征性扩增反应,非副溶血性弧菌未出现LAMP扩增.结论 LAMP检测方法为快速诊断试剂盒打下实验基础,适合日常监测,可满足快速检测的需要.
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应用SYBR GreenⅠ荧光PCR方法快速检测溶藻弧菌
目的 利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应方法建立一种准确、快速、便捷检测溶藻弧菌的方法.方法 根据溶藻弧菌toxR基因保守区域设计引物,建立检测溶藻弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用8株溶藻分离株以及26株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价.利用含不同溶藻弧菌基因组拷贝数(自2×106拷贝/μl至2×100拷贝/μl)的样品进行灵敏度评价.同时,对平行样品分别应用普通PCR法和TaqMan探针实时PCR法进行检测,并对3种检测方法的特异度及灵敏度进行比较.结果 基于toxR基因的SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测对全部8株溶藻弧菌检测为阳性,检测下限为2×101拷贝/μl,而26株其他种属细菌均为阴性.与普通PCR法和TaqMan探针实时PCR法比较,SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法灵敏度更高.结论 用toxR基因作为靶基因检测溶藻弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,提升了检测速度,有良好的实际应用前景.
关键词： 溶藻弧菌 SYBR GreenⅠ荧光PCR toxR基因 -
应用环介导等温扩增技术快速检测副溶血弧菌
目的 建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的副溶血弧菌快速检测方法.方法 针对副溶血弧菌toxR基因序列设计一套LAMP引物,应用LAMP技术对33株副溶血弧菌、22株其他种属细菌及含不同副溶血弧菌参考菌株( ATCC 17802)基因组拷贝数(5×100 ～5×105拷贝/μl)的样品进行检测,对平行样品分别应用普通PCR法和TaqMan探针实时PCR法进行检测,对3种检测方法的特异度、灵敏度及检测下限及反应时间进行比较.结果 LAMP技术、普通PCR法、TaqMan探针实时PCR法检测副溶血弧菌的特异度、灵敏度均为100％(分别为22/22,33/33),检测下限分别为5×101、5×103、5×102拷贝/μl,反应所需时长分别为22 main、3h、50 min.结论 与普通PCR、TaqMan 探针实时PCR检测相比,LAMP技术检测下限低,检测时长短,适于对副溶血弧菌进行快速检测.
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基于toxR基因的PCR检测副溶血性弧菌的方法建立
目的 建立基于toxR基因的PCR检测副溶血弧菌的方法,并通过实验条件摸索,优化反应体系条件,验证PCR方法检测副溶血弧菌的优势.方法 应用基于toxR基因的环引物PCR法和已报道的PCR法对副溶血性弧菌和食品样品进行检测,并优化反应条件.对两种检测方法的灵敏度、特异度和检测时间进行比较.结果 环引物PCR法可以使副溶血性弧菌扩增出大小180bp的toxR基因片段,两种方法检测副溶血性弧菌的特异度均为100％,检出限分别为4×103 CFU/mL和5×1004 CFU/mL,检测所需时间分别为2 h 50 min和3 h10 min.结论 基于toxR基因的环引物PCR法检测副溶血性弧菌的特异性更强,检出限更低,检测所需时间更短,能够较好地满足卫生防疫机构快速检测副溶血性弧菌的需要.
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PCR结合变性高效液相色谱快速检测水产品中河流弧菌
目的:应用PCR结合变性高效液相色谱技术实现水产品中河流弧菌的快速鉴定.方法:利用河流弧菌的toxR基因序列设计引物,并对该方法进行特异性、精密度和实际应用等方面的考察.结果:用该方法未检测到河流弧菌的近源种及其他细菌的阳性吸收峰,表现出了很好的特异性.结论:用PCR结合变性高效液相色谱检测河流弧菌,不仅特异性好、灵敏度高,且方法简便、快速.
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霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR的PCR扩增及克隆
为了构建霍乱弧菌和杜氏利什曼原虫双价口服活疫苗候选株,作者采用PCR对霍乱弧菌毒力表达调控基因toxR进行扩增及克隆,并对霍乱弧菌toxR基因进行限制性酶切分析.结果显示:7株霍乱弧菌均扩增出1.3kb的toxR基因片段,toxR基因中部含有EcoRⅠ酶切位点,再将toxR基因克隆在质粒pAT153上,对所获的重组质粒ptR4进行限制性酶切分析,证实质粒ptR4插入的1.3kb的DNA片段为toxR基因片段.
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Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立
目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法.方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度.结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带;②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0μl探针;③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10-1 mg/L;④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100％.结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值.
