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鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究
目的 建立快速、敏感、特异检测鼠痘病毒的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法.方法 针对鼠痘病毒血凝素HA基因设计特异性引物和探针,构建含有HA基因的标准质粒进行定量分析,建立TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,评价其敏感性、特异性和稳定性.对临床标本中的鼠痘病毒进行检测.结果 研究结果显示,建立的鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法特异性为100％,与其他正痘病毒属病毒、非正痘病毒属病毒、细菌、真菌、寄生虫和细胞均无交叉反应.该技术灵敏度高,能精确定量检测鼠痘病毒DAN线性范围达10个数量级(100-109拷贝),低检测限度为4拷贝.该方法重复性非常好,组内变异系数和组间变异系数均小于3％.测试中相关系数、斜率和效率测量线性没有显著变化,表明该方法准确度高、精密度好.将其成功应用于临床标本中鼠痘病毒载量的定量检测,用普通PCR和测序进行确证.整个检测过程可在2h内完成,可以用作快速诊断方法.结论 本研究新建立的鼠痘病毒TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法,具有快速简便、特异性强、灵敏度高的特性,适用于动物源性产品中鼠痘病毒检测、食品和药品安全检查、环境监测、流行病毒调查,为临床标本中鼠痘病毒的快速定量检测提供了一种特异有效的评价工具,值得推广应用.
关键词： 鼠痘病毒 HA基因 Taqman MGB探针 实时荧光定量PCR 快速检测 -
鼠痘病毒PCR检测方法的建立及在鼠源性生物制品检定中的应用
目的 建立小鼠鼠痘病毒PCR检测方法,并应用于鼠源性生物制品的检测.方法 根据鼠痘病毒基因组序列中保守的crmD片段设计一对引物,建立鼠痘病毒PCR检测方法；人工感染20只小鼠,对其肝、脾、肾、脚掌及血液采用该方法进行检测；提取鼠源性生物制品中DNA,采用该方法检测其是否存在鼠痘病毒.结果 该方法可以检测到稀释至10-5感染鼠痘病毒的细胞,在RHK21细胞和牛痘病毒中均未扩增出相应片段；该方法可检测出人工感染小鼠不同组织中病毒DNA；在鼠源性生物制品中未检测出鼠痘病毒DNA.结论 该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于染病动物组织及鼠源性生物制品中鼠痘病毒的检测.
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应用电镜技术检测小鼠鼠痘病毒
目的 应用电镜技术简便、快速、准确地检测动物病毒.方法 负染法和超薄切片法进行检测.结果 通过两种方法均可见到大量的鼠痘病毒颗粒.结论 应用电镜技术是一种检测动物病毒可靠有效的方法.
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鼠痘病毒荧光定量 Taqman-PCR检测方法的建立与应用
目的：建立鼠痘病毒的荧光定量Taqman-PCR检测方法，以期能快速、准确、灵敏、特异的检出鼠痘病毒。方法经过比对和筛选，本研究选取鼠痘病毒的ERPV＿027基因480－800位序列段，作为引物设计位点设计引物和探针，并对该引物对和探针的特异性、灵敏性、稳定性和重复性进行检测。结果本研究建立的方法，对鼠痘病毒的检测极限是68 copies／μL；该方法特异性强，只对鼠痘病毒特定片段进行特异性扩增，而对小鼠肝炎病毒、仙台病毒、沙门氏菌等其它病毒、细菌无扩增；该方法稳定性和重复性均较好。结论本研究成功建立了检测鼠痘病毒的荧光定量Taqman-PCR方法，该方法特异性强、灵敏度高，且具有较好的稳定性和重复性，具有广阔的应用价值。
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KM小鼠一起鼠痘的发病及其流行特点
2002年10～12月,湖北某实验动物中心因外购KM小鼠而造成鼠群爆发鼠痘,幼龄鼠和成年鼠易感,老龄鼠发病率较低.大部分病鼠在5～7 d死亡,病死率高达62.5%,其临床表现虽未见典型的四肢、尾和头部溃烂等症状,但剖检病变主要表现为肝、脾、十二指肠和小肠严重出血性坏死.经电镜观察、病毒分离和动物感染试验,确诊为鼠痘病毒感染.
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鼠痘病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建株及初步鉴定
目的:制备1株分泌高效价抗新分离的鼠疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,提高早期检测病毒的敏感性.方法:从可疑病鼠分离出的1株鼠痘病毒,并以此株制备抗鼠痘病毒为抗原,免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合.获1株稳定分泌抗鼠痘病毒(EV)单克隆抗体的杂交瘤细胞株(NB-4).结果:经初步鉴定证明,NB-4免疫球蛋白为IgG,针对的靶抗原分子质量为67ku,并对184份小鼠血清鼠痘病毒抗原进行检测.结论:NB-4有可能成为检测鼠痘病毒抗原较敏感的工具.
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ELISA法检测野生和驯养长爪沙鼠携带病毒情况
目的 检测野生长爪沙鼠和驯养长爪沙鼠的病毒携带情况,为制定长爪沙鼠微生物学检测北京市地方标准提供依据.方法 制备兔抗长爪沙鼠IgG抗体并用辣根酶标记.分别采集银川市、呼和浩特周边地区的野生长爪沙鼠以及长期驯养的长爪沙鼠血清,用间接ELISA进行流行性出血热、淋巴细胞脉络丛脑膜炎等人兽共患病毒及仙台病毒、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒等啮齿类动物烈性传染病病毒抗体检测,并计算检出率.结果 兔抗沙鼠的IgG抗体ELISA法效价1:64 000以上,满足血清学检测要求.银川地区野生长爪沙鼠小鼠肝炎病毒抗体阳性(6.0%),而呼和浩特和驯养的则未检出;但呼和浩特地区的野生长爪沙鼠有淋巴脉络丛脑膜炎病毒抗体检出(13.3%),而银川和驯养长爪沙鼠则没有.仙台病毒抗体的检出率为呼和浩特地区的低(40.0%),宁夏和驯养动物相等(53.3%).结论 两地区野生长爪沙鼠和人工驯养长爪沙鼠病毒抗体的检出种类和检出率有所不同,在制定北京市地方标准时要综合考虑.
