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活体共聚焦显微镜在眼前段疾病诊治中的应用进展
活体共聚焦显微镜(IVCM)是一种被广泛应用于研究活体眼表组织结构特征与功能变化的非侵入性图像诊断技术,可作为观察眼表组织在细胞水平的损伤以及纵向监测其修复过程的方式.近年来越来越多的研究使用IVCM分析眼部疾病的病理变化过程尤其是眼前段疾病.在角膜炎的鉴别、角膜营养不良的分型、角膜神经的再生修复、睑板腺和眼表疾病的评估、肿瘤疾病的早期诊断、青光眼的手术评价等方面IVCM均发挥一定作用.IVCM因能快速获取高分辨率图像和微观结构,其临床应用仍在不断向更多疾病的诊治扩展.
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子宫腺肌病的子宫内膜肌层交界区的血管形态学改变
目的：探讨激光共聚焦显微镜下子宫腺肌病的子宫内膜-肌层交界区（EMI）的血管形态学改变。方法选取2012年10月～2015年4月在大连大学附属中山医院妇科病房住院患者，25例子宫腺肌病子宫标本与25例子宫平滑肌瘤子宫标本分别称子宫腺肌病组和子宫肌瘤组。均于标本宫底“子宫内膜肌层交界区”（Endometrial Myometrial Interface，EMI）取材，石蜡切片HE染色后确诊为子宫腺肌病和子宫肌瘤后，在荧光显微镜下识别幼稚型和成熟型血管，计算血管密度。Zeiss LSM 510激光共聚焦显微镜观察测量计算单个血管内皮面积、血管直径及周长。结果荧光显微镜观察结果显示，子宫腺肌病组EMI检出血管223条，成熟型127条（57%），幼稚型96条（43%）；子宫肌瘤组EMI检出血管52条，成熟型51条（98%），幼稚型1条（2%）， P＜0.05，差异具有统计学意义。子宫腺肌病组子宫底EMI血管密度（8.92±0.84）条，大于子宫肌瘤组宫底EMI血管密度（2.20±0.19）条，P=0.001，差异具有统计学意义。共聚焦显微镜观察结果显示，子宫腺肌症组EMI血管直径、周长、面积分别为（23.79±4.82）μm，（74.71±11.82）μm，（177.81±21.42）μm2。子宫肌瘤组EMI血管直径、周长、面积分别为（6.46±2.68）μm，（42.68±6.88）μm，（68.93±6.90）μm2。子宫腺肌病组血管直径、周长、面积均大于子宫肌瘤组，P＜0.05，差异具有统计学意义。结论子宫腺肌病EMI与子宫肌瘤组EMI比较，血管密度增大；幼稚型血管血管比例增大，单个血管直径、周长、面积均大于子宫肌瘤EMI。子宫腺肌病组EMI血管改变提示子宫内膜向子宫肌层侵入同时有新生血管增生，影像学所示EMI增厚主要组织学成分为增生血管。采用手术或药物减少EMI可能治疗子宫腺肌病。
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5-氨基酮戊酸诱导白念珠菌生成原卟啉Ⅸ两种检测方法的比较
目的：对两种测定原卟啉Ⅸ( ProtoporphyrinⅨ, PpⅨ)荧光强度的方法进行比较,探求高效、准确、可靠、快速的检测方法。方法将白念珠菌悬液与5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid,5-ALA)避光孵育。分别利用荧光分光光度计(以下简称荧光法)和共聚焦显微镜(以下简称共聚焦法)下测量PpⅨ荧光强度。结果两种测量方法的统计学比较P<0.05,差异有显著性。共聚焦显微镜操作简单,方便快捷,自带分析软件可以直接算出测值,计算精确,但是测量价格较贵,荧光分光光度计相对操作相对繁琐,但是价格便宜。结论共聚焦显微镜无论从测量的简便性还是从测量的准确性都要优于荧光分光光度计。
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胆碱能受体激动剂引起豚鼠离体前庭毛细胞内钙离子浓度升高
目的通过观察胆碱能受体激动剂对离体前庭毛细胞内钙离子浓度的影响,以探讨前庭毛细胞膜所存在的胆碱能受体及其分型.方法用胶原酶消化后机械分离法,分离豚鼠前庭毛细胞(VHC), 钙敏荧光探针Fluo-3染色,用激光扫描共聚焦显微镜记录VHC的钙荧光图象及细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的动态变化.结果胆碱能M和N型受体激动剂乙酰胆碱(ACh)、氨甲酰胆碱(CCh)均可引起离体VHC内[Ca2+]i的升高;N型受体激动剂溴化乙酰胆碱(ACh-Br)仅在高浓度(10?mmol/L)时引起部分(4/5个)离体VHC内[Ca2+]i升高; 阿托品对ACh、CCh引起的VHC内[Ca2+]i的升高有抑制作用;加入0.1?mmol/L阿托品可使1?mmol/L Ach或CCh引起的VHC内[Ca2+]i升高的峰值明显减小(t检验均有显著差异P<0.01).结论豚鼠壶腹嵴前庭毛细胞膜上存在M型和N型两种受体,M型受体激动剂引起VHC内[Ca2+]i的升高较N型明显.阿托品对M型受体激动剂引起的[Ca2+]i升高有抑制作用.
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骨骼肌肌纤维钙火花检测中的伪彩色增强
利用激光扫描共聚焦显微镜,对经Flou-3AM染色的、人工剥离的蟾蜍骨骼肌肌纤维进行连续扫描分析,捕获电刺激后骨骼肌肌纤维中发生的钙火花现象,并通过对检测结果进行伪彩色处理,将灰度图像转换为彩色图像,从而提高了检测结果的直观性,增强了对钙火花的表达能力.
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激光扫描共聚焦显微镜的功能及质量控制
阐述了FluoViewTMFV500激光扫描共聚焦显微镜的工作原理及主要功能,提出了FluoViewTM FV500激光扫描共聚焦显微镜使用过程中荧光探针的选择、样品制备的要求、参数的选择以及对环境要求的质量控制方法.
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腺苷减少豚鼠心室肌细胞内游离钙浓度
目的:研究腺苷对豚鼠心室肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响并探讨其可能机制.方法:用激光共聚焦显微镜探测细胞内游离钙浓度,结果用相对荧光强度((FI-FI0)/FI0,%;FI0:对照;FI:给药)表示.结果:①在正常台氏液和无钙台氏液中,腺苷(10,50,100μmol/L)浓度依赖性地降低[Ca2+]i.②含30 mmol/L KCl的台氏液(高钾台氏液)能够增加[Ca2+]i.腺苷(10,50,100μmol/L)能够显著抑制KCl引起的[Ca2+]i的增加.③预先应用选择性腺苷A1受体拮抗剂DPCPX(1 μmol/L),可大部分取消腺苷(100 μmol/L)在高钾台氏液中的作用.腺苷(100μmol/L)在高钾台氏液的作用也可被预先应用一氧化氮(NO)合酶抑制剂L-NAME(1 mmol/L)所部分减弱.④腺苷(100μmol/L)能明显抑制无钙台氏液中由低浓度ryanodine引起的[Ca2+]i增加.⑤当细胞外液钙浓度由1 mmol/L增加到10 mmol/L而诱发心室肌细胞钙超载时,部分心室肌细胞产生可传播的钙波,腺苷(100μmol/L)可降低钙波发生的频率和持续时间,终阻断钙波并降低[Ca2+]i.结论:腺苷可通过抑制外钙内流和减少肌浆网内钙释放从而降低[Ca2+]i,其减少外钙内流可能是由于腺苷A1受体介导的电压依赖性Ca2+通道的抑制,NO可能参与这一过程.
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结膜下注射伏立康唑对兔眼角膜的安全性评价
目的：评估结膜下注射伏立康唑对兔眼角膜的安全性，寻找兔眼结膜下注射伏立康唑的安全剂量。方法健康成年新西兰白兔25只，按体质量随机分为对照组、伏立康唑（50、100、200、400μg）组。对照组结膜下注射0.1 mL生理盐水，伏立康唑组均结膜下注射0.1 mL伏立康唑注射液，分别含50、100、200、400μg注射用伏立康唑。1次/d，连续给药5 d。分别于给药前及末次给药后的第1、7、14天，裂隙灯和直接眼底镜观察眼部基本情况。末次给药后第1、7、14天观察角膜各层细胞的变化，计数角膜内皮细胞的数量，并测量角膜厚度。末次给药后第14天摘取实验眼眼球，HE 染色，观察角膜组织形态。结果共聚焦显微镜及HE结果显示，伏立康唑50、100μg组给药后，角膜各层细胞未见异常；伏立康唑200、400μg组给药后，角膜各层细胞不同程度异常。各给药组内皮细胞计数、角膜厚度与对照组比较，差异均无统计学意义。结论兔眼结膜下注射≤100μg的伏立康唑对角膜是安全的。
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三七总皂苷对大鼠心室肌细胞内游离钙浓度的影响
目的:研究三七总皂苷(PNS)对大鼠心室肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响并探讨其可能机制.方法:应用激光共聚焦显微荧光技术探测细胞内游离钙浓度,结果用相对荧光强度[(FI-FI0)/FI0 (%);FI0:对照;FI:给药]表示.结果:(1)PNS ( 40、80、120 mg/L )可浓度依赖性地降低模拟缺血液中心室肌细胞[Ca2+]i的增加.(2)预先应用L型钙通道开放剂Bay k8644,可取消PNS (80 mg/L) 在模拟缺血液中的作用.(3)PNS (80 mg/L)能明显抑制无钙台氏液中由低浓度ryanodine引起的[Ca2+]i增加.结论:PNS可通过抑制电压门控性钙通道的外钙内流和减少肌浆网内钙释放从而降低[Ca2+]i.
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激光扫描共聚焦显微镜在抗肿瘤药物研究中的应用
激光扫描共聚焦显微镜是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品,使现代显微镜有能力研究和分析细胞的变化过程和结构[1].肿瘤已成为人类的三大杀手之一,目前仅我国每年肿瘤的发生人数约200万,死亡人数约140万,抗肿瘤药物的研究已成为当今科研领域的重大攻关项目, 激光扫描共聚焦显微镜在该领域的应用在一定程度上推动了抗肿瘤药物的研究进展.
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早期胃癌内镜精查技术应用
胃癌发病率和病死率在我国均居各类恶性肿瘤的前列,早期诊断和治疗是提高患者存活率和改善生活质量的关键.但是,我国胃癌的早期诊断水平与世界先进水平还有很大差距,早期胃癌(early gastric cancer,EGC)的诊断率仅为5％～20％.EGC是指局限于胃黏膜层或黏膜下层的癌,不论有无淋巴结的转移.与中晚期胃癌相比,EGC在内镜下的黏膜改变不易识别,在普通白光内镜检查中,全面清晰的观察整个胃黏膜,熟悉EGC的黏膜特征,仍是发现可疑EGC病变的基础.进一步运用色素内镜、电子染色内镜、放大内镜、超声内镜(endoscopic ultrasonography,EUS)、荧光内镜、共聚焦显微镜(confocal laser endomicroscopy,CLE)等内镜精查技术可以强化EGC的内镜表现,不但使EGC的定性诊断变得容易,而且还能提供组织病理学信息,提高了EGC的检出率.本文将总结几种用于诊断EGC的内镜精查技术.
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高度近视眼LASIK术后远期屈光回退的相关因素分析
目的 探讨高度近视眼准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis,LASIK)后远期的屈光回退的相关因素,并对其进行角膜共聚焦显微镜(confocal microscope through focusing,CMTF)的观察和分析.方法 对发生屈光回退的35名高度近视患者的66眼,进行了随访观察及回顾分析.结果 屈光回退的度数与角膜曲率的变化值呈负相关(P＜0.05);屈光回退的度数与角膜中央厚度变化值呈负相关(P＜0.05);角膜共聚焦显微镜观察发现,回退患者的基质层厚度为(403.14±22.30)μm,与对照组(347.58±42.64)μm相比,统计学差异有显著性.回退患者的前层基质细胞的数目为(704.50±35.9)个/mm2与对照组(1087.0±67.0)个/mm2相比,统计学差异具有显著性.结论 LASIK术后远期的屈光回退与手术前后角膜曲率的变化有关,回退患者基质层的增厚可能引起角膜曲率的变化,从而产生屈光回退.前基质细胞的减少或许参与了此过程.
关键词： 准分子激光原位角膜磨镶术 回退 近视 共聚焦显微镜 -
LASEK与PRK术后角膜组织结构的活体激光共聚焦显微镜观察
目的评价活体共聚焦显微镜(confocal microscopy through focusing,CMTF)在观察准分子激光上皮下角膜磨镶术(LASEK)与准分子激光角膜切削术(PRK)后创面修复过程中的作用.方法对高度近视患者31人(62只眼)角膜进行CMTF检查.结果通过连续共聚焦扫描及焦点分析,得到角膜精确的、可重复的、深径度的图像,X、Y轴和Z轴多层情况及实时四维显示.LASEK术后角膜上皮细胞及基底细胞的形态及紊乱程度的变化、术后相同时相点产生的瘢痕均弱于PRK术后同时期.结论应用共聚焦显微镜可直接观测活体角膜各层细胞形态结构,为准分子激光屈光性角膜手术后创面修复、手术效果的评价提供有利证据.
关键词： 准分子激光上皮下角膜磨镶术 准分子激光角膜切削术 共聚焦显微镜 活体 近视 -
共聚焦显微镜下真菌菌丝鉴别分析
目的 采用角膜激光共聚焦显微镜对真菌性角膜溃疡患者进行观察,对共聚焦显微镜下的真菌菌丝与其他组织结构进行鉴别.方法 对122例(122只眼)真菌性角膜溃疡患者进行角膜激光共聚焦显微镜检查,对其共聚焦显微镜图像进行研究总结,对类似结构进行对比研究及鉴别.结果 共聚焦显微镜下真菌菌丝需与角膜内的六类结构(神经纤维、角膜前弹力层崩解后形成的网状结构、新生血管、角膜缝线、树突状细胞、药物结晶结构)进行鉴别,角膜类的六类结构各有其特征.结论 在熟悉角膜各层正常结构的情况下,通过共聚焦显微镜动态观察真菌菌丝与周围组织结构的关系,理解真菌菌丝与周围组织细胞的关系,将真菌菌丝与角膜内的六种结构进行鉴别,并不困难.
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四种方法测量近视眼角膜中央厚度结果比较研究
目的 探讨RTVue-OCT,OrbscanⅡ,HRT-3,以及超声角膜测厚仪测量角膜厚度的差异及一致性.方法 对23例(46只眼)近视眼患者分别用RTVue-OCT,HRT-3,OrbscanⅡ,以及超声角膜测厚仪(DGH-550)测量角膜厚度.应用t检验对其差异进行比较,用Bland-Altman分析对其一致性进行检验.结果 RTVue-OCT、OrbscanⅡ、HRT-3、DGH-550 四种方法测得角膜中央厚度依次为(536.57±29.69)μm,(536.28±27.45)μm,(521.00±30.36)μm,(548.20±28.75)μm.HRT 测量结果薄,与其它三种仪器测量.结果 相比差异均有统计学意义(P<0.05);RTVue-OCT与OrbscanⅡ法测量结果相似,差异无统计学意义(P=0.875).DGH-550测量结果厚,与其它三种方法测量结果相比,差异均有统计学意义(P<0.05).RTVue-OCT,与OrbscanⅡ角膜薄点测量结果相似,差异无统计学意义(P=0.098);Bland-Altman 分析显示RTVue-OCT,与OrbseanⅡ法测量无论角膜中央厚度还是薄点厚度均有良好的一致性.其它方法一致性较差.结论 RTVue-OCT,与OrbscanⅡ法测量结果无论角膜中央厚度还是薄点厚度均有良好的一致性,临床上可替代使用.HRT测量角膜中央厚度较薄,应引起注意.
关键词： 光学断层扫描仪 Orbscan Ⅱ眼前节分析仪 共聚焦显微镜 超声 角膜厚度 -
应用共聚焦显微镜对中央角膜组织与屈光度相关性的初步研究
目的 应用共焦显微镜对活体正常角膜各层组织与屈光度之间的相关性进行观察和分析.方法 选择门诊进行屈光检查的患者107例(107只眼).所有患者均经散瞳检影验光检查進行确诊,且矫正视力为0.8以上(屈光度≥-0.75D),检查各层角膜图像均被记录,并对各层细胞形态、细胞密度、角膜全厚、基质厚度、上皮厚度等进行分析.结果上皮基底細胞密度与等效球镜度数呈负性相关性.前基质角膜细胞密度与等效球镜度屈光度呈正相关性.后基质角膜细胞密度与等效球镜度屈光度呈正相关性.内皮细胞密度与等效球镜度呈负性相关性.内皮细胞的多型性与等效球镜度正相关性. 内皮细胞的异型性与等效球镜度无相关性.上皮厚度与等效球镜度数之间无相关性.角膜全厚、基质厚度与等效球镜度数呈负性相关.结论 随着屈光度增加,角膜上皮基底膜细胞、角膜基质细胞、角膜内皮细胞数量下降,角膜全层、角膜基质厚度减少.
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共聚焦显微镜在圆锥角膜交联术后的应用
目的 研究角膜交联术后圆锥角膜在共聚焦显微镜下的图像特点,评估去上皮角膜交联术(CXL)在圆锥角膜治疗中的疗效.方法 选择2016年6～12月于深圳市眼科医院就诊的圆锥角膜患者中角膜厚度不低于400 μm的23例23只眼,表面麻醉下去除上皮,点0.1％核黄素溶液行角膜交联术,术后配软性角膜接触镜.术前、术后除常规检查视力、裂隙灯显微镜外,行眼前节OCT(AS-OCT)和共聚焦显微镜检查.结果 AS-OCT成像特点:术前角膜基质相对较为均匀的黄绿色相间的反光,CXL术后均出现前部基质相对致密黄绿相间的高反光,后部基质层相对疏松的绿色为主的低反光.共聚焦显微镜成像特点:术前角膜基质纤维中大量皱褶表现为低反光条纹,CXL术后沿着圆锥角膜的暗条纹走行高反光条纹,且前部基质层较后部基质层明显.结论 共聚焦显微镜在观察角膜交联治疗效果中能提供明确的形态学证据,是观察胶原交联治疗效果的重要工具.经典去上皮CXL有利于核黄素渗透,效果确切.
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共聚焦显微镜在真菌性角膜炎诊治中应用观察
目的 观察共聚焦显微镜在真菌性角膜炎的诊断及治疗中的作用.方法 (1)收集2011年9月至2012年9月在西安市第一医院眼科就诊的真菌性角膜炎患者54例,入院时即行共聚焦显微镜及角膜刮片检查.(2)在对共聚焦显微镜确诊病例的治疗过程中,分别在第1、2、3、4周再对这些病例进行共聚焦显微镜检查,监测角膜病灶变化.结果 54例患者中共聚焦显微镜检出52例,诊断率为96.3％,角膜刮片检出49例,诊断率为90.7％,二者差异无统计学意义(P＞0.05).54例患者中22例伴有前房积脓；49例有植物性外伤或异物进入史,约为90.74％；有1例患者因感染未控制致角膜全溶解、眼内炎行根治性手术治疗.共聚焦显微镜下可见真菌性角膜炎的抗感染治疗一般2周时起效,2～3周时病情好转,第4周时感染基本得到控制.此时可根据角膜病灶情况选择结膜瓣遮盖或羊膜移植手术,以促进角膜修复.结论 共聚焦显微镜检查安全无创伤,可重复性强,对真菌性角膜炎的诊断快速,可监测角膜病情变化,指导临床治疗,提高治愈率.
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正常人房角结构的激光共聚焦显微镜研究
目的 采用角膜激光共焦显微镜观察正常人房角超微组织学形态,分析房角各层结构在共聚焦显微镜下的表现,对房角结构研究拓展新的研究方法.方法 临床病例实验研究.对2014年11月至2015年6月在深圳市眼科医院普通门诊就诊的患者30例(30只眼),进行共聚焦显微镜检查,其中屈光不正15例占50％ (15/30),结膜炎9例占30％ (9/30),干眼症6例占20％ (6/30),观察房角各层结构,包括Schwallbe线、小梁网,巩膜突及睫状体带结构,并对共聚焦显微镜获得的图像进行研究总结.结果 (1)通过共聚焦显微镜可观察到房角各层结构:30只眼(100％)均获得了房角Schwallbe线、小梁网的图像,14只眼(46.7％)获得了巩膜突结构的图像,3只眼(10％)获得了睫状体带结构的图像,1只眼(3.33％)获得了虹膜根部结构的图像.(2)各层结构在激光共聚焦显微镜下具有显著的特异性表现.结论 在三维空间实时、活体条件下对房角结构进行角膜激光共聚焦显微镜检查,可发现传统检查方法不能发现的超微变化.对房角结构研究扩展了崭新的研究途径.
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角膜移植术后内皮炎特征临床观察
目的 分析角膜移植术后病毒性角膜内皮炎的临床特征,指导临床诊断与治疗.方法 对2008年1月至2012年10月在山东省眼科研究所收治的24例确诊为角膜移植术后内皮炎的病例进行回顾性分析.分别记录其裂隙灯显微镜下角膜水肿的位置、范围、内皮面KP情况,激光共聚焦显微镜(Confocal)下内皮细胞形态、数量及内皮面KP情况,总结其临床特征及治疗转归.结果 裂隙灯显微镜可见角膜植片和(或)植床水肿,水肿对应的内皮面出现散在、斑块状KP,KP均匀分布于受累植片及植床;Confocal下可见水肿对应植片与植床的内皮面均有多量炎症细胞浸润,内皮细胞水肿,失去六边形结构,边界模糊,细胞核增大;可见大小不一,形态各异的高反光KP,呈散在分布,聚集成团或条索状分布;可见暗区,暗区内细胞边界与细胞结构无法识别.应用抗病毒药物联合糖皮质激素治疗7～10 d后,患者病情得以控制,视力较治疗前均有不同程度的提高.药物治疗3个月后与发病前相比较,内皮细胞丢失率为(9.9±2.1)％.结论 角膜移植术后出现植片水肿和内皮面KP要考虑病毒性角膜内皮炎的可能性,掌握其临床特征,有利于诊断和治疗.
