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共聚焦显微镜观察视网膜病变玻璃体切割术角膜内皮细胞变化
目的 探讨增殖期檐尿病视网膜病变患者玻璃体视网膜手术前后角膜内皮细胞改变及这一特殊人群经历玻璃体视网膜手术后情况.方法 应用共聚焦显微镜对角膜内皮细胞的密度以及形态学改变进行观察记录.对玻璃体视网膜疾病患者49例(56只眼),其中增殖期糖尿病视网膜病变患者29例(35只眼),进行观察.其余各类玻璃体视网膜疾病患者20例(21只眼)作为对照组,局麻下分别施行不同术式的玻璃体视网膜手术,分别于术前1d、术后1周、术后1月,术后3月对术眼角膜进行共聚焦显微镜检查,记录相关数据.结果 共焦显微镜检查显示术后角膜内皮细胞异形性增加;内皮细胞水肿;角膜内皮细胞坏死;坏死区周围细胞移行修复;角膜内皮细胞内表面沉着等表现,分析所得数据:增殖期糖尿病视网膜病变组与对照组相比:术前角膜内皮细胞平均面积,前者大干后者(P<0.05),六角形内皮细胞所占比例前者小于后者(P<0.05),差异具有统计学意义;术后1月、3月,前者内皮细胞丢失率和六角形内皮细胞丢失率均大于后者,差异具有统计学意义.结论 共聚焦显微镜可以在细胞水平观察活体角膜内皮细胞的密度、形态结构及其动态变化,是研究手术引起的角膜内皮细胞改变的-个重要手段.通过本研究发现增殖期糖尿病视网膜病变患者由于内分泌紊乱,使角膜内皮储备功能下降,降低了此类患者角膜内皮对玻璃体视网膜手术的耐受性.
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共聚焦显微镜对角膜移植术后内皮型免疫排斥反应观察
目的 应用激光共聚焦显微镜(Confocal LaserScaning Microscope,CLSM)观察角膜移植术后内皮型免疫排斥反应的特征及抗排斥治疗后的转归.方法 应用CLSM对16例角膜移植术后内皮型免疫排斥反应的病例,分别在抗排斥治疗前、治疗3～7d和1月后,对其病灶的特定位点进行检查,分析角膜上皮细胞、基质细胞、内皮细胞及免疫细胞的数量及形态学变化.结果 (1)16例患者中,8例可见典型的内皮排斥线,CLSM下:内皮排斥线是由体积较小反光明亮的炎症细胞和体积较大边界不清的异常内皮细胞构成.排斥线经过的区域上皮细胞体积增大,上皮基底层大量树突状Langerhans细胞,基质层水肿增厚,呈网格状改变.内皮细胞体积增大,边界模糊,六边形结构消失,可见多核细胞.基质水肿较重的病例,内皮层面见大量强反光团,内皮细胞无法成像.排斥线以上角膜植片相对透明的部分则各层细胞排列基本规则,内皮面少量免疫细胞附着.另8例表现为植片弥漫水肿混浊,CLSM下表现与内皮排斥线经过区域类同.(2)药物治疗3～7d后,12例患者明显好转.CLSM下见上皮基底层下树突状Langerhans细胞明显减少;基质细胞核清晰可见;内皮细胞恢复六边形结构,密度增加,其表面免疫细胞数量减少.4例患者基质层水肿减轻,中深基质层细胞有变性纤维化现象,内皮细胞层强反光团明显减少,但内皮细胞仍不能清晰成像.此4例患者用药1月后基底膜下仍有局限性树突Langerhans细胞聚集,中深基质层变性纤维化,内皮细胞排列不规则,有变圆或拉长现象.结论 应用CLSM可在细胞学水平对角膜移植术后内皮型免疫排斥反应的过程与转归进行活体的动态观察,对指导抗排斥治疗,有效提高角膜移植排斥反应的诊治水平,具有重要的临床意义.
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基质型单疱病毒性角膜炎共聚焦显微镜表现
目的 探讨单纯疱疹病毒性角膜炎基质型的共聚焦显微镜表现和对临床实践给予指导.方法 收集2011年1月至12月在吉林大学第一医院眼科就诊的单纯疱疹病毒性角膜炎基质型共38例,采用日本Nidek公司提供的Confoscan4.0检测角膜各层形态学改变.结果 单纯疱疹性角膜炎基质型其角膜各层在共聚焦显微镜下有典型改变,上皮基底膜下浅基质层内可见角膜神经丛及大量郎汉斯细胞,基质细胞呈纵横伸展相互交错的细胞轮廓,后基质可见宽大条状低反光暗区,基质内可见高反光物质.内皮细胞,形态正常,位于内皮细胞面可见条索状或分枝状高反光物质沉积.结论 角膜共聚焦显微镜对于病毒性角膜炎的临床诊断、治疗及发病机制的研究具有很好地应用价值.
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糖尿病性视网膜病变患者角膜形态学变化的共焦显微镜研究
眼表活体共聚焦显微镜是近年来出现的一种新型的高放大倍率显微镜,能够对活体角膜组织进行无创,实时动态和四维(三维加时间)观察.文中就近年来眼表活体共聚焦显微镜用于观察研究糖尿病性视网膜病变患者角膜形态学变化展开综述.
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共聚焦显微镜在真菌性角膜炎的应用
真菌性角膜炎(fungal keratitis)是较常见的严重致盲性眼病.角膜培养是诊断真菌性角膜炎的金标准,但因其培养时间较长而受到一定影响.共聚焦显微镜是一项非侵入性成像技术,能对角膜各个组织层次进行成像,其高检出率及快速诊断的特点已成为诊断真菌性角膜炎的重要检查手段.同时通过其无创、重复、非侵入性操作,还在真菌性角膜炎病人的随访过程中被用于评估其疗效和治愈程度.现就共聚焦显微镜在真菌性角膜炎、棘阿米巴角膜炎的表现及诊断要点和鉴别进行综述.
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共聚焦显微镜观察郎罕细胞在角膜浅层斑翳形成研究
目的 采用角膜激光共聚焦显微镜观察角膜浅层斑翳形成过程中的眼表郎罕细胞(langerhans' cells,LC),分析LC在角膜浅层斑翳形成中的作用.方法 临床病例实验研究.对2006年1月至2013年12月在深圳市眼科医院就诊的342例(342只眼)浅层角膜溃疡和角膜炎、轻度的角膜外伤和化学伤患者,进行连续的共聚焦显微镜检查观察,对恢复期的LC共聚焦显微镜图像进行研究总结,分析LC在角膜浅层斑翳形成中所起的作用.结果 (1) 342例(342只眼)中,有317例(317只眼)患者在角膜激光共聚焦显微镜检查中发现郎罕细胞从角膜缘的毛细血管和(或)新生血管中游离移行出来,占92.69％ (317/342). (2)有287例(287只眼)发现郎罕细胞移行参与角膜上皮细胞层及前弹力层的修复过程,占83.92％ (287/342).(3)有231例(231只眼)发现郎罕细胞在角膜上皮修复后继续移行至病灶周边部,同时郎罕细胞变形、伸出更多突触,开始参与角膜浅层斑翳的修复过程,占67.54％(231/342).(4)有322例(322只眼)发现郎罕细胞移行聚集至病灶处,参与与角膜浅层斑翳的修复过程,占94.15％ (322/342).结论 郎罕细胞在角膜浅层斑翳的形成中有重要作用,根据研究将其分为三个阶段:第1阶段渗漏移行期:毛细血管或者新生血管扩展,郎罕细胞从血管中移行出来.第2阶段角膜上皮及前弹力层的修复移行期:郎罕细胞向病灶聚集移行,参与角膜上皮的修复过程和前弹力层的修复过程.第3阶段角膜浅层斑翳形成期:郎罕细胞在溃疡灶处聚集,参与浅层斑翳的形成.
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脂质体介导哺乳动物细胞转染的改良方法
目的:提高脂质体介导的细胞转染效率.方法:在传统的脂质体生化转染过程中,介入了简单的物理转染技术,并应用有限稀释克隆技术和共聚焦荧光显微镜检测技术,对转染细胞进行了早期克隆筛选,用流式细胞术对转染细胞表达GFP的阳性率进行检测.结果:流式细胞术检测显示,通过改良法获得转染pcDNA3-GFP-PSA质粒的B16、RM1和EL4细胞,表达报告蛋白GFP的阳性百分率(26%、24%和40%)高于传统法转染的细胞(16%、16%和18%).改良法转染的B16、RM1和EL4经过克隆筛选、液氮冻存、水浴复苏和体外连续培养2周后,外源基因报告蛋白GFP表达的阳性百分率分别为77%、69%和83%.在转染流程上,通过改良法获得单克隆转染细胞株的时间明显缩短.结论:改良的脂质体转染方法结合细胞克隆技术,能在短时间内获得高表达外源基因的转染细胞株.
关键词： 脂质体 改良方法 pcDNA-GFP-PSA 共聚焦显微镜 流式细胞术 -
流式细胞术检测临床实体瘤细胞周期蛋白表达的方法研究
目的 探讨cyclin/DNA双参数流式细胞术及流式细胞术分选后的免疫沉淀蛋白质印迹技术和共聚焦显微镜技术检测临床实体瘤细胞周期蛋白表达的可行性、科学性和优越性,为肿瘤的细胞周期分析提供科学有效的技术支持.方法 运用cyclin/DNA双参数流式细胞术及流式细胞术分选后的免疫沉淀蛋白印迹技术和共聚焦显微镜技术检测临床实体瘤细胞周期蛋白的表达,并与传统的免疫组织化学切片法进行比较.结果 流式细胞术可以准确地对细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达进行定性、定量、定位的分析,较为系统地反映了细胞周期蛋白在临床实体瘤中的表达特性和肿瘤的生物学特性.结论 Cyclin/DNA双参数流式细胞术及流式细胞术分选后的免疫沉淀蛋白质分析技术和共聚焦显微镜技术是一种科学有效的检测临床实体瘤细胞周期破坏特性的技术和方法.
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收缩和骨骼蛋白在培养LAM细胞的免疫组化学研究
目的从形态学上判定淋巴管肌脂瘤病(Lymphangioleiomyomastosis,LAM)细胞与平滑肌细胞的关联性.方法用荧光抗体染色法和激光共焦显微镜观察收缩蛋白在LAM细胞的分布.结果α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chains,SMHC)、结蛋白(desmin)和非肌性肌球蛋白重链ⅡB(nonmuscle myosin heavy chain ⅡB,NMHC-ⅡB)存在于LAM细胞.结论 LAM细胞属平滑肌细胞类型.这为进一步研究激素及其它药物对LAM细胞收缩蛋白产生的影响奠定了基础.
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齐墩果酸对谷氨酸诱导神经细胞损伤的影响
目的 研究齐墩果酸(oleanolie acid,OA)对谷氨酸诱导大鼠海马神经元损伤的影响.方法 选用新生Wistar大鼠原代培养海马神经元,建立谷氨酸细胞毒性模型,借助于共聚焦显微镜结合钙荧光指示剂Fluo-3-AM观察OA对海马神经元[Ca2+]i的影响.结果 1、10、100 μmol/L OA+谷氨酸组细胞内[Ca2+]i均明显下降,与谷氨酸对照组相比[Ca2+]i分别降低了0.32±0.05,0.41±0.06和0.43±0.09,差异均有显著性(P＜0.05).结论 OA可以降低谷氨酸诱导海马神经元[Ca2+]i升高,对谷氨酸诱导的海马神经元损伤有一定的保护作用.
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三氧化二砷对海马神经元细胞内钙离子浓度的影响
目的 研究三氧化二砷(As2O3)对海马神经元细胞内钙离子([Ca2+]i)浓度的影响与其神经毒性的可能机制.方法 用激光共聚焦显微镜结合Fluo-3-AM观察As2O3对大鼠原代培养的海马神经元[Ca2+]i的影响.结果 有钙液中10 μmol/L、100 μmol/L As2O3升高海马神经元[Ca2+]i与对照组相比[Ca2+]i分别提高了0.24±0.09和0.41±0.08.20 μmol/L的维拉帕米不能阻断10 μmol/L As2O3升高[Ca2+]i作用.无钙液中10 μmol/L、100 μmol/Ls2O3升高海马神经元[Ca2+]i与对照组相比[Ca2+]i分别提高了0.12±0.06和0.30±0.07.100 μmol/L 2-APB阻断了10 μmol/L As2O3升高[Ca2+]i作用.结论 As2O3可以升高海马神经元[Ca2+]i,IP3信号转导途径可能参与As2O3升高海马神经元[Ca2+]i.
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外周血白细胞中人巨细胞病毒pp65抗原的定位及意义
目的 明确人巨细胞病毒(HCMV)磷酸基质蛋白65(pp65)抗原在阳性细胞中的定位并初探其定位与病毒活动间的关系,为指导临床病毒抗原血症的监测提供依据.方法 利用4,6.联脒-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料能与细胞双链DNA结合的特点,在激光共聚焦显微镜下对HCMV pp65单抗阳染细胞进行抗原定位;同时通过外周血白细胞与病毒共培养技术,检测分析其定位与病毒活动的关系.结果 临床标本检测的HCM-Vpp65抗原阳染细胞的表现形式有3种,即细胞浆型、细胞核型和细胞浆核混合型,其中细胞核中的HCMV pp65抗原聚集于细胞核的内部,而非仅仅附着于核表面.进一步的白细胞与病毒共培养结果显示,只有野生型病毒株感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)与外周血白细胞共培养,才能检出HCMV pp65抗原阳性的白细胞,而且表现为仅初期(培养1 h内)可检出细胞浆阳染型,随着时间延长,约80%～90%的抗原阳染白细胞表现为细胞核型,偶见细胞浆核混合型.结论 HCMV pp65抗原血症时阳染的外周血白细胞的表现形式有3种,即细胞核型、细胞浆型以及细胞浆核混合型,其中细胞核型属细胞核内部型,并非细胞核表面附着型.结合共培养结果认为,细胞核型阳染细胞的检出更能提示病毒的活动.
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大鼠口面部躯体和上消化道内脏伤害性传入汇聚于三叉神经脊束间质核含CB神经元
三叉神经脊束间质核(interstitial nucleus ofthe spinaltrigeminal tract,INV)为位于三叉神经脊束内的一些灰质团块,经三叉神经和舌咽及迷走神经接受口面部的三叉神经躯体传入与上消化道的内脏伤害性传入.INV内含有大量含calbindingD-28k(CB)神经元,但尚不清楚支配口面部的三叉神经躯体传入与支配上消化道的内脏伤害性传入是否汇聚于INV内含CB的神经元.本文应用跨节追踪法并结合CB和Fos免疫组织化学的激光共聚焦显微镜和电镜技术,研究了下牙槽神经(interior alveolar nerve,IAN)的初级传入和上消化道伤害性信息向INV内含CB神经元的汇聚.结果如下:(1)将生物素化的葡聚糖胺(biotinylated dextranamine,BDA)和甲醛分别注入IAN和上消化道后,BDA跨节标记的浓密初级传入纤维和末梢分布于同侧INV内,在其膨大部较为集中;大量的CB和Fos免疫反应阳性神经元分布于双侧INV内,并与BDA注射侧的BDA标记末梢区相重叠;共聚焦显微镜观察显示,约半数CB免疫反应阳性的神经元同时呈Fos阳性的双标记神经元(74/153),其中部分双标神经元与IAN末梢形成紧密接触状.(2)辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)注射到IAN后,HRP跨节标记的纤维和末梢的分布与BDA标记的分布相似;电镜下观察到,INV内有大量CB免疫反应阳性神经元的树突和少量胞体,以及HRP标记的传入末梢,其中一些HRP标记的轴突终末分别与CB免疫反应阳性树突和胞体形成非对称型轴-树或轴-体突触.结果提示口面部躯体初级传入信息和内脏伤害性信息汇聚于INV内含CB的神经元上,可能在躯体传入信息对内脏伤害性信息的调制和内脏心血管活动中发挥重要作用.
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三羟异黄酮对豚鼠心室肌细胞内游离钙浓度的影响
用激光共聚焦显微镜观察研究三羟异黄酮(genistein,GST)对豚鼠心室肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响.结果用相对荧光强度(FI-F0/FI0,%)表示.实验结果显示,在正常台氏液、无钙台氏液和正常台氏液中加入3 mmol/L EGTA后,GST(10～40 μmol/L)浓度依赖性地降低细胞内钙浓度.蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂正钒酸钠(sodium orthovanadate)和L-型Ca2+通道激动剂Bay K8644可部分抑制正常台氏液时GST的效应.当细胞外液钙浓度由1 mmol/L增加到10 mmol/L而诱发心室肌细胞钙超载时,部分心室肌细胞产生可传播的钙波,GST(40 μmol/L)可降低钙波的传播速度和持续时间,终阻断钙波.以上结果提示,GST降低心室肌细胞内游离钙浓度,此作用与其抑制电压依赖性Ca2+通道、减弱酪氨酸激酶抑制和豚鼠心室肌细胞肌浆网内钙释放有关.
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采用共聚焦显微术对家兔呼吸道感受器进行观察
呼吸道感受器在机体对肺部物理和化学环境变化作出反应时起到重要作用,它们引起的反射具有调节或保护作用,或产生病理效应.基于电生理研究,可将呼吸道感受器分为四类,但它们的组织结构小详.由于对感受器形态的认识不足,阻碍了对其生理功能的理解.近来,我们采用共聚焦显微术与免疫组织化学方法(用钠钾ATP酶作为标记),首次高清晰度地展示了呼吸感受器结构.本文采用这种新方法在家兔中进行了系统观察.结果显示,各级气道均有多种不同的感受器结构.大气道中的结构往往比小气道中的复杂,虽然它们的大小、所在部位与走向不尽相同,但都有多个终端末梢.有些感受器埋置在气道平滑肌中,其结构便于感受对气道的机械性刺激;有些覆盖在气道上皮的表面,其形态适合于感受通过气道的刺激性物质;另一些则位于气道粘膜下,在上皮与平滑肌之间.有些传入神经轴突可支配多个感受器结构.据此,传入单纤维中记录到的电活动是来自一个感觉单位.后者可以由多个感受器组成.除了感受器之外,我们还观察到气道内神经节,它们与感受神经的轴突密切相关.本文证实气道内存在不同形态结构的感受器,并探讨了其生理分类.
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八肽胆囊收缩素激活钙离子通道和酪氨酸激酶诱导豚鼠心肌细胞内的游离钙增高
探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对豚鼠单个心肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i的影响及其信号转导机制.Fluo 3-AM标记酶消化法分离的单个心室肌细胞,用激光共聚焦显微镜测定细胞内[Ca2+]i的浓度.[Ca2+]i的变化用荧光强度(Fi)和相对荧光强度(Fi/F0%)表示.实验结果如下:(1)在含Ca2+1.0 mmol/L的Tyrode's液中,CCK-8(1～104pmoVL)均可引起[Ca2+]i快速显著上升(P＜0.01).(2)用钙离子鳌合剂EGTA(3 mmol/L)和钙离子通道阻断剂nisoldipine(0.5μmol/L)预孵育心肌细胞5 min,CCK-8(102pmol/L)仅可引起[Ca2+]i缓慢轻度上升(P＜0.01).(3)用非选择性CCK受体拮抗剂丙谷胺(proglumide 6μmo1/L)或酪氨酸激酶抑制剂genistein(1 μmol/L)预孵育心肌细胞5 min,则完全抑制CCK-8诱导的[Ca2+]i升高(P＜0.01).CCK-8可通过激活其受体控制的Ca2+通道,引起Ca2+内流,诱导细胞内Ca2+释放,引起豚鼠单个心肌细胞内[Ca2+]i上升,此作用可能由酪氨酸激酶介导.
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胍丁胺对大鼠心室肌细胞内游离钙浓度的影响
本研究旨在观察胍丁胺(agmatine, Agm) 对分离大鼠心室肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)的影响.用酶解方法分离大鼠心室肌细胞, 用Fluo 3-AM负载, 然后用激光共聚焦法测定单个心室肌细胞[Ca2+]i的荧光强度(fluorescence intensity, FI), 结果以FI 或相对荧光强度(F/F0%)表示.实验结果表明, 在正常台氏液(含钙 1.0 mmol/L)和无钙台氏液中, 单个大鼠心室肌细胞的荧光密度分别为128.8±13.8和119.6±13.6, 两者无差异.Agm 0.1、 1和10 mmol/L浓度依赖性地显著降低细胞的钙浓度; 在正常台氏液中加入EGTA 3 mmol/L, Agm同样降低细胞的钙浓度.KCl 60 mmol/L, PE 30 μmol/L, 和Bay-K-8644 10 μmol/L均升高心室肌细胞的[Ca2+]i. Agm同样降低高浓度KCl、 Bay-K-8644和PE诱发的心室肌细胞[Ca2+]i升高.当细胞外液钙浓度由1 mmol/L增加到10 mmol/L时, 诱发心室肌细胞钙超载, 同时部分心室肌细胞产生可传播的钙波(Ca2+ wave), Agm 1 mmol/L 降低钙波的传播速度和持续时间, 终阻断钙波.以上结果提示, Agm 对心室肌细胞的胞浆[Ca2+]i 具有抑制作用, 此作用通过阻断电压依赖性钙通道而实现; 并可能与抑制大鼠心室肌细胞内钙释放有关.
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皮肤三维成像在皮肤科的应用进展
皮肤三维成像是近年来新兴的光学皮肤影像学技术.它具有实时性、动态性、无损伤性、可重复性及可定量等优点,在皮肤病的临床诊断、鉴别诊断、评价疗效、判断预后等方面具有非常重要的价值.该文对皮肤三维成像在皮肤科应用的研究进展做简要综述.
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棘阿米巴角膜炎诊断和治疗进展
棘阿米巴(Acanthamoeba)是一类自由生活的小型原虫,广泛分布于自然界.棘阿米巴原虫可引起人原发性脑炎和角膜炎.自1974年Nagington等首次报道棘阿米巴角膜炎以来全世界已相继有数百例报道.棘阿米巴角膜炎是严重的致盲性眼病,其主要临床特点为眼部剧烈疼痛和环形角膜基质炎、角膜放射状神经炎.角膜轻度受损和局部抵抗力降低如皮质类固醇激素的不适当使用使棘阿米巴病原体易于侵入角膜而致病[1].由于阿米巴角膜炎临床表现多样,并可和其他致病微生物同时存在[2],早期确诊较为困难.随着科技的发展和研究的深入,阿米巴角膜炎诊断和治疗方面取得较快发展.
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β1整联蛋白、Fas蛋白在晶状体上皮细胞中的表达与白内障的关系
目的:了解糖尿病性白内障及并发性(高度近视)白内障患者晶状体上皮细胞(LECs)中β1整联蛋白与Fas蛋白的表达情况与LECs凋亡的关系.方法:应用流式细胞和共聚焦显微镜分别定量及定位检测β1整联蛋白、Fas蛋白两种蛋白在LECs中的表达.结果:LECs中β1整联蛋白Fas蛋白的表达在两种白内障间差异有统计学意义(P＜0.05).发现β1整联蛋白与Fas蛋白大部分共同定位于LECs的细胞膜上.结论:在糖尿病性白内障的形成中β1整联蛋白的作用很可能是一种促进LECs凋亡的蛋白,它与Fas蛋白一起促进LECs凋亡.
