利用吗啉代寡核苷酸技术下调早期斑马鱼胚胎lmna 基因的初步研究

目的：利用吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼 lmna 基因的技术方法。方法在斑马鱼 lmna 基因序列中选择靶点，设计针对斑马鱼 lmna 基因的吗啉代寡核苷酸序列（lmna－MO），构建能特异指示 lmna 基因表达的 lmna－EGFP－pCS2＋重组质粒，并通过显微注射方式将二者共注射入斑马鱼胚胎中，通过观察胚胎中绿色荧光表达量反应 lmna 基因表达量，并通过蛋白质印迹法检测胚胎中 lamin 蛋白表达量。结果蛋白质印迹法检测斑马鱼体内 lamin 蛋白的表达，分别有大小为69 KD 和62 KD 两种蛋白表达。设计并构建了 lmna－MO 和重组质粒 lmna－EGFP－pCS2＋，单独注射 lmna－EGFP－pCS2＋质粒后观察到从6 hpf 到96 hpf 胚胎均有绿色荧光蛋白表达；二者共注射后观察到，与对照组相比，实验组从6 hpf 至30 hpf 胚胎中绿色荧光蛋白表达量均不同程度下降或消失；蛋白质印迹实验结果显示实验组胚胎内 lamin 蛋白表达量明显下降。表明已成功下调了斑马鱼胚胎 lmna 基因表达。结论可通过 lmna－MO 和重组质粒 lmna－EGFP－pCS2＋共注射方法下调斑马鱼 lmna 基因表达，并通过绿色荧光蛋白表达量反映下调效果。该方法可为深入研究人核纤层病提供良好的动物模型。

巴贝西虫感染黑线仓鼠生物学特性的变化

目的：建立巴贝西虫感染的黑线仓鼠模型，明确感染后黑线仓鼠生物学特性的变化规律，为巴贝西虫病的检测与防治提供基础数据资料。方法腹腔注射含巴贝西虫的血液感染黑线仓鼠，感染的第0、2、4、6、8、10、12、14、16、23、30、37天每次取5只动物采集抗凝血和全血，制备血涂片，通过吉姆萨染色检测虫体繁殖情况；分离血液总 DNA，用 REAL－TIME PCR 检测巴贝西虫的在宿主体内的繁殖规律；用全自动生理生化检测仪测定血液生理生化指标；处死动物后分别采集心、肝、脾、肺、肾等器官，称重测定脏器系数；用 ELISA 法检测感染动物血清中IL－2浓度。结果感染后第4天黑线仓鼠体内的巴贝西虫数量多，之后整体呈下降趋势，在第12天有一个短暂升高。感染动物的脏器系数变化大的属于肝脏和脾脏，心、肺和肾脏系数在整个感染期内稍有波，均在正常值范围内。感染动物的血细胞均有波动，在第10、23天两次达峰值，其中白细胞变化为剧烈；检测到变化的血液生化指标在第12天达峰值。感染动物血清中的 IL－2在第10天达峰值，之后连续下降。结论感染巴贝西虫的黑线仓鼠具有典型的蜱传寄生虫病特点，病原侵入一周内达繁殖顶峰，且病原可在宿主体内长期潜伏。宿主免疫响应在第2周达到峰值，与免疫相关的脏器及血细胞有明显的应激反应。据此，可有针对性的开展巴贝西虫病的诊断与防治。

急性肺损伤大鼠呼吸膜 AQP1和 AQP5的表达

目的：确定水通道蛋白 AQP1及 AQP5是否在大鼠肺泡毛细血管膜（呼吸膜）表达，进而研究急性肺损伤（ALI）大鼠 AQP1和 AQP5的表达调节及激素干预的作用。方法采用亲和的抗人 AQP1和 AQP5抗体，应用免疫组化及免疫电镜的方法研究 AQP1及 AQP5在呼吸膜的分布。选用肺泡内灌注脂多糖（LPS）制作大鼠 ALI 动物模型，研究 ALI 时呼吸膜 AQP1及 AQP5的变化。结果免疫染色显示 AQP1主要表达于正常肺组织的微血管内皮，而 AQP5主要表达于肺泡 I 型上皮细胞。免疫组化分析进一步表明 LPS 灌注后4h ～48hAQP1及 AQP5在呼吸膜的表达均下降；AQP1蛋白于 LPS 灌注后24h 及激素干预后有部分恢复（P ＜0．05），而 AQP5无这种恢复现象。结论 ALI 时 AQP1及 AQP5在呼吸膜的表达减少，提示 ALI 时 AQP1和 AQP5的下降表达可能与其液体转运的异常有关。

金属硫蛋白表达在 C57BL／6J 小鼠肝细胞癌发生中的变化及意义

目的：了解金属硫蛋白（MTs）基因表达水平在小鼠肝细胞癌（HCC）发生过程中的动态变化及其规律，探讨 MTs 在 HCC 发生中的重要意义。方法将125只5～8周龄雄性 C57BL／6J 小鼠随机分为正常对照组和HCC 模型组。模型组小鼠于第1、2周分别腹腔注射一次二乙基亚硝胺（100 mg／kg，50 mg／kg），第3周起灌胃给予乙醇（53％，5 mL／kg，5 d／周），直至35周；正常组始终给予等量灭菌自来水灌胃。分别于实验1、3、9、13、24及35周末处死小鼠，收集肝组织样本并计算肝脏指数。采用组织病理学 HE、Masson 及网状纤维染色检测肝组织损伤及HCC 发生情况，采用酶联免疫吸附法检测肝组织匀浆丙二醛（ MDA）的活性；采用实时荧光定量 PCR 分析 MTs 转录水平。结果模型组小鼠可见进行性的肝脏病变，35周末时，肝脏质地显著变硬，表面可见大小不等结节形成，约50％小鼠可见肝细胞异常核分裂像和异常的肝板结构等 HCC 发生病理改变，具有显著增加的肝脏指数；不同时段均表现出增加的 MDA 活性；实验13周前各时段具有显著增加的 MTs mRNA 水平，24周后可见 III 级纤维化形成，且 MTs mRNA 水平显著下降，甚至低于正常水平。结论小鼠肝组织 MTs mRNA 水平从损伤初期的显著增加直至显著纤维化后的低表达变化，表明 MTs 表达下调与 HCC 发生有关。

应用16S rRNA 高通量测序法比较人与常用实验动物口腔菌群的异同

目的：应用16S rRNA 高通量测序法测定几种常用实验动物（西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰兔、Wistar 大鼠）的口腔菌群，并和人的口腔菌群进行对比分析，为口腔微生态的动物模型研究提供基础性资料。方法用一次性棉拭子采集西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰兔、Wistar 大鼠和人的口腔菌群标本，提取样品总 DNA，使用带标签的通用引物扩增16S rRNA V4区片段，Illumina 测序，经 BIPES 以及 QIIME 分析比较菌群多样性及结构。结果人与5种常用实验动物口腔菌群的丰富度均差异显著（P ＜0．05），不同种类动物有其各自独特的口腔菌群，但猴的口腔菌群与人为相似。结论根据与人口腔某类菌群的相似程度，5种动物中，猴口腔的梭菌属（Fusobacterium）、卟啉菌属（Porphyromonas）水平与人相似，提示猴可能是研究人口腔菌群较适宜的模型动物。从特定菌门角度，西藏小型猪可能是研究与变形菌门（Proteobacteria）相关疾病的较适宜模型动物；比格犬可能是研究与螺旋体门（Spirochaetes）相关疾病的较适宜模型动物。

尿通卡克乃其片大鼠长期毒性实验的血液指标变化

目的：探讨尿通卡克乃其片大鼠长期毒性试验血液学指标变化。方法SD 大鼠120只，雌雄各半，随机分为对照组，尿通卡克乃其片低、中、高剂量组。对照组为灌胃给予0．5％羧甲基纤维素钠混悬液，低、中、高剂量组分别灌胃给予尿通卡克乃其片0．32g、1．6g、3．2g（生药）／kg? d，每周6 d，连续180 d，分别观察大鼠在给药90 d、180 d 及停药后30 d 一般状况、血液细胞变化、血生化变化，电解质及血凝指标变化。结果在实验期间大鼠未见死亡或无明显毒性反应。与对照组比较，在实验期间大鼠红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、血小板计数（PLT）、白细胞计数（WBC）、淋巴细胞百分含量（LYMP％）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、肌酐（Crea）、总胆固醇（TCHO）、甘油三酯（TG）、肌酸磷酸激酶（CK）；钾离子浓度（K＋）、钠离子浓度（Na＋）、氯离子浓度（Cl－）、凝血酶原时间（PT），具有统计学差异（P ＜0．05～P ＜0．01），但未见时间、剂量规律性，无病理意义。结论0．32 g、1．6 g、3．2 g（生药）／kg? d 剂量下灌胃尿通卡克乃其片原料粉180 d 对大鼠血液指标无明显异常，该药在临床剂量下长期使用是安全的。

小鼠尾静脉注射与心肌注射腺病毒载体转染效率的比较

目的：比较小鼠尾静脉注射或心肌注射腺病毒载体后心脏组织和肝脏组织中靶基因的转染效率。方法构建表达绿色荧光蛋白 GFP 的腺病毒载体（GFP－Ad）。 C57BL／6小鼠20只随机分为尾静脉注射腺病毒载体组与心肌注射腺病毒载体组各10只，用实时定量 PCR 检测不同时间点小鼠心肌组织和肝脏组织中 GFP 的mRNA 表达水平，并且通过荧光显微镜观察 GFP 荧光表达情况。结果心肌注射腺病毒载体组心脏组织中 GFP 的mRNA 表达水平明显高于尾静脉注射腺病毒载体组，心肌注射腺病毒载体组心脏组织中荧光强度明显增强。同时，我们发现两组的肝脏组织中 GFP 的 mRNA 表达水平和荧光强度均明显高于心脏组织中；且在尾静脉注射腺病毒载体组，肝脏组织中 GFP 的 mRNA 表达水平和荧光强度在7 d 达高峰，而心肌注射腺病毒载体组则在3 d 达高峰。结论提高心脏组织中靶基因的转染效率宜采用心肌注射腺病毒载体的方法；对于肝脏组织转染效率，两种注射方法均可，鉴于尾静脉注射腺病毒载体的方法创伤小，宜采用。

蛋白磷酸酶5（PP5）对小鼠脂肪代谢的影响

目的：利用蛋白磷酸酶5（PP5）基因敲除小鼠，探究 PP5在小鼠脂肪代谢中的作用。方法随机选取6周龄雄性 PP5基因敲除（PP5 KO）和野生型（WT）小鼠，高脂饲养6周后，应用 HE 染色和油红 O 染色技术对小鼠肝脏结构和脂滴积累进行检测，应用 Western blotting 和 real－time PCR 技术检测肝脏组织中脂代谢相关基因的表达情况。同时应用 PP5 KO 和 WT 小鼠成纤维细胞，在体外观察 PP5对脂肪分化的影响。结果与 WT 小鼠相比，高脂饲养后 PP5 KO 小鼠体重与 WT 小鼠相比显著减轻，肝脏中脂滴数量显著较少且脂滴较小。体外实验发现与 WT 小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）相比 PP5 KO MEF 细胞脂肪分化显著较弱，脂滴较小。此外，在 PP5 KO 肝脏组织中脂肪分化标记基因 CD36、AP2、PPARγ2和 Glut4的相对表达量显著降低，而能量代谢相关蛋白糖皮质激素受体（GR）的磷酸化水平显著增加，解偶联蛋白1（UCP1）表达量也显著升高。结论 PP5通过调节 GR 的去磷酸化影响机体脂肪分化和能量代谢调控小鼠脂肪代谢。

不同来源高度免疫缺陷小鼠微卫星 DNA 遗传检测的分析

目的：对不同来源的高度免疫缺陷小鼠进行遗传背景的检测分析，旨在发现经遗传修饰的小鼠遗传背景是否符合近交系遗传特征。方法对收集到的4种不同来源以 NOD 为背景的高度免疫缺陷小鼠，选取30个微卫星 DNA 位点进行 PCR 检测，通过凝胶电泳结果和 STR 扫描确定基因型，进行遗传分析。结果4组20个样本中共有17个位点呈现多态性，A、B 两组小鼠30个微卫星位点表现为纯和，其他两组小鼠中不同位点均出现杂合个体；A、B 两组遗传距离小，保持着较高的遗传相似度。结论研究表明，不同来源高度免疫缺陷小鼠遗传背景有差异。

A53T α－synuclein 抑制 SH－SY5Y 细胞2型囊泡单胺转运体的表达

目的：研究稳定表达 A53T α－synuclein 对神经母细胞瘤 SH－SY5Y 细胞中2型囊泡单胺转运体（VMAT2）蛋白表达的影响。方法构建 A53Tα－synuclein 真核表达载体，用脂质体 lipofectamineTM 2000转染 SH－SY5Y 细胞，经 G418筛选获得稳定转染单克隆细胞株；分别采用 Western blotting 及 DCFH－DA 染色检测细胞系A53T α－synuclein 过表达对 VMAT2蛋白的表达及细胞内活性氧类物质（ROS）水平的影响。结果Western blotting结果显示 VMAT2的表达在稳定表达 A53T α－synuclein 的细胞系中明显降低。 DCFH－DA 染色结果显示稳定表达A53T α－synuclein 细胞系内 DCF signal （507．3±7．1）较对照组（410．7±10．5）明显增多（P ＜0．05）。结论A53Tα－synuclein 能够通过抑制 VMAT2的表达，增加细胞内的 ROS 水平，在帕金森病的发病过程中发挥重要作用。

[ Abstract] Complex traits are multifactorial traits controlled by polygenic host factors.These trait-related phenotypic characteristics and performance including body weight, blood chemistry, immune cell profiles, as well host susceptibility to infectious and chronic diseases.In recent years, tremendous efforts were invested aiming to map the host genetic factors attribute to these traits and subsequently clone the gene/s underlying these loci.In parallel to human studies, a number of mouse models and approaches were developed aimed to enhance the mapping process and the gene cloning.These include of using resources such as F2, backcross, advanced intercross lines, outbred populations, consomic, congenic and recombinant inbred lines (RIL).The constraints of these approaches were the limited resolution mapping of genomic regions of the quantitative trait loci (QTL) associated with the trait of interests, and the limited genetic diversity observed in the parental founders.To overcome these limitations, a new genetically highly diverse recombinant inbred lines of mouse population was established, namely the Collaborative Cross (CC), created from full reciprocal mating of 8 divergent strains of mice: A/J, C57BL/6J, 129S1 /SvImJ, NOD/LtJ, NZO/HiLtJ, CAST/Ei, PWK/PhJ, and WSB/EiJ.By intercrossing these eight founders to generate the different CC lines, the genetic makeup of the newly developed resource is completely different from the eight parental lines, and will show heterosis, which subsequently will response differently comparing with their original founders.Finally, our results suggest that it is not essential to defining the phenotypic response of the eight parental lines, prior of assessing the CC lines, because it is believed that genetic interaction of the new genetic makeup of the new lines will reveal new phenotypic response, which completely different from the parental lines.In this report, we present to the community the power of the CC for dissecting variety of complex traits including host susceptibility to infectious and chronic diseases as well body performance traits.Based on our results from a variety of studies, we recommend to the community, that the best strategy of using this population is to aim of phenotyping about 50 and more of CC lines, with limited number of biological replicates (3 -4 mice per line), and subsequently using the publicly available high dense genotype information of the CC lines as well the sequence database of the eight founders, it will be possible performing QTL mapping to a unprecedented precision genomic regions less than 1 MB, subsequently lead to identify potential strong candidate genes.These achievements are believed cannot be obtained with any other currently available mouse resource populations.

复杂性状遗传 CC 小鼠与精准医学研究

生物组学技术在生物学、医学上的转化应用，为精准的个体化预防、诊断、治疗提供了关键性的技术体系，精准医学模式应运而生。实验动物学研究是疾病发病机制研究转化到临床不可或缺的手段。为应对目前严重危害人类疾病的复杂性、多样性特点，2002年国际复杂性状联盟（Complex Trait Consortium，CTC）倡议研发建立新的小鼠遗传资源库；通过不同纯系小鼠品系间的杂交创建小鼠复杂性状遗传资源库（Collaborative Cross mice，CC 小鼠）。随着原始亲本小鼠（founder）选定、杂交品系的繁殖，CC 小鼠在检测小鼠表型、疾病易感性、疾病发生发展及预后与遗传因素的关系方面进行了系列的尝试。文中将就 CC 小鼠在疾病发生发展及药物评价个体化研究中的应用做一简要介绍。

复杂性状遗传 CC 小鼠在传染病领域的应用及研究进展

动物模型是传染病防控研究体系中的重要支撑环节，起到连接实验室基础科研和临床诊疗的桥梁作用。小鼠是目前被广泛使用的传染病动物模型，然而，免疫系统完整的成熟小鼠很多情况下对某些传染病病原并不易感。近年来，开发临床病例表征与人类更接近的协同杂交（Collaborative Cross， CC）小鼠，又称复杂性状遗传小鼠资源是目前的研究热点和建立疾病动物模型的另一切入口。本文将对目前使用 CC 小鼠感染传染病病原（包括病毒、细菌、真菌等）后呈现出表型多样性的研究报道做一综述，以期为进一步研究 CC 小鼠对不同传染病的易感性，丰富我国传染病动物模型资源库，为应对各种重大及新发突发传染病及临床的精细化诊疗提供有价值的参考数据。并在此基础上，提出一系列有关 CC 小鼠资源目前亟待解决的关键科学技术问题，同时对未来在传染病领域的应用作一展望，以作抛砖引玉之用。

复杂性状遗传 CC 小鼠--肿瘤研究新平台

癌症是由于机体细胞失去正常调控过度增殖而引发的一系列复杂性状疾病的统称，其本质上是一种基因疾病。用于传统肿瘤小鼠模型的重组近交（RI）品系由于只起源于两个近交祖系，因此规模小且等位基因多样性较少，在统计功效上存在局限性。复杂性状遗传（Collaborative Cross mice， CC）小鼠是由来自八个原始种系近交产生的数百种基因型不同的小鼠品系，能够体现不同小鼠亚种的遗传学变异，具有高遗传多样性，大种群规模等重要特征。它可以模拟人类复杂性状疾病中不同人群对病因或治疗方法个体易感性的差异，为促进复杂性状疾病易感基因筛查、基因功能发现等方面的研究提供了一个更好的研究工具与信息平台。本文就 CC 小鼠在医学应用中的研究现状、挑战性与局限性、以及其在肿瘤研究中的应用前景进行综述。