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不同发育天数冻融单囊胚移植的临床结局比较
目的:研究D5和D6天冷冻胚胎冻融单囊胚移植的临床结局,探讨不同发育天数囊胚的发育潜能,为进一步改进囊胚冷冻方案提供依据.方法:回顾分析922例复苏周期单囊胚移植患者的资料,根据冷冻时间不同,分为D5冷冻组(n=563)和D6冷冻组(n=359),待患者子宫内膜达到8～12mm时,复苏5h后移植.结果:D5冻冻组的生化妊娠率(63.23％)和临床妊娠率(56.48％)均显著高于D6冷冻组(50.97％和44.85％)(P≤0.01).结论:D5冻融单囊胚移植相较于D6冻融单囊胚移植更有利于胚胎着床,获得更高的临床妊娠率.
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开放式和封闭式玻璃化冷冻法对人类胚胎发育潜能的影响
目的:比较开放式与封闭式自制叶片玻璃化冷冻技术对人早期胚胎冷冻复苏的效果.方法:以自制开放式与封闭式的叶片为冷冻载体,用玻璃化冷冻方法冷冻体外受精-胚胎移植第3天移植后剩余的优质胚胎,观察胚胎复苏及临床妊娠情况.结果:开放式冻存组共复苏112个周期、288个胚胎,胚胎复苏率、复苏5h继续卵裂率、空泡出现率、胚胎丢失率、临床妊娠率、植入率及流产率分别为97.2%、30.7%.9.3%.1.7%、50.5%、23.6%、14.5%,相较于封闭式冻存组(共复苏93个周期、222个胚胎)的胚胎复苏率(96.4%)、复苏5h继续卵裂率(34.6%)、空泡出现率(7.9%),胚胎丢失率(1.4%),临床妊娠率(59.8%),植入率(29.0%)、流产率(10.9%)均无统计学差异(P>0.05).结论:封闭式玻璃化冷冻法能获得与开放式同样的冷冻效率,且能使胚胎与液氮完全隔离,能更好地保护胚胎避免潜在的病原微生物、病毒的污染,是冷冻人早期胚胎理想的方法.
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玻璃化冷冻法对小鼠MⅡ卵纺缍体及染色体的影响
目的:探讨玻璃化冷冻法对小鼠MⅡ卵纺缍体及染色体的毒性.方法:收集小鼠MⅡ卵,分A组(新鲜对照组)、B组、C组和D组(玻璃化冷冻法冻融后分别培养0h、1h和3h固定)及E组、F组和G组(M Ⅱ卵经玻璃化冷冻液处理后分别培养0h、1h和3h固定),共7组,固定后免疫荧光标记纺锤体和染色体.结果:各组纺锤体正常率无显著差异(P>0.05),染色体正常率:B组显著低于A组(50%VS 87.5%,P<0.01),E组(47.62%)和F组(45%)显著低于A组和G组(75%)(P<0.05).纺锤体和染色体均正常率:B组显著低于A组(41.67%vs 75%,P<0.05),E组(47.62%)和F组(45%)显著低于A组和G组(75%)(P<0.05).B、C、D及E、F、G组的细胞骨架正常率依次提高,且玻璃化冷冻组(B组、C组和D组)和冷冻液暴露组(E组、F组和G组)相应时段(0h、1h及3h)比较(即B组与E组、C组与F组及D组与G组比较)均无显著差异(P>0.05).结论:冷冻保护荆的细胞毒性在玻璃化冷冻损伤中起主要作用,但它对纺缍体的损伤是可逆的.
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兔卵巢组织玻璃化冷冻的实验研究
目的:探讨玻璃化冷冻法保存兔卵巢组织的效果.方法:随机将25只新西兰雌兔分为对照组(5只)、慢速冷冻组(10只)和玻璃化冷冻组(10只),比较各组冻融前后卵巢组织学、超微结构、卵泡凋亡(原位末端标记法,TUNEL)和子宫系膜内移植后卵巢功能的恢复情况.结果:新鲜组织、慢速冷冻复苏组织和玻璃化冷冻复苏组织中正常形态卵泡比例分别为87.36%、81.96%和82.72%,两冷冻组正常卵泡比例均低于对照组,差异有统计学意义﹙P﹤0.05),但玻璃化冷冻组与慢速冷冻组差异无统计学意义(P＞0.05).3组间卵泡凋亡比率分别为21.4%、13.5%和17.1%,差异无统计学意义(P＞0.05);3组移植后兔动情周期出现率均为100%,动情周期出现天数差异无统计学意义﹙P＞0.05);移植存活的卵巢组织内可见各级形态正常的卵泡发育.结论:玻璃化冷冻可有效保存卵巢组织的结构和功能,是一种简单、可行的兔卵巢组织冷冻保存法.
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玻璃化冷冻技术的应用及研究进展
玻璃化冷冻技术作为辅助生殖中的一项重要技术手段,相比传统的程序冷冻法具有诸多优势.目前已在卵母细胞和各个胚胎期应用,显示了较好的可行性与稳定性.但是,玻璃化冷冻效果仍会受到一些因素影响,如样本自身质量、冻融方法、冷冻保护剂和冷冻载体的选择等.再者,玻璃化冷冻技术应用时间不长,临床结局以及新生儿出生状况跟踪相对匮乏,还需长期安全性评价.本文就玻璃化冷冻技术的发展、应用、影响因素及安全性评价方面做一综述.
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整体卵巢冷冻及移植的研究进展
卵巢组织冷冻是保存女性生育能力和内分泌功能的一种极具潜力的方法。卵巢组织移植后的缺血损伤导致卵泡大量丢失，同时由于小块卵巢组织所含的卵泡少，因此移植术后难以长久维持卵巢功能。整个卵巢行显微血管吻合移植术可避免移植后的缺血性损伤。适宜的整体卵巢的冷冻保存方法是施行整体卵巢移植的难点，目前未有统一的标准方法。综述国内外对整体卵巢冷冻及移植的研究进展，探讨如何选择合适的冷冻方法。
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卵巢移植的研究进展
卵巢移植是伴随肿瘤治疗技术的发展而逐渐建立起来的一项技术。卵巢组织冷冻及移植后健康婴儿的出生证明了此技术的可行性，特别是近年癌症患者低龄化趋势渐趋明显，以及大剂量放化疗导致的患者生育力严重下降、丧失，内分泌失调等诸多副作用，严重影响了癌症幸存者的生活质量。因此，作为一种年轻女性生育力的保存方法，卵巢组织冻存和移植技术成为近年的研究热点。目前该技术尚未完全成熟，移植效果会因冷冻方法、卵巢组织块大小、移植部位、抗氧化损伤、生长因子、机械因素等诸多因素的影响而不易确定。此外，卵巢移植技术也面临成功率较低，移植后将冻存卵巢组织内残存肿瘤细胞重新植入体内的风险，以及移植相关的伦理问题等许多亟待解决的问题。总之，目前尚未形成规范、统一的卵巢组织冻存、移植技术和效果评定标准，但可以相信，随着医学技术的发展和进步，卵巢组织冷冻及移植技术将会为女性肿瘤患者生育力和内分泌功能的保存带来福音。
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新型管式冷冻载体在人类胚胎库管理方面的应用
目的:针对现有玻璃化冷冻载体在胚胎库管理方面的不足,探讨新型管式冷冻载体的囊胚冷冻效果及其在人类胚胎库管理方面的应用.方法:选取D5、D6单囊胚玻璃化复苏移植的患者,其中杆式冷冻载体1257例,新型管式冷冻载体564例,比较复苏后的胚胎存活率及临床妊娠率.结果:杆式冷冻载体与管式冷冻载体存活胚胎率分别为99.05％(1245/1257)、100％(564/564),差异有统计学意义(x2=5.4199,P=0.0199),临床妊娠率分别为58.80％(732/1245)、60.28％(340/564),差异无统计学意义(x2=0.3562,P=0.5506).管式冷冻载体相比杆式冷冻载体更节约空间,胚胎定位精确,取放速度更快.结论:与杆式冷冻载体比较,新型管式冷冻载体的临床妊娠率无显著差异,但在空间利用、位置准确性及拿取时间方面存在优势,更适用于实际的临床操作及胚胎库的管理.
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抗冷冻蛋白 III 对小鼠胚胎冷冻保护的作用
目的：将抗冷冻蛋白III（ AFPIII）应用于小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻保存，观察其对细胞微丝骨架结构和冷冻复苏后发育潜能是否有保护作用。方法收集小鼠2-细胞期胚胎1200枚，随机分为新鲜对照组、玻璃化冷冻组和添加AFPIII玻璃化冷冻组（ AFPIII终浓度为500 ng/mL），每组400枚，其中200枚胚胎进行复苏后囊胚培养，200枚进行细胞微丝的免疫荧光染色，比较各冷冻组胚胎复苏存活率和其后的囊胚形成率以及各组微丝完整胚胎比率。结果添加AFPIII玻璃化冷冻组胚胎复苏率高于玻璃化冷冻组，差异有统计学意义（P＜0．05）。新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组囊胚形成率、微丝完整胚胎比率均高于玻璃化冷冻组，差异有统计学意义（P＜0．05）；新鲜对照组和添加AFPIII玻璃化冷冻组之间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 AFPIII对小鼠2-细胞期胚胎玻璃化冷冻有保护作用。
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玻璃化冷冻对人体外成熟卵母细胞微丝分布及发育潜能的影响
目的：通过对比分析人体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻前后的微丝分布和发育潜能，探讨冷冻对卵母细胞发育潜能的影响及相关的细胞学机制。方法收集人未成熟卵母细胞，体外培养为成熟卵母细胞。获得的成熟卵母细胞随机分为新鲜组和玻璃化冷冻组，分别行受精和免疫荧光染色分析。受精后观察2PN数、囊胚数及优质囊胚数等指标，染色后用激光共聚焦显微镜观察微丝分布形态。结果玻璃化冷冻复苏后卵母细胞成活率为83．74％。新鲜组2PN数、囊胚数及优质囊胚数均高于玻璃化冷冻组（ P＜0．05）。新鲜组微丝正常率为71．67％，玻璃化冷冻组为67．50％，两组间差异无统计学意义（P＝0．71）。结论适当的玻璃化冷冻复苏方案未改变人体外成熟卵母细胞的微丝分布。但是，冷冻后卵母细胞的发育潜能降低，因此单纯观察微丝分布不能作为冷冻对卵母细胞发育潜能的评价指标。
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改良的玻璃化液冻存乳鼠卵巢异体原位移植后生殖功能的恢复
目的：探讨一种改良的玻璃化液冻存乳鼠卵巢，复苏后进行异体原位移植，评价其对卵母细胞成熟、受精及胚胎发育潜能的影响。方法乳鼠卵巢进行ED20和改良的EG5．5/30液玻璃化冻存，复苏后的乳鼠卵巢一部分酶解消化，通过荧光活力检测卵子的存活率；激光共聚焦显微镜观察α-tubulin的免疫荧光检测卵子内细胞骨架的变化。一部分乳鼠卵巢进行成年去势雌鼠的原位移植。标本随机分为新鲜组和新鲜移植组；ED20液冷冻组和ED20液冻融移植组；EG5．5/30液冷冻组和EG5．5/30冻融移植组。术后15 d，受体鼠同雄鼠合笼，统计移植6个月内的产仔情况；术后6个月，检测恢复动情周期的受体鼠雌二醇（E2）水平。结果玻璃化冻融乳鼠卵巢后， ED20液冷冻组和EG5．5/30液冷冻组卵子存活率（87．0％，84．6％）低于新鲜组（92．6％）（P＜0．05）；冻融后卵子内微丝和微管结构受损，荧光强度均低于新鲜组（P＜0．05）；接受冻融卵巢原位移植的受体鼠可以实现自然产仔，但两冷冻液冻融移植组首窝产仔时间、平均每窝产仔数、产仔总数均较新鲜移植组差异有统计学意义（P＜0．05）。结论改良的EG5．5/30液冻存幼鼠卵巢复苏后异体原位移植同ED20液效果相似，受体鼠可诞生正常子代，但是生殖储备和生育力明显下降。
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三种玻璃化液对新生大鼠卵巢玻璃化冷冻效果的比较
目的 比较三种玻璃化液低温冻存新生大鼠卵巢的效果,为人卵巢组织冷冻的保护剂选择提供实验依据.方法 将36只出生1d的大鼠卵巢进行玻璃化冷冻,卵巢标本随机分为4组,新鲜对照组和EFS40、EG5.5、改良的EG5.5/30液冷冻实验组.分别通过光镜组织结构观察、荧光活力检测、TUNEL实验和免疫组织化学分析进行冷冻效果的比较.结果 EFS40、EG5.5、改良的EG5.5/30组冻融后存活卵泡的百分率低于新鲜对照组(P＜0.05)；三种玻璃化液冷冻实验组卵泡凋亡率均高于新鲜对照组(P＜0.05)；EFS40和EG5.5组,卵泡内Bcl-2阳性表达率较新鲜对照组下降(P＜0.05),Bax阳性表达率则较新鲜对照组上升(P＜0.05)；改良的EG5.5/30组Bcl-2、Bax阳性表达率趋势与EFS40、EG5.5组相同,但均与新鲜对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 与EFS40、EG5.5液相比,改良的EG5.5/30液更适合新生大鼠卵巢的玻璃化冻存.
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慢速冷冻法、玻璃化冷冻法保存小鼠卵巢组织的效果对比观察
目的 对比分析慢速冷冻法、玻璃化冷冻法保存小鼠卵巢组织的效果.方法 将BALB/C雌性小鼠随机均分为慢速冷冻组、玻璃化冷冻组,取卵巢组织后分别迸行慢速冷冻、玻璃化冷冻.冷冻21天结束时,取卵巢组织迸行病理学观察,比较两组各级卵泡正常率;采用免疫组化法检测卵巢组织中血管生成素2 (Ang-2)及其受体酪氨酸激酶受体2(Tie-2)表达.结果 慢速冷冻组始基卵泡正常率高于玻璃化冷冻组(P<0.05),初级卵泡、次级卵泡正常率比较差异均无统计学意义(P 均 >0.05).两组颗粒细胞冷冻前Ang-2(+++)、Tie-2(+++)阳性表达率均高于冷冻后,慢速冷冻组解冻后颗粒细胞 Ang-2(+++)、Tie-2(+++)阳性表达率均高于玻璃化冷冻组;两组卵泡膜细胞冷冻前Ang-2、Tie-2阳性表达率均高于冷冻后,慢速冷冻组解冻后卵泡膜细胞 Ang-2、Tie-2阳性表达率均高于玻璃化冷冻组;组间及组内比较 P均 <0.05.结论 慢速冷冻法、玻璃化冷冻法均会损伤卵巢组织内各级卵泡,并导致Ang-2、Tie-2表达变化,但慢速冷冻法对卵巢组织的损伤更小.
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玻璃化冷冻对胚胎体内外发育潜能的影响
目的 观察新鲜8-细胞胚胎和玻璃化冷冻复苏8-细胞胚胎在囊胚形成率、囊胚孵出率及胚胎种植率、小鼠出生率的差异,探讨玻璃化冷冻对胚胎体内外发育潜能的影响.方法 性成熟期雌鼠(＞6～7周龄)106只,取2-细胞胚胎,培养至6～8细胞胚胎时分为新鲜胚胎进行移植(新鲜移植组)和玻璃化冷冻(玻璃化冷冻组),2周后复苏移植.2组各取50枚移植前胚胎,体外培养48～72 h,观察2组胚胎体外培养发育至囊胚及囊胚孵出情况.新鲜胚胎及复苏后的8-细胞胚胎经1～3 h培养,选择外形正常胚胎移植于假孕63～67 h的受体母鼠的两侧子宫中,妊娠17～20 d自然分娩后记录产仔数,比较2组妊娠率、小鼠出生率.结果 新鲜移植组囊胚形成率、孵出率、妊娠率、出生率分别为92％,84％,48.93％,13.16％,玻璃化冷冻组囊胚形成率、孵出率、妊娠率、出生率分别为90％,86％,47.06％,12.62％,2组差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 玻璃化冷冻复苏对小鼠胚胎体内外发育潜能无明显影响.
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2种冷冻方法对人早期胚胎冷冻复苏效果比较
目的:比较栽杆玻璃化冷冻法与程序冷冻法对人早期胚胎冷冻复苏的效果.方法:将接受体外受精-胚胎移植患者剩余的Ⅰ～Ⅲ级胚胎进行程序冷冻或栽杆玻璃化冷冻,比较胚胎复苏后的复苏率、优胚率、临床妊娠率、种植率等指标.结果:载杆玻璃化冷冻复苏66个周期,253个胚胎、存活192个(75.89%),复苏后优胚173个(90.10%),移植66个周期,临床妊娠26个周期(39.39%).种植率19.25%,流产2个周期.程序冷冻复苏105个周期,589个胚胎、存活327个(55.52%),复苏后优胚268个(81.96%),移植105个周期,临床妊娠32个周期(30.47%),种植率15.18%,流产4个周期.载杆玻璃化法冷冻后的胚胎复苏率和优胚率明显高于程序冷冻法(P<0.01,P<0.05),临床妊娠率、种植率略高于程序冷冻法(P>0.05).结论:栽杆玻璃化冷冻法是一种有效的胚胎冷冻方法,其复苏率和复苏后优胚率均明显高于传统的程序冷冻法,可以提高胚胎的有效使用.
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玻璃化冷冻胚胎移植对小鼠子代发育和学习记忆能力的影响
目的:初步探讨小鼠胚胎玻璃化冷冻对子代发育及学习记忆能力的影响.方法:昆明雌性小鼠106只超排卵受孕后,取出胚胎分为2组,冷冻组采用玻璃化冷冻方法冷冻优质胚胎816枚,并于2周后复融、移植;对照组移植新鲜优质胚胎752枚.将2组胚胎移植入假孕小鼠体内.记录2组仔鼠出生第0、3、7、14、21、28、60天的体质量,观察耳廓分离、上下牙萌出、张耳、睁眼、全身绒毛、全身白毛、雄性仔鼠睾丸下降、雌性仔鼠阴道开口等生长发育指标达标时间,测试平面翻正、前肢悬挂、爬行、空中翻正等神经反射和运动协调功能达标时间,出生后60 d对仔鼠进行迷宫实验.结果:仔鼠体质量逐渐增加,2组同一时间点比较,差异无统计学意义(F时间=12.021,P=0.001;F组间=0.187,P=0.163).耳廓分离、上下牙萌出、张耳、睁眼、全身绒毛、全身白毛、雄性仔鼠睾丸下降、雌性仔鼠阴道开口等达标的时间,测试平面翻正、前肢悬挂、爬行、空中翻正等达标的时间,以及学习记忆能力比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:玻璃化冷冻对子代小鼠生长发育和记忆功能无明显影响.
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玻璃化冷冻法对冻融胚胎移植周期结局的影响
目的:探讨玻璃化冷冻法对冻融胚胎移植周期结局的影响.方法:对324个玻璃化冷冻人卵裂期胚胎复苏周期和146个程序化慢速冷冻胚胎复苏周期进行分析,比较2组冷冻胚胎复苏后的存活率、完整率、种植率、临床妊娠率、孕周、新生儿身高及体质量等指标.结果:玻璃化冷冻组的胚胎完整率、临床妊娠率均高于程序化慢速冷冻组(83.24％ vs47.54％,x2=179.772,P＜0.001；37.38％ vs 27.66％,x22=4.073,P=0.044)；2组流产率、分娩孕周、新生儿出生体质量及身高比较,差异无统计学意义(P均＞0.05).结论:玻璃化冷冻胚胎较程序化慢速冷冻法有更高的复苏胚胎完整率及临床妊娠率,可在临床上安全应用.
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3种玻璃化冷冻小鼠生发泡期卵母细胞效果比较
目的:比较3种玻璃化冷冻对小鼠生发泡期卵母细胞的存活及胚胎发育潜能的影响.方法:将小鼠生发泡期卵丘复合物(n=175、177、190)和裸卵(n=150、149、150)分别随机分为3组:采用一步乙二醇法、乙二醇加二甲基亚砜法、三步乙二醇法进行冷冻保存.解冻存活体外培养成熟后行卵胞浆内单精子显微注射受精,进一步评价胚胎发育潜能.结果:冻融小鼠生发泡期卵丘复合物,三步乙二醇法与一步乙二醇法的存活率、成熟率、受精率均高于乙二醇加二甲基亚砜组(P均<0.05);三步乙二醇法的优质胚胎和囊胚率均高于一步乙二醇法和乙二醇加二甲基亚砜法(P均<0.05).冻融小鼠生发泡期裸卵,三步乙二醇法的存活率及三步乙二醇法、一步乙二醇法的受精率及卵裂率均高于乙二醇加二甲基亚砜法(P均<0.05).三步乙二醇法中,卵丘复合物组的存活率、成熟率、受精率、卵裂率及优质胚胎率均高于裸卵组(P均<0.05).结论:3种玻璃化冷冻中,三步乙二醇法可以获得高质量的冻融小鼠生发泡期卵母细胞,是一种理想的冷冻方法;带完整卵丘颗粒细胞的生发泡期卵母细胞的冻融效果更佳.
关键词： 生发泡期卵母细胞 玻璃化冷冻 体外培养 卵胞浆内单精子显微注射 小鼠 -
冻融胚胎移植周期临床结局的影响因素
目的:探讨玻璃化冷冻胚胎复苏移植临床结局的影响因素.方法:回顾性分析2 430个冻融胚胎移植周期,研究患者年龄、授精方式、内膜厚度、胚胎冷冻保存时间、胚胎在平衡液中的平衡时间和胚胎质量对冻融周期胚胎移植结局的影响.结果与结论:年龄(β=-1.029,P<0.001)、胚胎冷冻保存时间(β=-0.101,P<0.05)和胚胎质量(D3胚胎和D5/D6囊胚质量的β分别为-2.824和-2.878,P<0.001)是冻融胚胎移植临床妊娠率的主要影响因素.
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两种冷冻方法对牛卵巢组织窦前卵泡活性的影响
目的：探讨两种冷冻方法对牛卵巢组织窦前卵泡活性的影响。方法：取新鲜的牛卵巢组织随机分为新鲜对照组、程序化冷冻组和玻璃化冷冻组，分别加入Liberase DH酶消化，然后挑取窦前卵泡并分类计数，用calcein AM以及ethidium homodimer对窦前卵泡进行荧光染色，鉴定窦前卵泡的活性。结果：3组各级卵泡的数量及分布差异无统计学意义（ P＝0．765）；与新鲜对照组（91％）相比，程序化冷冻组和玻璃化冷冻组窦前卵泡中未受损卵泡所占比例（80％和78％）略有降低（ P＝0．012）。3组中所占比例占优势的始基卵泡中未受损卵泡率差异无统计学意义（P＝0．079）；与新鲜对照组相比，两冷冻组初级卵泡中未受损卵泡率有所降低（P＜0．05），但两冷冻组间差异无统计学意义（ P＞0．05）。结论：程序化冷冻法和玻璃化冷冻法均能较好地保存卵巢组织窦前卵泡的活性。
