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细胞筛网作为载体运用于玻璃化法冻存人卵巢组织的效果分析
目的:研究细胞筛网作为载体运用于玻璃化冷冻人卵巢组织的效果,并寻找合适的冷冻剂浓度.方法:选择来自卵巢切除、子宫内膜异位、卵巢浆液性囊肿患者的卵巢组织共10例,以细胞筛网为载体,以二甲基亚砜、乙二醇和蔗糖为冷冻保护剂进行玻璃化冷冻.分别以二甲基亚砜和乙二醇等浓度混配(12％、15％、18％和20％)和0.5 mol/L的蔗糖配成4组不同的冷冻液,并以新鲜组织及常规程序化冷冻组织为对照,观察不同冷冻液组合对卵巢组织始基卵泡的形态学、凋亡以及体外培养后雌激素、孕酮和乳酸脱氢酶的影响,评价冷冻效果.结果:与新鲜组相比,细胞网筛玻璃化冷冻的卵巢组织冻融后,始基卵泡正常率虽有所降低,但优于常规程序冷冻组,其中18％组和15％组的正常率显著增高.组织细胞的凋亡率比新鲜组有所增加,但低于常规程序冷冻组,其中15％组和12％组明显降低.因此,15％组的冷冻效果好.比较了该浓度组合对卵巢组织培养后的雌激素、孕酮、乳酸脱氢酶的影响,结果发现,与新鲜组和程序化冷冻组相比,培养液中雌激素水平无明显差异,孕酮水平略好于程序组,但乳酸脱氢酶与新鲜组的变化完全一样,都显著优于程序化组.结论:细胞筛网玻璃化冷冻法优于程序化冷冻法,可作为临床卵巢组织冷冻的一种方法,15％的二甲基亚砜和乙二醇等浓度组合效果佳.
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不同成熟时期山羊卵母细胞冷冻保存研究
目的 比较山羊卵母细胞在不同成熟时期解冻后体外成熟、体外受精及胚胎发育能力.方法 收集山羊生殖泡(GV)期未成熟卵和成熟卵,分5组行开放式拉细麦管(OPS)法玻璃化冷冻,I组:直接冷冻GV期卵;Ⅱ组:GV期卵在体外培养(IVC)8 h后冷冻;Ⅲ组:GV期卵在IVC 16 h后冷冻;Ⅳ组:GV期卵体外培养成熟(IVM)后冷冻;V组:直接冷冻体内成熟卵.解冻后比较各组卵受精率、卵裂率及8细胞胚胎形成率.结果 I组(GV期卵)冷冻解冻后存活率达56.8%,显著高于Ⅱ组(33.3%)、Ⅲ组(31.6%)、Ⅳ组(28.9%)及V组(30.4%),差异有高度统计学意义(均P<0.01).各组体外受精率、卵裂率及8细胞胚胎形成率比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 采用OPS法玻璃化冷冻山羊GV期卵较冷冻其他成熟时期卵效果好.
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囊胚玻璃化冷冻对雄鼠精子质量的影响
目的:研究玻璃化冷冻复苏对子代小鼠精子质量的影响,为玻璃化冷冻对子代生殖安全提供参考.方法:将C57BL/6雌性鼠促排卵后合笼,取3.5天囊胚,玻璃化冷冻至少两周后复苏培养移植.待子代雄鼠性成熟后,处死取睾丸附睾组织,计算睾丸指数,从附睾尾获取精子,制备精子悬液,检测小鼠精子密度、活力、前向运动率及畸形率.结果:玻璃化冷冻复苏的子代雄鼠精子的睾丸指数(0.0078±0.0006g/g)、精子密度[(13.57±3.07)×106/mL]、活力(50.67％±2.03％)、前向运动率(28.87％±2.54％)以及精子畸形率(49.67％±1.21％),与正常C57BL/6雄鼠比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论:初步认为囊胚玻璃化冷冻复苏移植对小鼠子代精子功能和形态无明显影响.
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两种人工皱缩预处理方法在人囊胚玻璃化冻融中的应用
目的 比较两种囊腔人工皱缩(AS)预处理方法在人囊胚玻璃化冻融中的应用效果.方法 囊胚玻璃化冷冻复苏患者564例分为两组:A组201例,采用注射针抽穿AS法;B组363例,采用激光打孔AS法.比较两组的相关结果.结果 A组平均移植囊胚数(1.72±0.67)个,B组平均移植囊胚数(1.72±0.52)个;A、B组冷冻囊胚复苏后的存活率和孵出率分别为92.1％和79.0％、94.6％和79.6％,A组和B组玻璃化冻融移植后临床妊娠率、种植率、活产率、流产率分别为51.8％、38.4％、42.4％、18.2％和56.4％、43.2％、46.7％、16.3％,两组在以上各指标间均无统计学差异(P＞0.05).结论 两种囊腔AS法均是有效的预处理方法,激光打孔AS法效果可能稍好一些.
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Cryotop玻璃化冷冻人类卵裂期胚胎的临床应用
目的 探讨玻璃化冷冻技术在人类卵裂期胚胎冷冻中的应用效果.方法 将接受体外受精-胚胎移植的患者第3天移植后剩余的胚胎进行Cryotop玻璃化冷冻保存,液氮下储存3个月后,根据患者情况复苏胚胎,观察胚胎复苏后的临床妊娠效果.结果 玻璃化冷冻复苏55个周期共172个胚胎,存活144个(83.7％).移植54个周期共133个胚胎,临床妊娠24个周期(44.4％).其中,3例流产(12.5％),5例足月分娩10个正常新生儿,19例继续妊娠.结论 Cryotop玻璃化冷冻法适于人类早期胚胎的冷冻保存,获得了理想的复苏率、妊娠率和种植率.
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卵子玻璃化冷冻复苏后行卵母细胞胞浆内单精子显微注射27例临床结局
目的：探讨卵子玻璃化冷冻技术在辅助生殖中的临床应用价值。方法回顾性分析2013年1月－2015年12月在解放军174医院生殖医学中心行体外受精，取卵日因男方因素未取到精子而行卵子玻璃化冷冻保存的27对不孕夫妇的资料。卵子解冻后均行夫精卵母细胞胞浆内单精子显微注射，记录卵子受精情况及临床结局。结果27例患者共冷冻卵子245枚，并全部解冻，解冻后存活214枚，存活率84．79％；其中第二次减数分裂中期（ metaphase Ⅱ，MⅡ）卵198枚，并全部行ICSI，受精138枚，受精率74．49％；卵裂99枚，卵裂率71．74％；形成87枚2PN（原核，pronucleus）胚胎，优质胚胎34枚，优质胚胎率39?08％。20个移植周期移植胚胎41枚，临床妊娠6例，临床妊娠率34．82％。结论玻璃化冷冻技术应用于卵子冷冻保存，并对复苏卵子进行卵母细胞胞浆内单精子显微注射可以取得一定的临床妊娠率，在辅助生殖技术临床上具有很强的实用价值。
关键词： 玻璃化冷冻 卵子 卵胞浆内单精子显微注射 临床结局 -
人类卵子改良程序化冷冻和玻璃化冷冻比较研究
程序化冷冻曾广泛应用于辅助生殖临床，但因需依赖程序化冷冻仪，操作过程耗时较长等原因，目前正逐渐被玻璃化冷冻所取代。一般认为，相比于常规程序化冷冻，玻璃化冷冻操作简便，具有更稳定的冷冻复苏效率。相比卵裂期胚胎和囊胚，卵母细胞体积较大、含水比例高、细胞膜的渗透性低，冷冻过程中的冰晶形成更易对卵子产生损伤[1]。同时，卵母细胞纺锤体对温度改变敏感，冷冻过程可影响染色体的重排。迄今为止，无论是常规程序化冷冻，还是玻璃化冷冻，卵母细胞的冷冻复苏率仍然明显低于胚胎的同项指标，其受精胚胎移植后的着床率和新生儿出生率更是十分低下。探索改善卵子冷冻复苏技术仍然是辅助生殖工作者的一项重要任务，故此，本中心通过改良冷冻保护剂，尝试开展了改良程序化冷冻法进行卵子冷冻复苏工作，比较其与玻璃化冷冻法对卵母细胞复苏率、受精率、卵裂率及囊胚形成率的差异，分析其对卵子潜能发展的影响。
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解冻液I温度设定对小鼠卵母细胞玻璃化冻融效果的影响
目的：探讨预热至37℃的解冻液I和预热至室温（22℃）的解冻液I对小鼠卵母细胞玻璃化冻融效果的影响。方法对6周龄昆明系雌鼠进行促排卵,脱去颗粒细胞后选取形态良好的MII期卵母细胞，用含不同浓度DMSO+EG的磷酸盐缓冲液（5%DMSO+5%EG，10%DMSO+10%EG，20%DMSO+20%EG+30%蔗糖）对其进行玻璃化冷冻，储存2天后对小鼠卵子进行解冻复温。将卵子随机分为两组，一组投入预热至37℃的解冻液I（含30%蔗糖的磷酸盐溶液），另一组投入预热至室温（22℃）的相同浓度的解冻液I中，再分别移至预热至室温（22℃）的解冻液II、III和IV（分别含20%、10%、5%蔗糖的磷酸盐溶液），随后对两组卵母细胞的复苏率进行统计比较。结果共计对119枚小鼠卵子进行玻璃化冻融，其中61枚置于预热至37℃的解冻液I，有52枚存活良好，复苏率为82.25%（52/61），其余58枚置于预热至室温（22℃）的解冻液I进行解冻，有23枚存活良好，复苏率为39.66%（23/58），37℃组的复苏率显著高于室温（22℃）组（P<0.01）。结论虽然降低平衡时的温度可以减少高浓度玻璃化冷冻保护剂对卵子的毒性作用，但较快的升温速度可以帮助卵子快速通过-120℃~-35℃的危险阶段，而37℃的解冻液I环境较之室温（22℃）能更好地加速这一过程，避免重结晶对细胞的致命损伤。
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玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响
目的:通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求佳的卵子冷冻方案.方法:玻璃化冷冻生殖泡期卵(GV)、成熟中期卵( MⅡ)及体外成熟卵(IVM-MⅡ),解冻复苏后,分别作体外成熟、体外受精(IVF)、胚胎培养或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率.结果:GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性(65% vs 60.92% vs 69.93%,P＞0.05).GV冷冻组的成熟率显著低于对照组(79.6% vs 96.19%,P＜0.01).GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组( P＜0.01),且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组(18.06% vs 31.34%,P＜0.01).IVM-MⅡ冷冻组囊胚率低于MⅡ 冷冻组和对照组,差异均有显著性(28.57% vs 52.38%,P＜0.05;28.57% vs 57.14%,P＜0.01).GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM -MⅡ冷冻组(53.85% vs 26.67%,P＜0.05).IVM-MⅡ冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组,差异均有显著性( P＜0.05,P＜0.01).结论:GV卵先玻璃化冷冻再体外成熟,其细胞骨架损伤较小,胚胎发育较好.
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第5天冷冻囊胚解冻培养4 h与过夜培养20 h移植的临床结局比较
目的：通过比较第5天冷冻囊胚解冻培养4h与过夜培养20h后移植的临床结局，探讨囊胚解冻后到移植用以培养的适宜时间。方法：在第5天冷冻囊胚解冻移植周期中，按照囊胚解冻后到移植用以培养的时间不同分为2组：解冻4h后移植组（A组，移植周期157个，囊胚268枚）和提前解冻过夜培养20h后移植组（B组，移植周期227个，囊胚370枚），比较其妊娠结局。结果：B组的囊胚孵化率明显高于A组，差异有统计学意义（P＜0.01）；B组周期取消率稍高于A组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；B组在平均移植胚胎个数上稍少于A组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；A、B2组在临床妊娠率、胚胎种植率、流产率和多胎妊娠率上差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：囊胚提前解冻过夜培养20h与培养4h后移植的临床结局无明显差异，操作人员对于囊胚解冻时间上将有更多选择。
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小鼠胚胎玻璃化冷冻研究
目的:观察不同温度对小鼠胚胎玻璃化冷冻的影响,探索小鼠胚胎玻璃化冷冻的适宜温度.方法:选用8周龄昆明系小鼠超排卵,取桑葚胚或早期囊胚在不同温度下玻璃化冷冻,解冻后体外培养,观察其48小时发育率和孵化率.结果:25℃时胚胎冷冻效果要优于4℃(P＜0.01)及37℃时(P＜0.05).25℃时和对照组之间无差异.结论:温度对小鼠胚胎玻璃化冷冻保存有影响,25℃为适温度.
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3种不同载体对卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响
目的 以小鼠成熟卵母细胞(MⅡ期)为试验对象,应用3种不同载体对其行玻璃化冷冻,旨在分析载体对冷冻效果的影响.方法 采用玻璃化冷冻技术冻存昆明种小鼠成熟卵母细胞,设新鲜对照组和玻璃化冷冻组,玻璃化冷冻组又分为开放式脉管(OPS)组、自制麦管组和Cryoleaf组.比较冻融后鼠卵的存活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率.结果 新鲜对照组和玻璃化冷冻组的受精率、卵裂率差异无统计学意义,但囊胚形成率差异有统计学意义(P<0.05);OPS组与自制麦管组的鼠卵存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义;OPS组与Cryoleaf组比较,存活率差异有统计学意义(P<0.05),受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义;自制麦管组与Cryoleaf组比较,存活率差异有统计学意义(P<0.05),而受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义.结论 载体的不同会对卵母细胞玻璃化冷冻效果形成一定程度的影响.
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不同玻璃化冷冻载体对人卵巢组织冷冻效果的影响
目的：：比较不同的玻璃化冷冻载体对人卵巢组织冷冻效果的影响,为人卵巢组织玻璃化冷冻方案的选择提供理论基础和实验参考依据。方法：预处理人卵巢皮质切成10 mm×1 mm×1 mm大小,随机分为新鲜组( A组)、针浸润玻璃化冷冻组(B组)、表面玻璃化冷冻组(C组)和直接覆盖玻璃化冷冻组(D组)。 A组直接予以固定、组织切片及HE染色；B、C、D 3组采用不同玻璃化冷冻载体冷冻后,投入液氮保存2个月,采用快速复温法解冻后予以固定、切片及染色。行形态学分析,通过计算各组卵巢组织切片中正常形态始基卵泡率,比较各组冷冻效果。结果：4组共计数809个始基卵泡,其中正常形态始基卵泡率分别为：A组96.12%,B组88.14%,C 组80.00%,D组81.25%。行玻璃化冷冻的3组卵巢组织正常形态始基卵泡率均明显小于A组(P<0.01)；而B组、C组和D组正常形态始基卵泡率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：玻璃化冷冻后人卵巢组织正常形态始基卵泡率较新鲜组织下降,但仍能较好地保存人类卵巢组织,可用于人类卵巢组织的冷冻保存。
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海藻糖应用于人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻研究
目的 探讨海藻糖的应用能否改善人成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果、提高冻融后卵母细胞的发育潜能.方法 从该中心IVF/ICSI治疗的病人中经知情同意获取卵母细胞248枚,随机分成四组:显微注射海藻糖组(A组)、细胞外海藻糖组(B组)、常规蔗糖组(C组)、新鲜对照组(D组).卵母细胞复苏后,所有存活卵母细胞均行卵胞浆内单精子显微注射(ICSI),观察各组卵母细胞冻融后存活率、受精率、卵裂率、囊胚率、优质胚胎率、优质囊胚率.结果 A、B、C三组存活率、优质胚胎率、囊胚率差异无统计学意义(P>0.05),A组受精率、卵裂率、优质囊胚率高于B组和C组,差异均有统计学意义(P<0.05),其中与B组受精率、卵裂率差异极显著(P<0.01),与C组卵裂率差异极显著(P<0.01);B组与C组存活率、受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚率、优质囊胚率差异均无统计学意义(P>0.05);A组与D组优质胚胎率、优质囊胚率差异有统计学意义(P<0.05);B组及C组与D组受精率、卵裂率、优质胚胎率、优质囊胚率差异极显著(P<0.01).结论 海藻糖作为细胞内冷冻保护剂似乎能够改善人卵母细胞玻璃化冷冻效果及冻融后卵母细胞发育潜能.
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妊娠中期胎盘经腹超声检查评价玻璃化冻融囊胚移植助孕安全性
目的 妊娠中期胎盘经腹超声检查,评价玻璃化冻融囊胚移植助孕安全性.方法 以2012年1月至2016年12月入院接受妊娠中期超声检查的玻璃化冻融囊胚移植单胎妊娠妇女275例为观察组,年龄配对同期自然妊娠的妇女275例为对照组,比较两组孕妇胎盘超声检查情况.结果 观察组前置胎盘4例,占1.56％(完全性前置胎盘2例,部分性前置胎盘1例,边缘性前置胎盘1例);低置胎盘11例,占4.28％;帆状胎盘7例,占2.72％;球拍状胎盘19例,占7.39％;胎盘血池10例,占3.89％;胎盘增厚2例,占0.77％;胎盘肿物1例,占0.39％;分叶状胎盘1例,占0.39％.观察组较对照组妊娠胎盘厚度增加(t=2.070,P=0.039),胎盘超声检查异常率增高(x2=5.572,P=0.018).结论 玻璃化冻融囊胚移植妊娠胎盘超声检查异常率增高,值得进一步关注.
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体内外受精及玻璃化冷冻对小鼠胚胎体外发育的影响
目的 探讨体内、外受精对小鼠胚胎发育及囊胚孵出率的影响,为鼠胚试验在人类体外受精(IVF)胚胎实验室质量控制中的应用提供依据.方法 将超排后的雌性昆明小白鼠随机分为2组,A组与雄性小鼠交配,D1获取体内受精卵;B组直接获取卵子,通过体外受精获得受精卵.分别将这2种受精卵体外培养至第5d,观察其卵裂率、囊胚形成率的差异;以及对囊胚进行玻璃化冷冻复苏,比较囊胚冷冻与否孵出率的差异.结果 小鼠体内、外受精卵的卵裂率(72.1% vs 68.8%,P>0. 05)、囊胚形成率(79.2% vs 75.4%,P>0.05)均无显著差异;囊胚冷冻与否孵出率差异不显著(75.1%、72.7%,P>0.05).结论 两种不同来源的昆明小白鼠胚胎培养方法均可用于新建胚胎实验室的质量控制.成熟的玻璃化冷冻技术可用于新建胚胎实验室的质控.
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采用玻璃化冻融囊胚技术临床妊娠7例报道
目的 探索解决辅助生殖治疗过程中临床妊娠率低、多胎发生率高问题的方法.方法 采用玻璃化冻融囊胚技术行冻融囊胚移植术.结果 采用玻璃化冻融囊胚技术现有7例患者获得临床妊娠.结论 玻璃化冻融囊胚技术能有效改善冻融囊胚的复苏率与种植潜能,并提高临床妊娠率,降低多胎率.
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4702例两种方法冷冻卵裂期胚胎移植的临床结局分析
目的 分析比较玻璃化冷冻与程序化冷冻卵裂期第3d(D3)胚胎解冻周期移植的临床妊娠及出生结局.方法 对我院生殖中心2008年10月至2013年7月2901例玻璃化孵冻周期及1801例程序化解冻周期进行回顾性研究,比较两组的临床妊娠结局和新生儿出生情况.结果 玻璃化冷冻组的胚胎复苏率、临床妊娠率、胚胎种植率(分别为97.41％、47.64％、30.99％)均显著高于程序化冷冻组的胚胎复苏率、临床妊娠率、胚胎种植率(52.23％、32.56％、17.40％),差异均有统计学意义(P＜0.001);玻璃化冷冻组新生儿的早产率(15.02％)、低出生体重儿发生率(20.85％)、出生缺陷率(1.11％)均高于程序化冷冻组的早产率(14.12％)、低出生体重儿发生率(17.45％)、出生缺陷率(o.60％)的趋势,但统计学上均无显著性差异(P＞0.05).结论 玻璃化冷冻可明显提高胚胎复苏率和改善临床妊娠结局,但并没有改善新生儿出生结局,与程序化冷冻相比具有相似甚至有可能更差的新生儿出生结局.
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卵子玻璃化冷冻技术在IVF-ET中的应用(附7例报告)
目的 探讨卵子玻璃化冷冻的临床应用价值.方法 回顾性分析2011年1月-2012年12月体外受精周期取卵日因男方睾丸取精失败等原因行卵子冷冻的16对不孕夫妇的资料.其中,7例患者接受卵子解冻,并行夫精卵细胞胞质内单精子注射(ICSI),记录其受精、胚胎及临床结局.结果 16例患者共冷冻卵子167枚,7例接受卵子解冻,共解冻卵子86枚,存活66枚,并行ICSI,正常受精率68.2％,优质胚胎率14.6％;1例患者取消移植,3例生化妊娠(50％),2例临床妊娠(33.3％),其中1例患者足月分娩1女婴.结论 卵子玻璃化冷冻可作为取卵日取精困难及睾丸取精失败患者的临床补救措施.
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1658例玻璃化冻融周期的临床结局分析
目的：探索应用玻璃化冻融技术冻融卵裂期胚胎及囊胚的临床效果。方法来源于江西省妇幼保健院生殖中心2012年9月至2014年1月1658例玻璃化冻融移植周期（其中卵裂期胚胎1426周期共2907枚胚胎，囊胚232周期共341枚胚胎），用自制麦管作为胚胎载体及相同的玻璃化方法进行冷冻、复苏，及胚胎移植，观察其复苏存活率、全胚融解率、临床妊娠率、植入率和流产率等。结果卵裂期胚胎复苏率为98.5%，全胚融解率是0.35%。囊胚复苏率为99.7%，全胚融解率是0.43%。卵裂期胚胎的胚胎植入率显著低于囊胚（35.4%vs 49.3%）（P<0.05），平均每周期移植胚胎数显著高于囊胚（2.0±0.3 vs 1.5±0.5）（P<0.05），临床妊娠率低于囊胚（50.7%vs 55.4%），差异无显著性意义，P>0.05，双胎率卵裂期胚胎显著高于囊胚（38.3%vs 28.9%）（P<0.05），早期流产率无显著性差异（6.8%vs 7.8%，P>0.05）。结论使用相同的玻璃化冷冻方法对人类卵裂期胚胎和囊胚可获得理想的冷冻效果。
