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应用脉冲凝胶电泳技术分析肺炎克雷伯菌染色体多态性
目的利用脉冲凝胶电泳(PFGE)技术探讨肺炎克雷伯菌3个亚种临床分离株核型特征. 方法用XbaⅠ酶切各试验菌株染色体DNA,经脉冲凝胶电泳分离酶切片段. 结果 PFGE法将28株细菌分为15个型和亚型,较准确地显示各菌株染色体多态性,并筛选出亚种间的差异DNA片段. 结论脉冲凝胶电泳技术分析肺炎克雷伯菌基因型准确、可靠,是用于流行病学监测的有效方法.
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嗜麦芽窄食单胞菌的分子流行病学研究
嗜麦芽窄食单胞菌感染多发生在机体免疫受损、肿瘤患者以及器官移植患者中.不合理使用广谱抗生素、有创性治疗,均是该菌感染发生率增加的因素.因此,有必要对该菌进行分子流行病学研究.对细菌同源性、耐药性研究中,与复杂的脉冲凝胶电泳相比,肠杆菌科基因间重复一致序列为引物的聚合酶链反应(ERIC-PCR),亦不失为一种简便、可靠、重复性好、分辨率高的分子生物学方法[1-3].一、材料与方法
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不典型山夫登堡沙门菌腹泻株的分子溯源研究
上海市疾病预防控制中心(SCDC)于2006年始加入WHO全球非伤寒沙门菌的监测网络(GSS),通过临床腹泻病例的监测发现:2006年7-9月间,山夫登儇沙门菌血清型呈现过暴发的流行病学特征[1],其中一类罕见的H2S阴性山夫登堡沙门菌流行菌株占较大比例,为掌握山夫登堡沙门菌在本市的流行规律,本研究对2006-2007年GSS山夫登堡沙门菌腹泻菌株的耐药型谱、RP核糖体分型和脉冲凝胶电泳(PFGE)分子分型进行分析,了解不产硫化氢山夫登堡沙门菌的遗传学特征,为本市的非伤寒沙门菌监测和防治提供依据.
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重症监护病房分离多重耐药铜绿假单胞菌的同源性分析
目的 调查我院重症监护病房(intensive care unit,ICU)分离的多重耐药铜绿假单胞菌的同源性和耐药情况.方法 收集该院2007年7月～ 2008年6月ICU分离的多重耐药铜绿假单胞菌,使用MicroScan auto Scan-4型分析仪进行细菌鉴定和药敏试验,用脉冲凝胶电泳分析(pulse gel electrophoresis analysis,PFGE)研究上述细菌的同源性.结果 从47位患者中共分离出135株铜绿假单胞菌,其中多重耐药有29株,分布在25位患者中(占比53.2％),哌拉西林/他唑巴坦有较好的敏感率67.7％.PFGE指纹图谱分成5个型(A-E型).以A型、B型和C型为主,3名患者检出多个亚型.结论 ICU患者感染铜绿假单胞菌多重耐药情况严重,存在多克隆株的交叉感染.PFGE是分子流行病学较好的基因分型方法,为流行感染控制提供了可靠的依据.
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鸡沙门菌NCTC13346株基因组物理图谱的建立与结构特征的比较
目的 建立鸡沙门菌NCTC13346株基因组物理图谱,并比较其结构特征.方法 制备鸡沙门菌NCTC13346株基因组DNA,用rrl基因特异性的I-Ceu Ⅰ内切酶以及限制性内切酶Xba Ⅰ和Avr Ⅱ酶切后,进行脉冲凝胶电泳(PFGE),分离出DNA片段,后用噬菌体P22转导已知携带沙门氏菌基因的Tn10插入子的方法定位基因排列,根据酶切片断的连接与已知基因的定位,绘制该菌的基因组结构物理图,并与已知鸡沙门菌SARB21基因组结构进行比较.结果 建立鸡沙门菌NCTC13346株基因组物理图谱,与鸡沙门菌SARB21基因组物理图谱相比,两者具有相对于鼠伤寒沙门氏菌LT2的相似的基因插入和缺失片段,但由于两者基因组中含有rrn操纵子的DNA片段的不同排列,分别表现为迥异的基因组结构.结论 建立鸡沙门菌基因组物理图谱可用于分析同种细菌的基因组特点与进化.
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一类罕见硫化氢阴性山夫登堡沙门菌腹泻株的分子溯源
[目的]研究一类罕见硫化氢阴性山夫登堡沙门菌腹泻菌株遗传克隆特征.[方法]收集、分析本地区参加全球沙门菌监测(GSS)腹泻病例中分离的山夫登堡沙门菌生化、编码SPI-1毒力岛基因(hilA、invA)和耐药特征;应用Riboprinter(r)(RP)DNA指纹图谱系统比较表型典型与不典型菌株的核糖体分型;通过Pluse Net China数据库中同型菌株的脉冲凝胶电泳(PFGE)图谱聚类比较分子型谱.[结果]2006年长宁区GSS监测病例分离出19株山夫登堡沙门菌,其中10株属于硫化氢阴性和SPI-1毒力岛缺失的表型变异菌株.RP分型证实发生变异的山夫登堡沙门菌与典型菌株间分属2个不同的克隆.Pluse Net China数据库将包括长宁区19株山夫登堡沙门菌在内的36株山夫登堡腹泻株共分18种PFGE带型.长宁区的表型变异株优势型分属4型(2株)和6型(6株),典型菌株的优势型分属11型(1株)、17型(4株)和23型(2株).聚类分析显示,表型变异株的克隆在遗传相似度上高于典型株.[结论]分子溯源证实,SPI-1毒力岛缺失的山夫登堡沙门菌变异菌株与典型菌株同样具有引发局部爆发的致病性.2006年长宁区分离的硫化氢阴性山夫登堡沙门菌变种腹泻株与2002年深圳市的1例食物中毒案例分离的2株SPI-1毒力岛缺失株存在同源性.
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上海市鼠伤寒沙门菌流行特征及分子分型研究
[目的]研究上海市2006-2007年鼠伤寒沙门菌腹泻病例株的分子流行病学特征.[方法]追溯2002-2007年食品中分离的鼠伤寒沙门菌来源,比较鼠伤寒沙门菌食源株与腹泻株的抗生素耐药性;对全球沙门菌监测(GSS)病例和食品中分离的鼠伤寒沙门菌进行血清、耐药表型和脉冲凝胶电泳(PFGE)分子分型.[结果]经培养确认的鼠伤寒沙门菌腹泻病例数,在2006-2007年本市非伤寒沙门菌型病例构成中仅次于肠炎沙门菌,食品菌株多源于禽(64.4%)和畜肉制品(17.8%),其多重耐药菌株显著高于腹泻株(P<0.05).PFGE将7株食品株和44株腹泻株分为23种带型,优势型为1型(8株)、2型(6株)、29型(4株)、49型(8株)和6型(4株),与食源菌株完全匹配的仅有49型、6型共7个病例(15.9%,7/44).PFGE-1型腹泻株在2006和2007年分别为2例和6例,2型分别为4例和2例.[结论]上海市鼠伤寒沙门菌腹泻病例存在高度散发和分散爆发的流行特征,没有与本地食品菌株相匹配的优势克隆型分别是PFGE 2型和1型,与市售生鲜类肉食品污染株之间的遗传同源性低.推测传染源可能由输入性传染源对食品等媒介形成二次污染所致.建议加强流行病学调查,以揭示潜在的传染源和传播途径.
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上海市肠炎沙门菌流行特征和分子分型研究
[目的] 分析上海市2006-2007年肠炎沙门菌菌株,了解上海市肠炎沙门菌分子流行病学特征. [方法] 回顾2002-2007年肠炎沙门菌食品株来源并与肠炎沙门菌腹泻株作耐药性比较;对2006-2007年全球沙门菌监测(GSS)病例和食品分离的肠炎沙门菌进行表型验证、药敏试验和脉冲凝胶电泳(PFGE)分析. [结果] 2006-2007年肠炎沙门菌在本市非伤寒沙门菌病例中列首位,而80%的食品株源自禽及禽肉制品,食品株的抗生素耐药性高于腹泻株.2007年肠炎沙门菌腹泻株的耐药谱和2006年有较大差异.包括13株食品株在内共76株肠炎菌株可分为21种PFGE带型,遗传同源性接近80%,优势带型依次为3型(34株)、1型(12株)、2型(5株)和5型(5株),除2型外均发现有与腹泻株同型的食源株.2006和2007年的PFGE 1/2型病例分别为4例和12例. [结论] 上海市肠炎沙门菌病例与食用污染的鸡肉等禽类制品有密切关系,PFGE 3型肠炎沙门菌是目前上海市肠炎沙门菌流行株的优势菌型,2007年发现由鹅肝传播的1/2型肠炎沙门菌可能是3型的变异株并有取代之成为流行菌株的趋势.开展对腹泻病例和食物链的综合监测和以实验室为主的实时分子分型检测能快速预警肠炎沙门菌散在爆发和追溯污染源.
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上海市罕见沙门菌型腹泻的溯源研究
[目的]初步了解本市罕见沙门菌血清型菌株的分子流行病学特征.[方法]对分离自不同来源标本的22株7种不同血清型沙门菌进行脉冲凝胶电泳(PFGE)分析,脉冲凝胶电泳选用Xba Ⅰ限制性内切酶.[结果]2株列克星敦、2株非丁伏斯沙门菌的电泳图谱显示有较大差异,2株蒙得维的亚、2株朗根萨尔查、2株乌普萨拉、5株胥戈成格隆、4株波摩那的图谱显示存在同源性.[结论]本市沙门菌罕见血清型的流行菌株和食品菌株之间既存在分子水平的同源性也存在非同源性,加强沙门菌综合监测和即时分子分型可预警罕见沙门菌血清型流行.
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应用脉冲凝胶电泳分析粪肠球菌基因的方法研究
[目的]对12株粪肠球菌的DNA分子进行基因分析. [方法]用SmaI作为内切酶,将粪肠球菌的DNA分子切割成若干片段,用Amersham pharmacia biotech公司生产的GENE NAVIGATOR(R)-脉冲中凝胶电泳系统将这些片段以垂直泳道的形式分离开来. [结果]经分析比较,这12株粪肠球菌经SmaI切割后的DNA片段排列均不相同.[结论]这12株粪肠球菌在流行病学上来源不同.
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德尔卑沙门菌PFGE分型探索
[目的] 用脉冲凝胶电泳方法绘制德尔卑沙门菌的DNA 指纹图谱,为研究德尔卑沙门菌的同源性提供分子生物学技术依据. [方法] 从本实验室在各类食品中分离到的12株德尔卑沙门菌中提取DNA,经过限制性内切酶Xba1的切割,再用脉冲凝胶电泳仪进行DNA分子分型,并使用Quantity OneTM软件对其同源性进行分析比较. [结果] 实验得到10株菌的DNA指纹图谱,与2003年D1号菌株遗传基因密切相关的菌株占22%;与2004年D15号菌株遗传基因密切相关的菌株占44%;2005年的4株菌中有3株之间的遗传基因密切相关;2006年的4株菌,分别为2株之间的遗传基因密切相关. [结论] 脉冲凝胶电泳方法是分析引起食源性疾病的致病菌的同源性的有效方法.
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伯氏疟原虫ANKA株染色体核型分析
目的分析伯氏疟原虫ANKA株染色体分子核型,确定染色体的数目与大小.方法用脉冲凝胶电泳(PFGE)方法对伯氏疟原虫ANKA株进行核型分析.结果与结论伯氏疟原虫ANKA株染色体共14条,其大小为0.6～3 Mb.第5～7和第9～12条染色体在电泳中表现为共迁移.为利用多种特异性基因制作探针进行杂交,并对特异基因进行染色体定位提供参考.
关键词： 脉冲凝胶电泳 伯氏疟原虫ANKA株 染色体核型 -
上海市汤卜逊沙门菌流行特征分析
目的 研究上海市汤卜逊沙门菌暴发菌株的流行特征.方法 调查和收集本地区在全球沙门菌监测(GSS)腹泻病例中分离的汤卜逊沙门菌散发和暴发病例的菌株,并经过系统表型鉴定和耐药性分析;脉冲凝胶电泳(PFGE)选用:XbaⅠ限制性内切酶,聚类软件选用BioNumerics4.0软件.结果 2007年GSS分离汤卜逊沙门菌22株,在上海市非伤寒沙门菌型的确诊腹泻病例中排第3位,2007年黄浦区中心医院报告的8株集聚性腹泻病例分离的汤卜逊沙门菌对四环素、奥格门丁、氨苄西林、氯霉素、萘啶酸、磺胺异恶唑6种抗生素的耐药率均为100%,耐药谱明显高于其他散发病例菌株.20株腹泻株和2株食品被PFGE图谱分为15个带型,其中8株暴发菌株显示单一PFGE图谱,其余14个PFGE带型的菌株均仅有1株,分别来自汤卜逊沙门菌散发菌株(12株)和食品株(2株),菌株间的遗传相似度不高.结论 2007年10月上海市黄浦区某工地发生的1起暴发病例是由在遗传上完全相同的汤卜逊沙门菌的多重耐药克隆株引起的,PFGE技术可以通过菌株之间的分子同源性关系来证实监测病例中存在的局部暴发病例.
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一类罕见H2S阴性山夫登堡沙门菌腹泻株的研究
目的:研究一类罕见H2S阴性山夫登堡沙门菌腹泻菌株遗传克隆特征.方法:收集、分析本地区参加全球沙门菌监测(GSS)腹泻病例中分离的山夫臀堡沙门菌生化、编码SPI-1毒力岛基因(hilA、invA)和耐药特征;应用Riboprinter(R)(RP)DNA指纹图谱系统比较表型典型与不典型菌株的核糖体型;通过PluseNet China数据库中同型菌株的脉冲凝胶电泳(PFGE)图谱聚类比较分子型潜.结果:2006年卢湾区GSS监测病例分离4株山夫登堡沙门菌中有2株属于H2S阴性和SPI-1毒力岛缺失的表型变异菌株.RP分型证实发生变异的山夫登堡沙门菌与典型菌株间分属2个不同的克隆.PluseNet China数据库将包括卢湾区4株山夫登堡沙门菌在内共36株山夫登堡腹泻株共分18种PFGE带型.卢湾区的2株表型变异株分属4型和5型,2株典型菌株分属11型和23型.聚类分析显示表型变异株的克隆在遗传相似度上高于典型株.结论:分子溯源证实SPI-1毒力岛缺失的山夫登堡沙门菌变异菌株与典型菌株同样具有引发局部暴发的致病性,2006年卢湾区分离的H2S阴性山夫登堡沙门菌变种腹泻株与2002年深圳市的1例食物中毒案例分离的2株SPI-1毒力岛缺失株存在间源性.
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浙江省209株沙门菌PFGE指纹图谱研究
目的:建立浙江省沙门菌PFGE指纹图谱资料库,为查明沙门菌食源性疾病污染源,确定各病例之间的病原学关系,及时处理大范围内呈散发特征的沙门菌事件提供科学依据.方法:收集、提取全省历年来在各类食品和腹泻病人中分离的209株沙门菌的DNA,用限制性内切酶Xbal切割,脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术建立PFGE指纹图谱,用BioNu-merics V 5.1软件UPGMA方法进行聚类分析.结果:209株沙门菌分成10个基因型别160种PFGE基因指纹图谱.其中67株德尔卑沙门菌可分为6个型别35种PFGE指纹图谱,主要集中在1个PFGE指纹图谱型别中.14株肠炎沙门菌分属3个型别8种PFGE指纹图谱,相似系数在0.800～1.000之间.鼠伤寒沙门菌间的PFGE指纹图谱差异较大.结论:PFGE指纹图谱与血清学型别无相关性,该方法在研究沙门菌分子流行病学、确定各病例之间的病原学关系效果良好.
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应用PFGE对单核细胞增生李斯特氏菌基因分型的方法探索
[目的]建立单核细胞增生李斯特菌的DNA指纹图谱,并进行流行病学分析.[方法]以ApaI作为限制性内切酶,应用PFGE(脉冲凝胶电脉冲凝胶电泳)绘制LMO的DNA指纹图谱,用Bio-Rad Gel Doc 2000TM分析系统进行分析.[结果]将12株LMO分成9个型.[结论]通过PFGE方法,认为这些菌株呈散发流行.
关键词： 脉冲凝胶电泳 单核细胞增生李斯特菌 指纹图谱 食源性致病菌 -
应用脉冲凝胶电泳研究伤寒与鼠伤寒沙门菌染色体结构差异
[目的]比较伤寒沙门菌与鼠伤寒沙门菌染色体结构差异,追溯其进化根源,以便对其进行流行病学研究.[方法]用I-CeuI脉冲凝胶电泳技术对哈市几所医院分离的12株伤寒沙门菌和3株鼠伤寒沙门菌进行染色体结构分析,并构建I-CeuI物理图.[结果]两型沙门菌染色体经酶切电泳后均产生7个片段;其染色体总长度分别为4765kb和4725kb.[结论]实验中全部沙门菌染色体结构大致相同,但伤寒沙门菌染色体中存在插入与删除序列,推测可能是两者感染宿主与致病性不同的原因.
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脉冲凝胶电泳技术在沙门菌属染色体结构分析中的应用
沙门菌属(Salmonella)是肠杆菌科家族中的成员,属内有五个亚属,包括2500多个血清型.因该属细菌中不同的种、型往往具有很强的宿主特异性,故能在哺乳类、鸟类和爬行类等多种动物中引起疾病.多年来对该属细菌的研究主要基于宿主特异性、是否存在特异性表面抗原及对噬菌体的敏感性等表型特征.随着分子生物学技术的发展,尤其近年来迅速兴起的脉冲凝胶电泳(Pulsed-field gel electro phoresis,PFGE)技术的应用,已在基因水平对沙门菌属细菌进行分析,找出属中菌间遗传方面的差异及进化根源,进而对病原菌进行流行病学研究,以便找到更好的预防和控制方法.现将PFGE技术在沙门菌属染色体结构分析中的应用综述如下:
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PFGE和质粒图谱分析人和猪来源德尔卑沙门菌多重耐药株的同源性
目的 分析人和猪来源的德尔卑沙门菌的分子同源性,为研究多重耐药性在人畜之间传播提供分子生物学技术依据.方法 药敏试验检测人和猪来源的德尔卑沙门菌多重耐药株对10种抗菌药物的敏感性;用脉冲凝胶电泳方法(PFGE)检测菌株间的分子同源性;结合实验或电转移试验获得目标质粒,质粒酶切图谱检测质粒的同源性.PCR分析染色体介导喹诺酮耐药基因gyrA和arC,质粒可介导的喹诺酮耐药基因qnrA/qnrB/qnrC/qnrS、aac(6)-Ⅰ b-cr、qepA和oqxAB.结果 共收集48株德尔卑沙门菌,经药敏试验筛选获得11株多重耐药株(MDR),人源性8株,猪源性3株.11株菌除对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、磺胺和四环素(R型:ACSSuT)耐药外,所有菌株也对萘啶酸和环丙沙星耐药,6株对左氧氟沙星耐药,5株对头孢曲松耐药.PFGE分析,11株菌共分为6个克隆,3株动物源性菌株与8株人源性菌株无克隆相关性.喹诺酮耐药基因分析显示,有5株和3株动物源株检测到gyrA的Ser83Leu或/和Asp87Asn突变,6株人源株和3株动物源株检测到parC的Ser80Ile或/和Thr57Ser突变.质粒电泳分析显示,所有菌株都存在1-4条质粒条带,大小介于2～180kb,其中3株人源性菌株和1株动物源性株都存在4kb左右大小的质粒;2株动物源性菌株仅存在20 kb大小质粒.用结合实验和电转移方法,分析4kb质粒结构,证实4个质粒的酶切图谱完全一致,质粒中均存在介导外排基因oqxAB和喹诺酮耐药基因aac(6')-Ⅰ b-cr.结论 人和猪来源的德尔卑沙门菌多重耐药株中质粒介导的外排基因oqxAB和喹诺酮耐药基因aac(6')-Ⅰ b-c是喹诺酮重要的耐药机制,可能在沙门菌间传递,导致对喹诺酮类高耐药性.通过人和猪的接触或间接途径,沙门菌有传播喹诺酮耐药性的风险,同一种质粒可在人和动物中转移而传播该耐药机制.
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应用Xba1和Spe1酶切结合脉冲凝胶电泳研究伤寒与鼠伤寒沙门菌染色体结构差异
目的对伤寒、鼠伤寒沙门菌染色体结构进行比较分析,以便进行流行病学监测,为认识细菌的遗传进化和致病性奠定基础.方法分别用Xba1和Spe1酶切、消化细菌染色体,结合脉冲凝胶电泳技术对哈市几所医院分离到的12株伤寒沙门菌和3株鼠伤寒沙门菌进行染色体结构分析.结果两型沙门菌染色体经此两种酶切后分别产生18、17和16、15个片段,包括鼠伤寒沙门菌标准株在内的3株鼠伤寒和12株伤寒沙门菌染色体总长度分别为4765kb和4725kb.结论实验显示沙门菌染色体结构大致相同,但酶切位点及片段长度有所区别,由此推测可能是两者感染宿主与致病性不同的原因.
