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活体成像技术在实验脑型疟中的应用研究
目的 构建表达Luciferase的伯氏疟原虫ANKA株(Plasmodium berghei ANKA),感染昆明小鼠并于实验脑型疟发生时对小鼠进行活体成像,建立实验脑型疟活体成像平台,为脑型疟发病机理及疟疾疫苗和药物评价研究奠定基础.方法 大量制备重组质粒p10027并酶切使其线性化.复苏冻存原虫并于体外培养富集成熟裂殖体.收集成熟裂殖体与线性化的质粒混匀后进行电转化,对构建的虫株进行药物筛选;提取疟原虫基因组,进行PCR鉴定.构建的伯氏疟原虫ANKA-Luciferase疟原虫采用常规方法感染昆明小鼠,当小鼠于感染6d后出现偏瘫、昏迷及视网膜病变等典型脑型疟症状时,采用活体成像技术观察疟原虫增殖及分布情况;解剖分离感染小鼠各脏器组织并成像,观察疟原虫在各器官组织粘附情况.结果 PCR检测两端插入序列及Luciferase序列均能获得预期片段,提示重组质粒成功整合入伯氏疟原虫ANKA基因组内.活体成像观察感染小鼠在小鼠脑型疟发生时体内原虫水平较高,且随血流呈全身性分布;器官成像观察原虫在小鼠各重要脏器均有粘附,特别是脑部聚集了大量的感染疟原虫的红细胞.结论 成功构建了伯氏疟原虫ANKA-Luciferase疟原虫,并利用此原虫感染小鼠建立了实验脑型疟活体成像平台.
关键词： 伯氏疟原虫ANKA株 荧光素酶 实验脑型疟 活体成像 -
伯氏疟原虫ANKA株染色体核型分析
目的分析伯氏疟原虫ANKA株染色体分子核型,确定染色体的数目与大小.方法用脉冲凝胶电泳(PFGE)方法对伯氏疟原虫ANKA株进行核型分析.结果与结论伯氏疟原虫ANKA株染色体共14条,其大小为0.6～3 Mb.第5～7和第9～12条染色体在电泳中表现为共迁移.为利用多种特异性基因制作探针进行杂交,并对特异基因进行染色体定位提供参考.
关键词： 脉冲凝胶电泳 伯氏疟原虫ANKA株 染色体核型 -
遗传减毒伯氏疟原虫ANKA株的构建及其免疫保护效应
目的：构建遗传减毒伯氏疟原虫ANKA株（Plasmodium berghei ANKA，P．b ANKA），并用此减毒疟原虫株免疫C57BL／6J小鼠观察免疫保护效果。方法分别扩增UIS3基因编码序列两端的非编码区5′UTR和3′UTR及用于筛选的抗性标记hDHFR，然后利用融合PCR原理，扩增全长同源重组片段（5′UTR＋hDHFR＋3′UTR），后常规PCR扩增获得大量线性化同源重组片段并纯化。体外培养富集伯氏疟原虫ANKA株的成熟裂殖体，将线性化同源重组片段通过电转的方式导入裂殖体中并接种到小鼠体内，再对转化后的疟原虫进行筛选和鉴定，后用构建成功的减毒伯氏疟原虫ANKA株免疫小鼠并攻击，观察减毒株的免疫保护效力。结果成功扩增3个独立片段5′UTR、hDHFR和3′UTR ，长度分别为798、1628和759 bp ，后经融合 PCR 反应形成全长重组片段5′UTR＋hDHFR＋3′UTR ，长度为3185 bp。转化至裂殖体后经筛选鉴定获得遗传减毒伯氏疟原虫ANKA株，将此遗传减毒株免疫小鼠后攻击，小鼠红内期原虫率为0％，脑型疟发生率为0％，存活率为100％，可使其完全抵御野生型疟原虫感染。结论成功构建遗传减毒伯氏疟原虫ANKA株，此减毒株对小鼠的免疫保护率为100％，此模型的建立可为研究红前期疫苗免疫保护机制奠定基础。
关键词： 伯氏疟原虫ANKA株 遗传减毒 UIS3 免疫攻击 保护效率
