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新型培美曲塞衍生物对A549细胞增殖、迁移及细胞凋亡的影响
目的 探究新型培美曲塞(PMX)衍生物对A549细胞增殖、迁移及细胞凋亡的影响.方法 MTT法初步筛选12种化合物对A549细胞的细胞毒性,筛选出高活性候选化合物进一步研究其对A549细胞增殖的影响;Transwell细胞迁移实验及划痕愈合实验测定候选化合物对A549细胞迁移的影响;流式细胞术测定候选化合物对A549细胞凋亡的影响.结果 初筛发现其中9种化合物对A549细胞增殖具有抑制作用,其中化合物A12抑制作用为显著,IC50为(1.26±0.15)μmol/L,且抑制作用存在浓度及作用时间依赖性:IC50在作用72 h处低,为(1.06±0.24)μmol/L;Transwell细胞迁移实验及划痕愈合实验结果表明A12能够抑制A549细胞的迁移能力,且抑制作用具有浓度依赖性;流式细胞术实验结果显示A12能够显著提高A549细胞的早期凋亡率(P<0.05)、晚期凋亡坏死率(P<0.01)及总凋亡率(P<0.05).结论 筛选得到的新型PMX衍生物A12能够明显抑制A549细胞的增殖及迁移活性,并能诱导其凋亡.
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下调G3BP对抑制肿瘤细胞迁移能力的研究
目的：探讨利用 siRNA和靶向 G3BP的多肽药物下调 G3BP后对多种肿瘤细胞迁移能力的影响。方法采用人纤维肉瘤 HT1080细胞、乳腺癌 MCF-7细胞以及人非小细胞肺癌 H1299细胞，应用 siRNA特异性干扰 G3BP后，通过划痕实验观察其对肿瘤细胞迁移能力的影响；用多肽药物 GAP161作用于肿瘤细胞后，利用划痕实验以及 Transwell迁移实验观察其对肿瘤细胞迁移能力的影响；在 MCF-7细胞中高表达 G3BP1，在 MDA-MB-231细胞中用 siRNA下调 G3BP1后，采用人全基因芯片分析 G3BP1高表达和低表达后的基因表达谱，并进行信号通路分析。结果 siRNA特异性下敲 G3BP1和 G3BP2后，HT1080、MCF-7和 H1299细胞的迁移能力显著降低。利用靶向 G3BP的特异性多肽药物 GAP161作用于多种肿瘤细胞后，肿瘤细胞的迁移能力显著下调。全基因组芯片分析表明：多个基因同时在 G3BP1高表达和低表达组中发生变化，该变化与细胞迁移相关的细胞黏附、整合素、MAPK 等信号通路有关。结论 G3BP下调后能够显著降低肿瘤细胞的迁移能力。靶向 G3BP的多肽药物具有显著抑制肿瘤细胞迁移的作用。下调或者高表达 G3BP后可通过下调或者上调多种与细胞黏附、整合素、MAPK 等信号通路相关基因发挥作用。
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缺氧通过微小RNA-155和cyclin D1抑制滋养细胞迁移
目的 探讨缺氧对人绒毛外滋养细胞微小RNA(microRNA,miRNA)-155表达的影响及其对滋养细胞迁移的影响. 方法 (1)采用100μmol/L氯化钴(cobalt chloride,CoCl2)诱导HTR-8/SVneo细胞缺氧,实时定量聚合酶链反应技术检测miRNA-155的表达,蛋白质印迹技术检测JunB和FosB蛋白的表达,划痕实验评估细胞迁移能力.(2)采用SP600125和PDTC分别抑制激活蛋白-1(active protein-1,AP-1)和/或核因子(nuclear factor)-κ B通路,实时定量聚合酶链反应技术检测miRNA-155的表达变化.(3)HTR-8/SVneo细胞瞬时转染pEGFP-miRNA-155、pEGFP-C1和pGL3-pro-cyclin D1 3'UTR,荧光素酶报告基因系统检测miRNA-155对cyclin D1 3'非编码区的调控.(4)HTR-8/SVneo细胞瞬时转染pEGFP-miRNA-155和/或pFLAG-CMV-cyclin D1以过表达miRNA-155和/或cyclin D1,划痕实验评估细胞迁移能力的改变.采用两独立样本t检验,方差分析及LSD检验进行统计学分析. 结果 (1) 100 μmol/L CoCl2培养HTR-8/SVneo细胞24和48 h,miRNA-155的相对表达量分别是0h的(1.40±0.28)倍(t=3.302,P＝0.030)和(1.74±0.14)倍(t=8.578,P=0.001),随CoC12(100μmol/L)作用于HTR-8/SVneo细胞的时间延长,JunB和FosB蛋白表达均升高.细胞迁移率在培养12、24和48 h较0μmol/L CoC12时下降,尤以48 h降低明显[(52.98±3.77)％与(64.68±3.92)％,t=5.259,P=0.00 0].(2)抑制AP-1亚组、抑制NF-κB亚组及同时抑制AP-1和NF-κB亚组miRNA-155的相对表达量分别降低至无抑制情况下的(50.45±3.53)％、(47.18±2.14)％和(66.79±3.92)％(t值分别为3.630、4.100和3.392,P值均＜0.05).(3)过表达miRNA-155亚组的cyclin D1 3'非编码区荧光素酶活性较无过表达时降低(t=46.682,P=0.000).(4)过表达miRNA-155亚组的HTR-8/SVneo细胞迁移率较无过表达时明显降低[48 h,(33.31±6.19)％与(47.20±2.82)％,LSD检验,P＜0.05],而同时过表达miRNA-155和cyclin D1亚组的HTR-8/SVneo细胞迁移率较单纯过表达miRNA-155亚组明显升高[48 h,(43.04±1.44)％与(33.31±6.19)％,LSD检验,P=0.002]. 结论 缺氧通过激活HTR-8/SVneo细胞中AP-1和NF-κB通路而引起miRNA-155的表达升高,miRNA-155表达升高可以下调细胞周期蛋白cyclin D1,进而抑制滋养细胞迁移.
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p54nrb基因沉默对人脐静脉内皮细胞迁移及体外血管生成的影响
目的 观察p54nrb基因沉默对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及体外血管生成的影响,探讨p54nrb基因在血管新生中作用.方法 用含有靶向人p54nrb基因shRNA的慢病毒感染HUVEC 24h后,用嘌呤霉素进行筛选,Western blotting检测HUVEC中p54nrb蛋白的表达,确定p54nrb基因沉默效率,建立稳定的p54nrb基因沉默的HUVEC细胞系.CCK-8法检测p54nrb基因沉默对HUVEC细胞增殖的影响;划痕实验和Transwell迁移实验检测p54nrb基因沉默对HUVEC细胞迁移的影响;体外血管生成实验检测p54nrb基因沉默对HUVEC体外血管生成能力的影响.结果 Western blotting结果显示,p54nrb基因沉默的HUVEC细胞中p54nrb蛋白表达显著减少,表明建立了稳定的p54nrb基因沉默的HUVEC细胞系.CCK-8实验结果显示,p54nrb基因沉默轻度地促进了HUVEC细胞增殖;划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,p54nrb基因沉默后HUVEC细胞迁移能力明显下降;体外血管生成实验结果显示,p54nrb基因沉默明显抑制了HUVEC的体外血管生成能力.结论 p54nrb具有促进HUVEC细胞迁移及体外血管生成的作用,可能是一个新的参与血管生成的调控蛋白.
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水通道蛋白4对肺癌细胞A549迁移能力的影响及其作用机制研究
目的 探讨水通道蛋白4 (AQP4)对肺癌细胞迁移能力的影响.方法 选取肺癌A549细胞株,采用AQP4小干扰RNA (siRNAs)进行转染,采用Transwell法检测肿瘤细胞迁移能力,采用蛋白质印迹(Western blotting)法检测上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)表达水平,同时分析其对上皮间质转化(EMT)的影响.结果 敲降AQP4可抑制肺癌细胞A549迁移能力及EMT,上调E-cadherin表达水平并下调N-cadherin和Vimentin表达水平(P＜0.05).结论 抑制AQP4表达可有效降低肺癌细胞A549迁移能力并抑制EMT,推测促进EMT可能是AQP4的主要分子作用机制.
关键词： 肺肿瘤 水通道蛋白质4 细胞迁移抑制 药理作用分子作用机制 -
miR-21调控HTN1蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响
目的 探讨miR-21调控HTN1蛋白对胃癌细胞迁移和侵袭能力的作用.方法 定量聚合酶链反应检测胃癌组织和胃癌细胞中miR-21的表达情况,过表达miR-21后蛋白免疫印迹法检测HTN1的表达,双荧光素酶实验检测miR-21和HTN1表达在胃癌细胞中的关系,划痕实验检测过表达miR-21对胃癌细胞迁移能力的影响,Transwell侵袭实验检测过表达miR-21对胃癌细胞侵袭能力的影响.结果 miR-21在胃癌组织及胃癌SGC7901细胞中表达水平均降低(P<0.05).miR-21的表达与病理分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05).过表达miR-21胃癌SGC7901细胞株荧光素酶活性、HTN1基因和蛋白表达水平均低于对照组(P<0.05).过表达miR-21胃癌SGC7901细胞的迁移速率较对照组减慢,侵袭细胞数目少于对照组(P<0.05).结论 miR-21在胃癌中表达下调,其可以调控HTN1表达影响胃癌细胞迁移和侵袭能力.
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miR-200调控PAPD5蛋白对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响
目的 观察MiR-200调控PAPD5蛋白对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响.方法 应用qPCR检测miR-200在卵巢癌细胞株和卵巢癌组织中的表达;蛋白免疫印迹检测miR-200调节PAPD5的表达;Transwell侵袭实验检测miR-200的表达对卵巢癌A2780的侵袭能力的影响;划痕实验检测miR-200的表达对卵巢癌A2780的迁移能力的影响.结果 miR-200在卵巢癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织,在A2780卵巢癌细胞株中的表达水平高于ES2和SKOV3细胞株(P＜0.05).miR-200-mimic组PAPD5蛋白水平低于对照组,A2780的细胞活性、细胞迁移率、穿膜细胞数高于对照组(P＜0.05).结论 miR-200可以通过调控PADA5的表达影响调控卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力.
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ADAMTS18基因过表达可抑制人乳腺癌细胞的迁移与侵袭
目的:探讨ADAMTS18 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 18)基因过表达对人乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法:采用RT-PCR法检测乳腺癌BT549、MB231、MB468、MCF7、SK-BR-3、T47D细胞和乳腺纤维囊性病MCF10A细胞以及乳腺癌旁组织中ADAMTS18 mRNA的表达情况.将ADAMTS18过表达的重组载体质粒pcDNA3.1(+)-ADAMTS18转染至乳腺癌BT549、MB231和MCF7细胞后,采用克隆形成实验和CCK-8法检测ADAM TS18过表达对乳腺癌细胞克隆形成和增殖能力的影响,划痕愈合实验和Transwell小室法检测ADAMTS18过表达对乳腺癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响.结果:乳腺癌BT549、MB231、MB468、MCF7、SK-BR-3和T47D细胞中ADAMTS18 mRNA的表达水平显著低于乳腺纤维囊性病MCF10A细胞以及乳腺癌旁组织(P值均＜ 0.01).ADAMTS18过表达后BT549、MB231和MCF7细胞的迁移和侵袭能力被显著抑制(P值均＜0.01),而克隆形成和增殖能力无显著变化(P值均＞ 0.05).结论:ADAMTS18过表达可抑制乳腺癌细胞的体外迁移和侵袭.
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重组人纤溶酶原k1-3基因转染对血管内皮细胞的作用研究
目的观察脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因转染人脐静脉内皮细胞导致细胞凋亡和移动抑制的效应,初步探讨k1-3基因的抗血管生成机制.方法 以阳离子脂质体介导人纤溶酶原k1-3基因真核表达载体pcDNA-k13转染体外培养人脐静脉内皮细胞,经细胞凋亡检测和移动抑制试验,比较对照组和实验组的凋亡率和抑制率.结果 转染pcDNA-k13组有明显的细胞凋亡效应和移动抑制.结论 人纤溶酶原k1-3基因在人血管内皮细胞表达,并可能通过诱导细胞凋亡及抑制细胞迁移而抑制肿瘤新生血管的生成.
关键词： 人纤溶酶原K1-3基因 人脐静脉内皮细胞 细胞凋亡 细胞迁移抑制 -
肌外膜导管中细胞对周围神经再生影响的实验研究
目的 探讨小鼠腹外斜肌外膜制备的肌外膜导管(epimysium conduit,EMC)中的细胞成分对坐骨神经再生影响.方法 取8周龄雄性C57BL/6J增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)小鼠的腹外斜肌外膜,修剪成5 mm×3 mm,制备成管状(即EMC).取部分肌外膜采用不同照射剂量(0、15、20、25、30、35 Gy)进行细胞迁移抑制处理,并计数迁移细胞,选择迁移细胞数少的肌外膜制备EMC;另取部分肌外膜行脱细胞处理,常规HE和Masson染色鉴定脱细胞效果后制备EMC.取24只C57BL/6J野生型小鼠制备右后肢3 mm长坐骨神经缺损模型后,随机分为3组(n=8),分别采用EMC(A组)、经细胞迁移抑制处理后的EMC(B组)、脱细胞处理后的EMC(C组)修复缺损.术后16周取再生神经中段行大体、甲苯胺蓝染色、免疫荧光染色以及透射电镜观察.结果 肌外膜细胞迁移抑制观察示,15 d时随照射剂量增大,细胞迁移数逐渐减少;除30 Gy组与35 Gy组间比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05).选用经35 Gy照射剂量处理后的肌外膜进行体内实验.肌外膜脱细胞处理后均未见细胞核,且可缝合成导管状,制备EMC.术后16周各组EMC中神经均再通,A组修复后的坐骨神经粗,B组次之,C组细;免疫荧光染色可见A组EMC中EGFP细胞包绕再生轴突;甲苯胺蓝及透射电镜观察,A组再生神经轴突数及再生有髓神经鞘厚度显著优于B、C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 EMC中的细胞成分参与并促进了小鼠坐骨神经的再生.
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血小板反应蛋白1活性片段VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞增生及迁移的影响
目的 观察血小板反应蛋白1(TSP-1)活性片段VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞(RF/6A)增生、迁移的影响.方法 培养RF/6A细胞并将其分为对照组,0.1、1.0、10.0 μg/mlVR-10合成多肽组及1.0 μg/ml TSP-1全肽组.细胞培养后6、12、24、48 h,采用噻唑蓝(MTT)法检测各组RF/6A细胞存活率.细胞培养后24 h,Transwell小室实验检测各组RF/6A细胞迁移抑制率.采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测10.0 μg/mlVR-10合成多肽对细胞中半胱天冬酶(caspase)-3、凋亡相关因子(FAS)蛋白表达的影响.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测10.0 μg/ml VR-10合成多肽对RF/6A细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、FAS配体(FASL) mRNA表达的影响.结果 MTT法检测结果显示,随作用时间延长,干预组RF/6A细胞存活率越低;随VR-10合成多肽浓度增加,RF/6A细胞存活率也越低.以作用48 h时10.0 μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞存活率低,为78％.细胞培养24 h后,10.0 μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞迁移抑制率高,1.0 μg/ml TSP-1全肽组次之.与对照组比较,不同浓度VR-10合成多肽组及1.0 μg/ml TSP-1全肽组RF/6A细胞迁移抑制率均明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测结果显示,在相对分子质量32×103、20×103处可见caspase-3蛋白条带,在相对分子质量48×103处可见FAS蛋白条带.10.0 μg/ml VR-10合成多肽组与对照组RF/6A细胞中caspase-3(t=-66.240、138.813)、FAS(t=163.114)蛋白表达比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,10.0 μg/ml VR-10合成多肽组bcl-2 mRNA表达明显降低,差异有统计学意义(t=-67.419,P=0.000);FASL mRNA表达明显增强,差异也有统计学意义(t=39.365,P=0.001).结论 TSP-1活性片段VR-10合成多肽能抑制RF/6A细胞增生、迁移.
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黄连素对肝癌细胞系HepG2细胞体外迁移影响及其机制研究
目的:探讨黄连素对肝癌细胞系HepG2细胞体外迁移的作用及其机制.方法:通过MTT实验,检测不同浓度的黄连素对HepG2细胞存活的影响.利用细胞划痕迁移实验,观察低浓度黄连素(10μmol/L)对HepG2细胞体外迁移的影响以及3-MA对黄连素调控HepG2细胞体外迁移作用的影响.采用Western blot实验,证实低浓度黄连素引起HepG2细胞发生自噬.结果:高浓度黄连素(25μmol/L和50μmol/L)显著抑制HepG2细胞存活,低浓度黄连素未见明显变化.低浓度黄连素抑制HepG2细胞体外迁移并且引起HepG2细胞发生自噬,而3-MA能够逆转黄连素抑制HepG2细胞迁移的作用.结论:低浓度黄连素通过自噬抑制HepG2细胞体外迁移.
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长链非编码RNA HOTAIR对非小细胞肺癌迁移与侵袭能力的影响
目的:探讨非小细胞肺癌组织中长链非编码RNA HOTAIR的表达情况及其对细胞侵袭与迁移水平的作用.方法:利用定量的反转录PCR技术检测50例非小细胞肺癌组织中LncRNA HOTAIR的表达,然后通过过表达技术与RNA干扰技术研究LncRNA HOTAIR的主要功能.再对其pcDNA-HOTAIR与si-HOTAIR进行转染调控LncRNA HOTAIR的表达,设置空白载体与阴性对照组,应用反转录PCR进行转染效率的定量检测.然后分别实施MTT与Transwell两种方法来判断LncRNA HOTAIR的异常表达对非小细胞肺癌细胞活性的干预作用.结果:在非小细胞肺癌组织中LncRNA HOTAIR的相对表达水平是(24.50±7.43).LncRNA HO TAIR在SPC-A1和SK-MES-1两种细胞中的相对表达水平比在正常的支气管上皮细胞中更高,在A549细胞中的相对表达水平比在正常的支气管上皮细胞中更低.而经2d的转染siRNA后,LncRNA HOTAIR在A549与SPC-A1两种细胞中的表达水平降低;pcDNA3.1-HOTAIR后,LncRNA HOTAIR在A549细胞中的表达水平升高.利用RNA干扰技术阻碍HOTAIR的表达水平,不能抑制非小细胞肺癌细胞的增殖.而利用si-HOTAIR的转染降低LncRNA HOTAIR的表达水平能够阻碍癌细胞的迁移与侵袭作用(P＜0.05);而LncRNA HOTAIR的过度表达能够明显推动癌细胞的迁移与侵袭作用(P＜0.05).结论:HOTAIR在非小细胞肺癌中的高水平异常表达,能够提高非小细胞肺癌细胞迁移与侵袭水平,可能和患者的不良预后有联系.
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miR-9过表达对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响
目的:探讨miR-9对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响.方法:慢病毒悬液感染鼻咽癌C666-1细胞,流式细胞仪分选并鉴定,获得表达miR-9的C666-1细胞及对照细胞,应用体外划痕实验、Transwell侵袭实验分析miR-9对鼻咽癌C666-1细胞体外迁移、侵袭能力的影响.结果:制作划痕12 h后,穿越划痕的C666-1/miR-9细胞数(47.167 ± 2.552)显著少于C666-1/PLVTHM细胞(95.917 ± 3.118)(t=41.912,P<0.01);接种12 h 后,穿透基质胶的C666-1/miR-9细胞数(32.667 ± 3.257)显著少于C666-1/PLV T HM 细胞(81.833 ± 4.366)(t=31.270,P<0.01).结论:miR-9过表达能抑制鼻咽癌细胞的体外迁移和侵袭能力,在鼻咽癌中发挥抑癌作用.
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槲寄生凝集素抗胆管癌的作用及机制研究
目的：研究槲寄生凝集素是否具有抗胆管癌的作用并初步探讨其作用机制。方法：体外培养胆管癌细胞ICC‐9810，根据培养液中槲寄生凝集素浓度的不同，分为对照组、1ng／ml组、10ng／ml组、100ng／ml组。干预48 h后收集标本。M T T法检测细胞活力，并计算肿瘤抑制率；流式细胞仪检测凋亡细胞比率；Western‐blot方法检测Bcl‐2蛋白表达情况。结果：干预48 h后，各实验组OD值出现了降低，且随给药浓度的增加，OD值逐渐降低，肿瘤抑制率逐渐增高（ P＜0．05）；凋亡细胞比率也随培养液中槲寄生凝集素浓度的增加逐渐升高（ P＜0．05）；Bcl‐2蛋白表达量也随给药浓度的增加而逐渐降低。结论：槲寄生凝集素能够在体外抑制ICC‐9810细胞的生长，并通过下调Bcl‐2蛋白表达量而促进细胞的凋亡，而且这种作用随槲寄生凝集素浓度的增加而加强。
