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移植前白血病患者HLA区域杂合性缺失对HLA分型的影响
目的:研究移植前白血病患者初诊时期和缓解期HLA区域杂合性缺失(LOH)对HLA分型的影响.方法:用3种HLA基因分型常用的方法(SBT、SSO和SSP方法)分别对1例急性混合细胞白血病(MPAL)患者初诊静脉血样本1(骨髓原始细胞为81.7％)、样本2(骨髓原始细胞为93.07％)和缓解期静脉血样本3(骨髓原始细胞为＜0.01％)进行HLA-A、B、C、DQB1、DRB1基因分型;通过2种DNA混合实验进一步确定SBT方法检测HLA杂合峰的检出阈值和检测HLA分型时对静脉血原始细胞比例的要求.结果:样本1和样本2的HLA-A、B、C、DQB1、DRB1均为纯合位点,其中样本1有些HLA位点的测序背景峰偏高,无法确定位点的具体结果;样本3的5个HLA座位除了C座位外均为杂合位点.DNA混合实验结果表明,用SBT方法检测HLA双等位基因杂合峰的低检出限为20％;移植前白血病患者采用SBT方法检测HLA分型的要求是静脉血原始细胞＜75％,若≥75％,则可能因为原始细胞HLA区域出现LOH,从而导致HLA位点漏检.结论:对于白血病初诊患者,特别是原始细胞≥75％,如果HLA某一位点分型结果为纯合位点,应该再次采集患者缓解期静脉血或者正常体细胞,如口腔黏膜细胞,重新对该位点进行复核,排除HLA区域发生LOH造成假性纯合的可能,以免HLA配型结果发生错误,影响移植供者的选择和终的移植效果.
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分子生物学技术在HLA分型中的应用
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)是人体重要的免疫遗传体系,在免疫反应和造血干细胞与器官移植中发挥着重要的作用.现代医学的发展和器官移植配型要求的提高,促进了分子生物学与HLA分型的结合,提高了分型的准确性及实用性.本文综述了限制性片段长度多态性、序列特异性寡核苷酸探针、单链构象多态性、序列特异性引物、流式细胞术、基因芯片,以碱基序列为基础的HLA分型在HLA分型中的应用及虚拟DNA分析的进展.
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亲属肾移植患者术后肾功能与HLA配型和PRA相关性研究
目的 研究活体亲属肾移植受者人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)配合率、群体反应性抗体(panelreactive antibody,PRA)的产生和肾功能变化对移植肾存活的影响.方法 将336例活体亲属肾移植患者分为5组:①父母给子女供肾组(118例).②子女给父母供肾组(12例).③兄弟姐妹间供肾组(107例).④其他亲属供肾组(92例).⑤夫妻间供肾组(7例).进行HLA供受者配合率分析,并于肾移植术后1-4年追踪肾功能变化和PRA产生的情况.HLA分型检测采用美国One lanmbda公司提供的HLA-PCR-SSP分型试剂盒.PRA采用美国莱姆德公司和美国GTI公司提供的酶联免疫吸附试剂盒检测.结果 第1组的118例肾移植供受者HLA-A、B、DR、DQ抗原单体型半相合,其中有22例抗原配合率高于单体型半相合.肾移植术后有36例患者出现肾功能下降,其中8例为PRA阳性.第2组的12例肾移植供受者HLA-A、B、DR、DQ抗原单体型半相合,其中有7例HLA抗原配合率高于单体型半相合.肾移植术后1例患者肾功能下降,且为再次肾移植患者.第3组的107例兄弟姐妹间HLA-A、B、DR、DQ配型完全相配合有18例,73例为单体型半相合或大于单体型半相合,其余为低于单体型半相合或不相合.肾移植术后中有13例患者肾功能下降,其中3例PRA阳性.第4组的92例其他亲属移植的供受者间HLA-A、B、DR、DQ等于或大于单体型半相合的有24例,完全不相合的有9例,虽然HLA抗原配合率大于4个抗原,但并不是单体型半相合抗原的有8例,等于或小于3个抗原配合的有51例.肾移植术后有11例患者肾功能下降,其中6例患者PRA阳性.第5组的7例夫妻间肾移植患者,HLA配合率均≤3个抗原.肾移植术后有2例患者肾功能下降,且为PRA阳性.结论 父母、子女及兄弟姊妹等直系亲属肾移植供受者中HLA配合率高于其他亲属间移植供受者,但兄弟姊妹间HLA配型完全相同的则较低.HLA配型与近期移植肾存活无关,而与供者的年龄有关.良好的HLA配型与肾移植术后PRA生成的概率低有关.
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非血缘关系脐血移植治疗72例血液系统疾病患儿临床分析
自1988年首例进行HLA相合的同胞脐血移植(CBT)获得成功以来,CBT发展迅速~([1]).至今,全世界已建立50余家脐血库,保存40万份已经HLA分型的脐血,并提供2万余例CBT.现将2001年3月至2007年12月经非血缘脐血移植(UCBT)治疗的72例血液病患儿长期随访情况报告如下.
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HLA分型中罕见基因的分析报告
PCR-SSP技术是HLA分型常规采用的方法之一,具有简便、快捷等特点.笔者在使用PCR-SSP HLA基因分型试剂盒做HLA常规分型中遇到二份志愿供髓者的DNA样品,与GT公司的PCR-SSP HLA分型试剂产生特殊的反应格局.其中一份(以下称SZ1)在HLA-A座位上,与试剂盒鉴定HLA-A的A2 、A11,66等位基因的PCR引物呈阳性反应,而与鉴定HLA-A·11以及HLA-A·66基因的引物均呈阴性反应,这个特殊的反应格局提示该DNA样品可能是A·1103/08/14或存在与A·11基因相关的碱基突变,经DNA测序,结果是比较罕见的A·1103基因.另一份(以下称SZ2)在HLA-B座位上,与试剂盒鉴定HLA-B的B54L的PCR引物呈阳性反应,而与鉴定HLA-B·54及HLA-B·55、HLA-B·56基因的引物均呈阴性反应,提示可能是B·5610,经PCR-SSP进一步确证是B·5610基因.
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人类白细胞抗原分型技术的进展
学术背景:以往人类白细胞抗原分型主要采用血清学和细胞学方法,随着PCR技术、基因芯片技术及分子生物学技术的发展,已建立从基因水平上进行的人类白细胞抗原分型技术.目的:介绍人类白细胞抗原分型方法,为实际应用提供依据.检索策略:应用计算机检索PubMed1997-07/2007-07期间的相关文章,检索词"HLA technology',并限定文章语言种类为English.同时检索万方数据库1997-07/2007-07相关文章,检索词为"人类白细胞抗原",并限定文献语种为中文.共检索到相关文献142篇,选择与人类白细胞抗原分型技术有关的文献55篇.将初步筛选的文章进一步查找全文,排除综述和重复文献,内容相似的选择发表在权威杂志或近3年发表的文献,后共纳入30篇进行综述.文献评价:文献对不同的人类白细胞抗原分型方法进行汇总分析,符合纳入标准的30篇文献中,6篇为中文文献,24篇为英文文献.资料综合:传统的人类白细胞抗原分型方法主要是血清学和细胞学方法,分型准确性较差.随着PCR技术的广泛应用,人类白细胞抗原基因分型方法得到了迅速的发展.序列特异性引物、序列特异性寡核苷酸探针、直接测序、基因芯片等各具特点的人类白细胞抗原分型技术不断出现,使人类白细胞抗原的分型更加准确、精细、简便、实用,为临床推广应用打下了基础.结论:各种人类白细胞抗原基因分型方法各有优势,不能相互替代,这也是由人类白细胞抗原系统的高度多态性和复杂性所决定的,根据不同的用途可选择相应的方法.
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PCR-SSO流式荧光微珠法HLA-A*02高分辨分型检测模棱两可结果的统计分析
背景:由于HLA的复杂多态性,实际分型过程中难免会出现一些结果判读模棱两可现象.目的:统计分析基于PCR-SSO 流式荧光微珠HLA-A*02高分辨分型方法的模棱两可组合结果种类、比例,探讨解决模棱两可解决方法,提高高分辨分型比例.方法:对河南骨髓库捐献者 1 100人份HLA分型结果进行统计分析,计数法进行分类统计分析软件给出的包含HLA-A*02:01\02:09模棱两可组合代码,计算百分比;与确认为A*02:09的基因多态性分布进行比对,找出与A*02:09关联性较强的等位基因,用补充实验进行复核、确认,建立A*02:01\02:09模棱两可组合的判读方法.结果与结论:1 039例有效数据中包含A*02:01\02:09模棱两可组合279例(279/1 039,26.853%),代码种类19种,检出比例较高的有DMDC,DYVK,GMDD,GMDE;34例确认为A*0209的基因多态性统计显示A*0209的出现与A*11:01 (0.147 1)B*07:02(0.264 7)、DRB1*01:01(0.264 7 )、DRB1*03:01(0.117 6)有较强关联,选出高风险标本38例,经检测外显子1~7,并用SBT复核确认有1例结果为A*02:09(代码组合为GMDC),其余241例未检出A*02:09.提示 A*02:09的出现与B*07:02、DRB1*01:01、DRB1*03:01有较强关联,重点对这些关联标本进行外显子1~7检测,可有效地检出A*02:09.通过统计分析制定合理的判定规则和必要的复核实验可有效地简化操作程序,节省时间,降低费用,提高高分辨比例.
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单倍型测序确认HLA新等位基因A* 9217
目的 用单倍型测续方法判定骨髓库HLA分型检测中出现的模棱两可结果,以发现新的HLA基因序列.方法 用DNA测序的方法确认HLA分型结果,用单倍型测序的方法分析常规测序方法无法确认的杂合子的新基因序列.结果 9个常规SSO流式荧光微珠HLA分型方法无法确认的结果中,有8个可以用常规测序方法得到确切分型结果(该8个结果均为近期报告的新的HLA等位基因),1个标本被确认为新的基因序列A*9217,已经在GENBANK注册(注册号:EF526712),并向HLA因子命名委员会进行新基因申报(申报号:WHS10004629),得到WHO HLA因子命名委员会的正式命名.结论 DNA测序的方法是解决:HLA分型的直接方法;在遇到杂合子等位基因时,采用单倍型测续的方法简单有效.
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原因不明习惯性流产与HLA相关性的初步研究
目的:探讨HLA与原因不明习惯性流产(RSA)的关系.方法:用血清学方法对64例3次以上RSA患者及其配偶进行HLA抗原检测,并与100例正常群体比较.结果:HLA-A、-B、-DQ位点抗原频率在RSA病人组与正常对照组中无明显差异,而HLA-DR7抗原频率在RSA夫妇中则明显增高,为21.88%(28/128),P＜0.01,RR值为2.8.HLA-DR8在RSA夫妇组中明显下降,为7.03%(9/128),P＜0.01.结论:在上海人群中HLA-DR7可能与RSA的易感有关.
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HLA-A、B抗原分型与AIDP易感性
目的探讨AIDP易感性与HLA-A、B抗原分型的关联性.方法对31例AIDP患者和132例健康对照采用PCR-SSP法进行HLA-A、B抗原的基因分型.结果 HLA-A33抗原频率在AIDP组升高(P<0.05),相对危险率RR＝6.125.结论 HLA-A33 抗原与AIDP易感性相关联.
关键词： HLA分型 急性炎性脱髓鞘性多发性神经病 易感性 PCR-SSP法 -
PCR-SSP结合测序分析快速筛选HLA-A*0201亚等位基因
建立相对简单经济的检测HLA-A*0201等位基因的方法,以便于从特定人群中快速筛选HLA-A*0201阳性的个体,满足科研的需要.根据第十二届HLA国际联合会提供的标准操作规程和一对HLA-A位点特异性的引物,从外周血中提取基因组DNA,扩增HLA-A基因;再设计两对HLA-A2组特异性引物,采用套式PCR分别扩增HLA-A基因的5'端和3'端,如出现特异条带,则将后两对引物的PCR产物进行测序分析,对照HLA-A2组等位基因的第2和第3外显子序列图,确定是否为HLA-A*02011～02016的6个等位基因.结果:以HLA-A*0201阳性的T2细胞株为阳性对照进行检测,结果完全正确,并设立非HLA-A*0201的A2细胞株RML(HLA-A*0204)及Raii细胞株(非A2组)为对照,同时随机检测30份门诊病人血样,其中7份为HLA-A2阳性,经测序,2例为HLA-A*02011,1例为HLA-A*0211或0235,1例是HLA-A*0206或0221或0241或0244或0251或0254,1例是HLA-A*0205或0214,1例是HLA-A*0234或0235,1例是0250.本方法利用位点特异性引物进行2～3次PCR扩增,结合PCR产物测序便可相对简便经济地检测出HLA-A*0201的全部6个亚等位基因,为快速检测其他特定HLA等位基因提供了经济实用的模式.
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组织相容性与造血干细胞移植
对某些恶性血液病(如再生障碍性贫血、白血病)、自身免疫病、肿瘤化疗或放射治疗后、放射病等疾病的患者,造血干细胞移植[主要是骨髓移植(BMT)]是重建机体造血功能和免疫系统功能的唯一根治性手段[1-3].目前,全世界每年约进行5 000例以上造血干细胞移植术,其中约2 000例为无亲缘关系的移植;国内迄今已开展近千例造血干细胞移植,并逐年增加,近年达200余例/年.由于BMT受者均处于免疫无能或免疫功能极度低下的状态,同时骨髓移植物中含有大量免疫细胞,故,若供、受者间组织相容性抗原不相合,易发生移植物抗宿主反应(GVHR).GVHR一旦发生,不仅可导致移植术失败,还可能危及受者生命.
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急性淋巴细胞白血病的HLA分型
应用PCR-SSP方法对江苏地区33例高危组急性淋巴细胞白血病(ALL)患者进行HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗原基因分型,经统计分析发现HLA-B5、DR7、DR13与疾病相关.
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关节病型银屑病与HLA-DRB1等位基因相关性研究
目的:探讨HLA-DRB1等位基因与山东汉族关节病型银屑病(PsA)及其临床类型的相关性.方法:应用聚合酶链反应-寡核苷酸探针杂交分型法(PCR-SSOP)对42例山东汉族PsA(病例组)与90例健康献血者(对照组)进行HLA-DRB1等位基因分型.结果:42例PsA患者组中共检测到13对HLA-DRB1等位基因,未发现与PsA及其临床类型相关的HLA-DRB1等位基因,DRB1*12(P=0.036)等位基因出现的频率明显低于对照组,但经校正后无显著性差异.结论:HLA-DRB1等位基因可能与山东汉族PsA及其临床类型无关,对PsA的分型及预后价值有限.
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临沂地区血小板供者HLA-A、B和HPA1-17分型库的建立
目的 探讨血小板捐献者HLA-A、B和HPA1-17系统基因的分布特点,建立临沂地区已知HLA、HPA基因型机采血小板供者库.方法 对临沂地区205位无血缘关系的血小板捐献者分别采用PCR-SSOP、PCR-SSP方法对HLA-A、B位点、HPA1-17系统进行基因分型,计算基因频率和基因型频率.结果 检出HLA-A特异性抗原位点17个,频率较高抗原的有A2(0.2665)、A30(0.1418)、A24(0.1394)、A11(0.1149);检出HLA-B特异性抗原位点31个,频率较高的有B13(0.1663)、B62(00758)、B61(0.0636)、B58(0.0661).HPA1-17中,HPA7-14、16、17呈单特异性,未检出相应的等位基因HPAb,杂合度高的是HPA15,基因型HPA15a/15a、HPA15a/15b、HPA15b/15b,频率分别是0.3170,0.5073,0.1756,其次为HPA3,基因型HPA3a/3a、HPA3a/3b、HPA3b/3b,频率分别是0.3516,0.4293,0.2146,不配合率较高的是HPA3和HPA15,均为36.99%.频率高的HPA基因组合为HPA(1,4,5,6,7-14,16,17)aa-2aa-3ab-15ab(0.1854).结论 探查临沂地区血小板捐献者HLA-A、HLA-B和HPA1-17系统区域分布特点,可为PTR患者寻找匹配的血小板供者、建立全省联网的血小板捐献者已知型HLA、HPA分型库提供资料.
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美国国家骨髓库无关供者造血干细胞移植20年回顾
自美国国家骨髓库(NMDP)开展第一例无关供者移植以来,至今已有20年.NMDP目前的库容量已逾700万,已为6大洲提供了30 000多份无关供者造血干细胞.这一辉煌成就是美国国家骨髓库600多名工作人员共同努力的结果,同时也得益于广泛的国际合作,包括171个移植中心,73个供者中心,24个脐血库,97个骨髓采集中心,91个血液净化中心,26个HLA分型实验室和26个合作供者登记处.本文回顾了美国国家骨髓库的历史,阐述了20年来移植病人、移植物来源和预处理方案几方面的主要变化趋势.
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美国国家骨髓库20年回顾:成人无关供者造血干细胞移植
自1987年起,美国国家骨髓库(NMDP)提供了>30 000份URD-HCT,其中70%以上的受者是患有恶性血液病或获得性血液疾病的成人.在此期间发生很大变化,包括无偿捐献队伍的扩大、PBSCs采集、脐血库(UCB)的加入、HLA分型技术的进步、新药物的使用、低强度预处理(RIC)以及移植后免疫调节等.本文就过去20年NMDP成人受者HCT的数据及分析作一介绍.
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DNA测序用于HLA常规分型方法难以确定样本的检测
由于中华骨髓库的建设推动了我国HLA分型检测技术的快速发展,从微量淋巴毒试验到SSP方法、到SSO杂交技术、再到基因芯片、DNA测序只经过了短短几年的时间[1-2].目前临床移植配型主要采用SSP方法,骨髓库建设则主要采用PCR-SSO荧光微珠流式杂交分型技术,该方法与SSP法相比,具有高通量、高分辨率、高可靠性等特点.但是由于现有的分型试剂均是以目前已经发现的基因序列为基础进行设计的,而且大多数是以西方人群资料为依据,在用来进行中国人群的HLA分型检测时不可避免的出现新的反应格局,有时无法与试剂盒所提供的判断模板相匹配,因而出现不确定的模棱两可结果.
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基于Illumina Miseq测序技术的8000份标本HLA分型检测结果分析
目的 利用Illumina Miseq二代测序(NGS)技术进行HLA分型工作并分析其结果的准确性.方法 利用Illumina Miseq二代测序技术,对8 000人份血液标本进行HLA-A,HLA-B和HLA-DRB1位点的分型工作.为验证二代测序技术的准确性,同时选取1 000人份血液标本进行一代测序(PCR-SBT)分型实验,比较两种测序方法所得分型结果.结果 分型结果显示PCR-NGS HLA分型技术获得的数据与一代测序PCR-SBT技术数据完全吻合,且利用NGS测序技术的8 000人份标本中高分辨率结果7 908份(含G族1 058人份),中分辨率结果92份,高分辨率比例达到98.85％.结论 利用NGS测序技术进行HLA分型可以大大减少实验工作量,提高高分辨率结果比例,更容易对罕见型和新等位基因进行鉴定,在工作量大,时间紧迫时相对于传统的一代测序分型有明显优势.
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建立公共脐血库的策略
脐血作为干细胞的来源,不仅被广泛用于造血干细胞移植(HSCT),而且被用于临床细胞治疗以及再生医学研究.全球范围已建立了数以百计的公共或私人脐血库,并成立了国际脐血制品登记处(BMDW).虽然公共脐血库提供几乎所有脐血用于HSCT的脐血,但是其中大多数面临财务困境.本文介绍各种类型脐血库的特点,影响脐血制品使用率的因素,讨论提高公共脐血使用率及维持财务平衡的若干问题,包括选择性采集高质量脐血,设置佳库容量,脐血种族背景多样性,以及脐血的HLA分型和非遗传性母源抗原(NIMA)配型.
