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311份脐血样本HLA基因型无法判读原因探讨
本研究探讨影响脐血样本HLA分型结果的因素.采用序列特异性引物PCR反应(sequence-specific priming,SSP)对311份经过PCR-SSO和PCR-SSP方法仍无法判读HLA型别的脐血进行HLA低分辨重新分型,并对其中7份仍然无法确定HLA型别的脐血样本进行直接测序(sequence-based typing,SBT),分析无法判读的原因.结果显示:311份脐血样本中99.4%样本不能判定是因为当时HLA分型方法本身的限制性所造成的,0.6%样本不能判定的原因怀疑是脐血中存在母血污染所致.结论:HLA基因分型方法中序列特异性寡核苷酸探针杂交法(sequence-specific oligonueleotide probe hybridization,SSO)探针设计不足及PCR-SSP等位基因特异性引物的缺乏是影响HLA分型结果无法判读的主要因素.
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新等位基因HLA-A*240212的认定
目的 发现和认定1个HLA新等位基因.方法 应用PCR-SSO基因分型技术筛选可能的HLA新等位基因,PCR产物测序,确认与同源HLA等位基因序列的差异.结果 发现一个样品的HLA-A位点结果异常.其序列与已知所有HLA-A等位基因序列不一致,与同源性高等位基因A*24020101的差异只是在第2外显子区域中的230位碱基发生了C→T碱基的替换,但并未改变第77密码子编码的氨基酸.结论 该等位基因为HLA-A位点的1个新等位基因,已被WHO HLA因子命名委员会于2006年8月23日正式命名为HLA-A*240212.
关键词： HLA-A*240212 新等位基因 HLA PCR-SSO 测序分型技术 -
HLAⅠ、Ⅱ类基因与肾综合征出血热重型与轻型的相关性研究
目的 探讨HLAⅠ、Ⅱ类基因多态性与肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)患者临床特征的相关性.方法 应用PCR-SSO(polymerase chain reaction using sequence-specific oligonucleotides)基因分型技术对中国北方地区56例汉族HFRS患者HLAⅠ、Ⅱ类基因频率分布进行了检测.结果 HFRS重型组HLA-B35携带率为20%,HLA-B62及HLA-DR11携带率皆为15%,与轻型组比较差异皆具有统计学意义(P＜0.05).结论 HLAⅠ类基因中HLA-B35、HLA-B62及HLAⅡ类基因中HLA-DR11与中国北方地区汉族人群HFRS患者病情严重性密切相关.
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HLA-A、B基因对儿童过敏性紫癜的遗传易感性
目的 探索HLA-A、B等位基因对内蒙地区汉族儿童过敏性紫癜(AP)的遗传易感性.方法 采用病例对照研究方法,引入PCR-SSO技术,在祖籍三代居住内蒙地区、无血缘关系、无与异族通婚史及其他免疫性疾病史和家族史的汉族人群中,选择儿童AP病例组50例和健康儿童对照组96例,作以HLA-A、B等位基因型别分析.基因频率比较在单因素四格表x2或Fisher检验的基础上,作以多因素logistic回归分析.结果 HLA-A※26、HLA-B※35和HLA-B※52基因频率分别是7%、11%和9%,分别与健康对照组的1%、4.7%和3.6%比较,差异有统计学意义(x2分别是-、4.107和3.639,P分别是0.009、0.043和0.056).经回归后,Wald分别是4.783、4.205和4.293,P值分别是0.029、0.040和0.038,差异均有统计学意义(均P＜0.05).B分别是1.782、1.112和1.164,均B＞0;OR分别是5.941、3.041和3.202,均OR＞1,促进发病,其95%可信区间分别是1.203～29.331、1.050～8806和1.065～9627,其内均不包含1,与P意义相符,兼有统计学意义.EF分别是0.647、0.369和0.387,均EF＞0.结论 HLA-A※26、HLA-B※35和HLA-B※52等位基因可能是内蒙地区汉族儿童AP发病单体型中的3个遗传易感基因.
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HLA 分型技术在骨髓库上海分库高分辨检测工作中的初步应用
HLA 分型技术在骨髓库上海分库高分辨检测工作中的初步应用.方法:使用ABI3730xlDNA 测序仪,采用SBT 单链直接测序法,对上海地区的960 份自愿加入中华骨髓库的志愿者血液标本进行DNA 测序,其中HLA-I 类基因对第2,3 和4 外显子单链单向测序,II 类基因对第2 外显子单链单向测序,以得HLA 高分辨分型结果;对部分呈现血清学表达不一致的模棱两可高分辨结果标本,通过S S O 技术确认;对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本,通过SSP 或对2,3,4 以外的外显子单链检测作进一步确认.结果:960 份中华骨髓库上海分库的样本进行HLA 的PCR-SBT 高分检测,用DNA 单链测序法一次性获得高分辨结果为720 例;对部分呈现血清学表达一致的模棱两可高分辨结果标本,通过S S P 技术或2,3,4 以外的外显子单链检测做进一步确认,共计标本211 例;对于部分呈现血清学表达不一致的21 例模棱两可高分辨结果标本我们采用S S O 技术终确认了唯一的高分结果;此外,还检测到待确认新基因4 例.完成了本次实验标本100%高分结果入库要求.结论:SBT 单链测序技术为主,PCR-SSO,PCR-SSP 联合为辅,是骨髓库开展HLA 高分辨分型工作的有力工具.
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内蒙古地区蒙古族儿童过敏性紫癜与HLA-B基因的关联性
目的:探索内蒙地区蒙古族儿童过敏性紫癜(AP)与HLA-B等位基因的关联性,可望找出相关基因,以探寻AP的部分发病机制及其防治前景.方法:采用病例对照研究策略,引入PCR-SSO技术,在蒙古族儿童人群中,选择AP儿童病例组56例和健康儿童对照组66例,进行HLA-B等位基因的型别分析.基因频率比较在单因素四格表x2检验或Fisher检验的基础上,再做Logistic多元回归分析.结果:病例组HLA-B*15等位基因频率为26.8%,比对照组的10.6%增高(P=0.001);而病例组HLA-B*07和HLA -B*40等位基因频率分别为1.8%和7.1%,分别比对照组的12.1%和16.7%降低(x2分别为9.472和5.086,P分别为0.002和0.024).结论:HLA-B*15可能是内蒙地区蒙古族儿童AP发病单体型中的一个遗传易感基因;而HLA-B*07和HLA-B*40可能为其两个遗传保护基因.
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新等位基因HLA-B*4060的认定
应用PCR-SSO基因分型技术发现可能的HLA新等位基因,对PCR产物进行测序及克隆测序,确认与同源HLA等位基因序列的差异.发现一个样本的HLA-B位点结果异常,其核苷酸序列与已知所有HLA-B位点等位基因序列均不一致,与同源性高的等位基因B*400102在第三外显子区域有7个碱基的差异.判断该等位基因为HLA-B位点的一个新等位基因,于2005年7月被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4060.
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PCR-SSO流式荧光微珠法HLA-A*02高分辨分型检测模棱两可结果的统计分析
背景:由于HLA的复杂多态性,实际分型过程中难免会出现一些结果判读模棱两可现象.目的:统计分析基于PCR-SSO 流式荧光微珠HLA-A*02高分辨分型方法的模棱两可组合结果种类、比例,探讨解决模棱两可解决方法,提高高分辨分型比例.方法:对河南骨髓库捐献者 1 100人份HLA分型结果进行统计分析,计数法进行分类统计分析软件给出的包含HLA-A*02:01\02:09模棱两可组合代码,计算百分比;与确认为A*02:09的基因多态性分布进行比对,找出与A*02:09关联性较强的等位基因,用补充实验进行复核、确认,建立A*02:01\02:09模棱两可组合的判读方法.结果与结论:1 039例有效数据中包含A*02:01\02:09模棱两可组合279例(279/1 039,26.853%),代码种类19种,检出比例较高的有DMDC,DYVK,GMDD,GMDE;34例确认为A*0209的基因多态性统计显示A*0209的出现与A*11:01 (0.147 1)B*07:02(0.264 7)、DRB1*01:01(0.264 7 )、DRB1*03:01(0.117 6)有较强关联,选出高风险标本38例,经检测外显子1~7,并用SBT复核确认有1例结果为A*02:09(代码组合为GMDC),其余241例未检出A*02:09.提示 A*02:09的出现与B*07:02、DRB1*01:01、DRB1*03:01有较强关联,重点对这些关联标本进行外显子1~7检测,可有效地检出A*02:09.通过统计分析制定合理的判定规则和必要的复核实验可有效地简化操作程序,节省时间,降低费用,提高高分辨比例.
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急性淋巴细胞白血病患者HLA-DRB1基因多态性研究
目的:研究北方汉族人群HLA-DRB1等位基因多态性与急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者的遗传关联.方法:采用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)方法,对184例北方汉族人群ALL患者和3 578例健康脐带血样本HLA-DRB1等位基因多态性进行研究.结果:184例ALL患者HLA-DR9(18.21%,χ2=16.07,P＜0.01,RR=1.74,EF=0.077 4),DR12(14.13%,χ2=7.12,P＜0.01,RR=1.523,EF=0.049),DR14(7.88%,χ2=5.194,P＜0.05,RR=1.574,EF=0.028 7)和DR16(4.89%,χ2=8.527,P＜0.01,RR=2.065,EF=0.025)基因频率显著高于正常人群,而HLA-DR7(8.15%,χ2=7.078,P＜0.01,RR=0.60,EF=0.086)和DR15(12.23%,χ2=4.049,P＜0.05,RR=0.710 9,EF=0.067)基因频率显著下降.结论:HLA-DR9、DR12、DR14、DR16等位基因对ALL患者有遗传易感作用,而HLA-DR7、DR15等位基因对ALL患者有遗传拮抗作用.
关键词： 急性淋巴细胞性白血病 HLA-DRB1 PCR-SSO -
青海土族、撒拉族HLA-DQA1和-DQB1基因多态性探讨
目的:检测青海土族和撒拉族健康个体HLA-DQA1和-DQBl.等位基因频率,了解和分析这两个民族的HLA-DQA1和-DQB1基因多态性.方法:用PCR-SSO方法检测132名土族和80名撒拉族健康个体的HLA-DQA1和-DQB1的基因多态性,并将所得结果与国内其他民族的同类资料进行比较.结果:土族和撒拉族在HLA-DQA1和-DQBl高频率等位基因分布上有共同点,也有一定的独特性.这两种民族HLA-DQA1*0102和*0501以及DQB1*0201、*0301、*0402和*0602基因分布频率上具有显著性差异.结论:土族和撒拉族与北方诸民族的等位基因频率接近,而与其他南方诸民族的差异相对较大.
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蒙汉族过敏性紫癜高分辨HLA-A、B基因分型及临床意义
本文引入SBT技术,将以往PCR-SSO检测发现的蒙、汉族儿童过敏性紫癜(Anaphylactoid purpura, AP)之易感基因作以高分辨分型,并与中分辨分型和临床表型对比分析,旨在探讨两种分型技术在临床应用的意义;寻找基因突变位点;发现蒙、汉儿童AP临床表型不同的部分遗传背景.
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008 HLA分型进展
HLA在免疫应答中占有重要地位,其在器官移植中的作用,与疾病相关性的意义,以及在亲子鉴定,人类学研究等方面的应用一直为临床所关注,建立快速而准确的HLA分型技术具有重要的临床与社会价值.现就HLA分型的各种方法及每种方法的长处与不足加以比较,综述如下.
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内蒙地区蒙汉族儿童过敏性紫癜HLA-A、B关联基因的探讨及测序分析
探索内蒙地区蒙、汉族儿童过敏性紫癜(AP)与HLA-A、B等位基因的关联性及易感基因是否有基因突变位点.在祖籍三代居住内蒙地区,无血缘关系,无与异族通婚史及其他免疫性疾病史和家族史的蒙、汉族人群中,分别选择儿童AP蒙族56例、汉族50例为病例组,正常健康儿童蒙族66名、汉族96名为对照组.引入PCR-SSO技术,分析HLA-A、B等位基因的多态性,并将易感基因进一步做SBT高分辨分型及DNA序列分析.结果显示:(1)蒙古族病例组HLA-A*11和HLA-B*15基因频率均较对照组明显增高(P<0.05 OR1,其95%可信区间内均不包含1,EF0),高分辨后,前者均为A*1101,后者主要是B*1501,其余为B*15**.而HLA-B*07和HLA-B*40基因频率均较对照组明显降低(P<0.05 OR<1,其95%可信区间内均不包含1,EF0); (2)汉族病例组HLA-A*26、HLA-B*35基因频率均较对照组明显增高(P<0.05 OR1,其95%可信区间内均不包含1,EF0),高分辨后,前者均为A*2601,后者主要是B*3503,其余为B*35**.蒙汉族病例组均未发现基因突变位点.由此可得出HLA-A*11和HLA-B*15可能是内蒙地区蒙古族儿童AP发病的2个遗传易感基因; 而HLA-B*07和HLA-B*40为其保护基因; 而HLA-A*26和HLA-B*35为汉族儿童AP发病的遗传易感基因.
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HLA-B新等位基因B*51:02:03的确认和分析
人类白细胞抗原系统(HLA)在造血干细胞和器官移植中具有重要意义,供受者HLA相合程度与移植后移植物抗宿主病(GVHD)的发生率以及移植物的存活率等密切相关[1-2],目前已有多个国家建立造血干细胞捐献者资料库,作为临床患者造血干细胞移植的供者来源.笔者近期在常规的造血干细胞捐献者标本分型中,采用Luminex PCR-SSO分型方法发现1例HLA-B疑难分型标本,进而测序分析发现其为新的等位基因,被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA-B*51:02:03,现将结果报道如下.
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流式技术在骨髓库标本基因分型中的应用初探
目的 探讨流式技术结合SSO方法在骨髓库标本HLA分型中的应用.方法 使用序列特异性寡核苷酸探针结合流式技术(Flow-SSO) 为中华骨髓库捐献者进行HLA检测,得出各位点的等位基因频率,并使用γ2检验对各位点的基因分布进行Hardy-Weinberg平衡检验.结果 970份标本检出HLA-A、B、DRB1位点共61种基冈座位,其中,A位点共16种等位基因,66种基因型,未见A34与A36;HLA-B位点共32种等位基因,188种基因型;HLA-DRB1位点共检出13种等位基因,85种基因型.各位点分布均符合Hardy-Weinberg平衡.中华骨髓库实验室以2%的比例对所检标本进行抽检,各结果均达质控要求.结论 流式技术结合SSO方法是大批量标本HLA检测中较为理想的方法.
关键词： 人类自细胞抗原(HLA) PCR-SSO 基因频率 -
西藏珞巴族HLA-DRB1基因多态性
目的:检测西藏珞巴族HLA-DRB1等位基因及基因型频率,并将其与18个人群的HLA-DRB1频率进行比较,绘制系统发生树.方法:应用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)技术,对我国西藏南部林芝地区3代内无血缘关系的92个珞巴族健康个体进行了HLA-DRB1位点的基因分型.采用不加权配对组算术方法(UPGMA)绘制系统发生树.结果:在92例珞巴族个体的184个等位基因中共检出11种HLA-DRB1等位基因,其中HLA-DRB1·04(27.20%),DRB·12(25.50%)在珞巴族中常见,共占珞巴族可检出等位基因的52.70%;其他频率大于5%的等位基因还有DRB1·14(15.20%),DRB1·15(9.80%)和DRB1·08(8.20%).结论:西藏珞巴族HLA-DRB1等位基因分布与其他华人群体均存在很大的差异,显示其HLA等位基因频率分布的民族独特性;在遗传距离上珞巴族和藏族近,这与民族学、历史学和社会学研究结果相一致.
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斑秃患者HLA-A、B、DRB1基因多态性调查分析
目的 调查河南汉族斑秃患者HLA-A、B、DRB1中低分辨多态性分布,探讨该病与HLA的关联性.方法 收集2007年10月至2008年2月被河南省某医院皮肤科诊断为斑秃的121例河南籍汉族无血缘关系者血液标本,提取基冈组DNA,采用PCR-SSO流式荧光微珠法进行HLA-A、B、DRB1中低分辨检测,统计分析A、B、DRB1等位基因频率,并与本地区24 930份造血干细胞捐献者(对照组)进行对比,u检验分析两组样本间率的差异的显著性.结果 共检测斑秃患者血样121例,其中A位点等位基因频率较高的有A*02(0.2603)、A*11(0.1653)、A*24(0.1240),B位点等位基因频率较高的有B*15(0.2107)、B*13(0.1198)、B*40(0.1074),DRB1位点等位基因频率较高的有DRB1*15(0.2273)、DRB1*07(0.1364)、DRB1*09(0.1198)、DRB1*04(0.1074);在对照组中A位点等位基因频率较高的有A*02(0.2909)、A*11(0.1666)、A*24(0.1570),B位点基因频率较高的有B*15(0.1370)、B*13(0.1316)、B*40(0.1315)、B*51(0.0765),DRB1位点基因频率较高的有DRB1*15(0.1786)、DRB1*07(0.1322)、DRB1*09(0.1302)、DRB1*04(0.1082),两组样本A位点等位基因分布差异无统计学意义;斑秃患者DRB1*12频率低于正常对照组(P<0.05),B*15(62)和DRB1*15基因频率显著高于正常对照组(P<0.05).结论 斑秃患者与正常人群中HLA-A位点等位基因分布差异无统计学意义.DRB1*12可能对于斑秃的发病有抵御作用,B*15(62)和DRB1*15可能为斑秃的易感基因.
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新等位基因HLA-B* 9537的确认和序列分析
目的 识别并确认1个新的HLA等位基因.方法 应用PCR-SSO,PCR-SSP基因分型技术对1份临床样本做HLA分型,对可能的HLA新等位基因进行分子克隆和DNA测序,分析与同源的B*1504的差异.结果 得到1份样本的序列与巳知的所有HLA-B等位基因序列不一致,与B*1504的差异表现在第3外显子区域中的379 G>C,409 C>T,412 G>A,419 C>T,导致氨基酸分别由谷氨酸→天冬氨酸(E103D),苏氨酸→赖氨酸(T113K),谷氨酰胺→谷氨酸(Q114E)和丝氨酸→苯氨酸(S116F).结论 该基因为HLA-B位点的1个新等位基因,巳被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*9537
关键词： HLA HLA-B*9537 新等位基因 PCR-SSO SBT序列分析 -
序列分析鉴定新等位基因HLA-B*1316
目的 分析鉴定HLA-B位点的1个新等位基因.方法 应用DNA序列分析常规PCR-SSO基因分型时发现的疑似HLA新等位基因,确认与同源性高的HLA等位基因序列的差异.结果 发现1个HLA-B位点分型结果异常的样本,其核苷酸序列与已知所有HLA-B位点等位基因序列不一致,与同源性高的等位基因B*1302的差异,是在第3外显子区域中的第184位碱基发生了T→A的替换,导致第62位密码子由GTG→GAG,其编码的氨基酸由缬氨酸→谷氨酸.结论 确认了HLA-B位点的1个新等位基因,已被WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*1316.
关键词： HLA-B*1316HLA等位基因 PCR-SSO 序列分析 -
HLA-B新等位基因B*4608的核苷酸序列分析
目的 分析1个HLA-B位点有异常反应格局样本的核苷酸序列.方法 采用DNA快速抽提试剂盒抽提样本基因组DNA,PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第1-8外显子,PCR产物直接经TOPO TA克隆到质粒载体中以获得单链,对克隆所得产物进行HLA-B基因第2、3、4外显子双向测序分析.结果 先证者样本克隆测序得到两个等位基因,其中1个等位基因为B*5502,另1个经Blast验证为新等位基因,其序列已递交Genbank(DQ177521,DQ177522,DQ177523).与接近的B*4601等位基因序列相比,新等位基因在第3外显子上有2个核苷酸不同,即第538位T→C和第539位G→T,并由此导致1个氨基酸改变:第156位色氨酸→亮氨酸.结论 该新HLA-B等位基因已WHO HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*4608.
