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备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定
目的进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液,以获得某种神经营养活性物质. 方法用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质. 结果手术侧脊髓后角组织提取液经Superdex G-75 prep grade凝胶层析和HPLC层析后,得到的A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节(DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用.经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示,A峰洗脱液呈现一条分子量约为60 kD的蛋白质主带. 结论结合生物活性检测结果,分子量约60 kD的蛋白质可能是手术侧脊髓后角组织的神经营养活性物质.
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吗啡备用根大鼠脊髓组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定
我室以往的研究表明,吗啡作用的部分去传入大鼠脊髓组织提取液中,大于10kD组份具有神经营养活性作用,但尚不知道是哪些分子量的蛋白质具有神经营养活性.为了寻找这些物质,本研究用Sephacryl S-200凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和组织培养等技术和方法,进一步分离纯化吗啡备用根大鼠部分去传入的脊髓组织提取液,以期获得某些神经营养活性物质,为吗啡促进脊髓可塑性变化的分子基础提供新资料.
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备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定
我室新近的研究发现,部分去传入纤维支配的脊髓后角组织提取液含有神经营养活性组份,其分子量约在40kD～78kD之间,但尚不清楚是哪种分子量的蛋白质具有神经营养活性作用.为了寻找这种物质,本研究用Superdex G-75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱(HPLC)层析和细胞培养等技术和方法,进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配(手术侧)的脊髓后角组织提取液,以期获得某种神经营养活性物质.
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重组人血小板源生长因子的药学研究进展
血小板源生长因子（platelet-derived growth factor， PDGF）是一种通常存贮于血小板α颗粒中的碱性蛋白质，由血小板趋化到受损部位的巨噬细胞，受损血管处的平滑肌细胞以及受损部位的血管内皮细胞等多种细胞所分泌。自从发现 PDGF 后，人们已成功地纯化了人、猪、牛、羊等的PDGF，并对其理化性质进行了大量的研究。PDGF 是一种热稳定的阳离子型糖蛋白，分子量为28~35 kD，是由分子量分别为13~14 kD 和16~17 kD 的两个亚基通过二硫键连接组成。PDGF 的等电点为9.8~10.2，具有耐高温（100℃）、耐酸（pH 2.5）以及耐受各种解离剂（4 mol/L 盐酸胍、6 mol/L 尿素、2%SDS）的特点。凝胶层析发现，人PDGF 在体内有两种形式，即 PDGF-I（分子量为31 kD）和 PDGF-II（分子量为28 kD），两者在氨基酸及以共价键相连的碳水化合物的组成上有所不同，但其致丝裂活性相似[1]。
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艾蒿花粉主要变应原的分离、纯化与鉴定
目的对我国蒿属花粉中常见、重要的变应原艾蒿花粉进行分离、鉴定与纯化.方法采用不同的提取液得到艾蒿花粉粗浸液,经饱和(NH4)2SO4分级沉淀后用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质组分,并用凝胶成像系统测定各组分的相对分子质量(Mr);采用Western blot鉴定其主要及次要变应原;通过DEAE-Cellulose DE-32离子交换层析(ion exchange chromatography,IEC)和Sephadex G-75凝胶层析(gel chromatography)对艾蒿花粉变应原进行纯化.结果分离后得到20多种蛋白质组分,其中Mr为58×103、38×103、25×103、20×103、16×103等5个条带蛋白含量丰富;分离到的蛋白质组分中有9种蛋白能与确诊的蒿属花粉过敏患者血清中蒿属花粉特异性IgE结合,其中Mr为62×103、43×103、38×103的蛋白条带的结合率高;经纯化后仅得到Mr为62×103的主要变应原.结论艾蒿花粉的主要变应原Mr分别为62×103、43×103和38×103,层析技术可以对Mr为62×103的主要变应原成分进行纯化.
关键词： 艾蒿花粉 SDS-PAGE Western blot 离子交换层析 凝胶层析 -
苦瓜核糖体失活蛋白的纯化及其诱导HL-60 细胞凋亡的研究
目的:探讨运用假配基亲和层析和凝胶过滤层析相结合的手段纯化苦瓜核糖体失活蛋白(RIP)的可行性,同时观察其抑制HL-60细胞增殖并诱导其发生凋亡的生物学活性.方法:利用假配基亲和层析法、凝胶过滤层析法提取纯化苦瓜RIP;通过绘制生长曲线和MTT检测观察苦瓜RIP抑制HL-60细胞增殖的活性,运用流式细胞仪检测细胞周期相分布及细胞凋亡率.结果:运用硫酸铵分级沉淀、Blue Sepharose CL-6B假配基亲和层析、Sephadex-G75凝胶层析等方法提取、纯化得到了高纯度的苦瓜RIP,并且能够获得较高的得率;一定作用剂量的苦瓜RIP不仅能够抑制FHL-60细胞的增殖活性,还可以诱导其发生凋亡.结论:运用假配基亲和层析和凝胶过滤层析相结合的手段提取、纯化苦瓜RIP是可行的;苦瓜RIP可能是通过诱导细胞发生凋亡来发挥其抗肿瘤活性.
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一种提取猪血铜锌超氧化物歧化酶的新方法
超氧化物歧化酶(SOD)在我国目前虽有生产,但由于技术原因,产量很低,在临床上很少应用.为此,本文从猪血中提取出Cu,Zn-SOD,采用凝胶层析的方法,一步即可生产出纯酶.
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两种方法纯化流感病毒的比较
目的 比较两种方法纯化流感病毒的效果.方法 取病毒原液,经超滤浓缩后,分别用Sepharose 4FF凝胶层析和蔗糖密度梯度离心法进行纯化,并对纯化产物进行检定.结果 层析法的纯度、卵清蛋白及杂蛋白去除率略高于蔗糖密度梯度离心法,而蔗糖密度梯度离心法的病毒回收率优于层析法.结论 两种方法均可用于流感病毒的纯化.
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钟状期小鼠磨牙牙胚组织中蛋白聚糖类型的检测分析
目的:检测分析钟状期小鼠磨牙牙胚组织中蛋白聚糖的类型.方法:建立钟状期小鼠磨牙牙胚体外培养模型.用核素标记,凝胶层析,碱处理及酶消化的方法分析体外培的养牙胚组织中蛋白聚糖的类型.结果:体外培养的小鼠钟状期磨牙牙胚、成釉器与牙乳头中[39S]标记的大分子经Superose 6层析柱层析后,均得到3个洗脱峰.其中第1个洗脱峰经硫酸软骨素酶ABC消化后完全消失,第2、第3个洗脱峰在硫酸软骨素酶ABC消化后峰值降低,继续用乙酰肝素酶消化后则基本消失.只用硫酸角质素酶处理,上述3个洗脱峰均未发生改变.碱处理后3个洗脱峰均消失.并在有效分配系数Kd=0.47处出现1个新的洗脱峰.结论:小鼠钟状期磨牙牙胚、成釉器与牙乳头组织含有大分子硫酸软骨素蛋白聚糖、小分子硫酸软骨素蛋白聚糖以及硫酸乙酰肝素类蛋白聚糖,但不存在硫酸角质素蛋白聚糖.
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中国南海织锦芋螺毒素的分离及鉴定
目的从中国南海织锦芋螺中分离新的芋螺毒素,为药物发现、药物设计提供新的活性多肽或前体多肽,比较不同地域织锦芋螺毒素的构成,研究环境对织锦芋螺毒素分泌的影响.方法织锦芋螺毒液经预处理后,凝胶层析分离粗毒,用HPLC进一步分离,氨基酸测序.结果分离得到了10余个织锦芋螺毒素组分,确定了10个织锦芋螺毒素的氨基酸序列,其中4个为新型织锦芋螺毒素,6个与已报道的相同.结论中国南海织锦芋螺毒液中含有丰富的M族芋螺毒素,毒素成分与菲律宾宿务岛(Cebu)、马尼拉岛的织锦芋螺相似.
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螺旋藻激酶分离提纯方法初探
目的 研究螺旋藻激酶的分离纯化方法,为工业化放大生产螺旋藻激酶药物提供一定的实验依据,为后续的酶学性质研究打下基础.方法 配制螺旋藻激酶粗酶液,通过离心沉淀,饱和硫酸铵分级盐析,透析,凝胶层析来分离提纯螺旋藻激酶,后用SDS-PAGE电泳法验证螺旋藻激酶纯度,测定分子量.结果 通过一系列的分离提纯得到了较纯的蛋白,酶回收率达到42.3%,纯化倍数达到6.1.所得螺旋藻激酶的分子量为40 KD.结论 初步探索出较为优化的螺旋藻激酶的分离纯化方法.
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人D-二聚体分离纯化及鉴定
目的 分离纯度较高和人D-二聚体(D-dimer),为制备抗人D-二聚体单克隆抗体提供可靠抗原.方法 以凝血酶、凝血因子Ⅻ等处理人纤维蛋白原,得到交联纤维蛋白,经纤溶酶消化,得到交联纤维蛋白降解产物(FDP);对FDP作Sephacryl S-300凝胶过滤层析和聚焦层析,分离纯化得到D-dimer.采用免疫比浊法测定D-dimer 含量、染料结合法测定纯化蛋白含量,以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)观察D-dimer的纯化情况,Weston Blot法确认D-dimer的存在.结果 制备得到的FDP SDS-PAGE图谱显示有多条蛋白条带,1条分子量为180 ～250kD蛋白条带在Western Blot图谱中显示可以被D-dimer单克隆抗体特异性地识别.FDP经Sephacry S-300凝胶层析和聚焦层析后得到纯度较高的D-dimer(n=3):总蛋白含量比为(77.82±7.98)％,蛋白回收率(25.27±6.35)％;SDS-PAGE图谱显示:经过两步层析得到的终产物为分子量180～250 kD的蛋白;Westem Blot证实:经过Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析处理,终得到分子量为180～250 kD的终产物可被D-dimer单克隆抗体特异性识别.结论 采用Sephacryl S-300凝胶层析和聚焦层析能够分离纯化获得较高纯度的D-dimer,可作为制备D-dimer单克隆抗体的抗原.
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卵黄IT抗毒素亲和层析纯化大肠杆菌不耐热肠毒素
大肠杆菌不耐热毒素(Escherichia coli heat-labileenteratoxintoxin,LT)是产毒性大肠杆菌(ETEC)感染人畜引起急性腹泻的主要毒素之一,关于它的提纯方法有不少报[1-3],一般采用沉淀、超滤、浓缩、凝胶层析,离子交换层析及超速离心等多种技术联合使用.
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信号转导与转录激活因子3蛋白的提取及纯化
信号转导与转录激活因子家族(signal transdusers and activator of transcription,STATS)是一族由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子,初是作为IFN-γ调控下的DNA结合蛋白被克隆的,迄今已发现有7个家族成员[1].
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非受体型酪氨酸激酶-Syk蛋白的提取与纯化
目的:从转染syk基因的Sf21细胞中提取、纯化免疫相关因子Syk蛋白.方法:将syk基因转染Sf21细胞,于28℃培养48 h,收集细胞,用超声波破碎仪裂解细胞,提取裂解液中总蛋白,用Yellow-3凝胶和Toyopearl-AF-Heptin-650M凝胶层析柱分离、纯化.层析液中的Syk蛋白存在和性质,用SDS-PAGE、免疫印迹实验和等电聚焦实验鉴定.结果:从25亿个Sf21细胞裂解液中提取了含有Syk的225 mg蛋白质.经Yellow-3凝胶层析分离,得到两个亚种的Syk蛋白,相对分子质量(Mr)均为72×103.进一步用Toyopearl-AF-Heptin-650M凝胶层析纯化后,得到两个纯的Syk蛋白,SDS-PAGE、免疫印迹实验结果显示,两种Syk的Mr均为72×103,与Syk的理论相对分子质量吻合.但等电聚焦实验显示,这两种Syk蛋白成分具有不同的pI值.结论:从25亿个转染syk基因的Sf21细胞中纯化出8 mg Syk蛋白,纯度高于95%.这两种Syk的Mr虽然相同,但具有不同的pI值,是两个亚种.这些Syk可用于研究Syk的作用机制、抗Syk抗体的制备和Syk诊断试剂盒的制备等.
