首页 > 文献资料
-
三七总皂苷对大鼠肝组织内药物代谢酶CYP3A的抑制作用及其动力学分析
目的:研究三七总皂苷(total saponins of the root and rhizome of Panax notoginseng,PNS)对大鼠肝组织内药物代谢酶CYP3A的抑制作用及其动力学分析.方法:采用差速离心法制备大鼠微粒体酶,用半数效量概率单位法及Lineweaver-Burk 双倒数作图法求得大鼠肝脏CYP3A的米氏常数(Km)、大反应速度(Vmax)和三七总皂苷对大鼠肝脏CYP3A的半数抑制浓度(IC50)以及判断三七总皂苷对CYP3A的抑制类型和抑制常数(Ki,Kis).结果:三七总皂苷对大鼠肝组织CYP3A有抑制作用,其IC50 689.54 mg·L-1；对底物氨基比林,CYP3A的Km0.036 mmol·L-1,Vmax是21.01 μmol·min-1·g-1；三七总皂苷对大鼠肝组织CYP3A属于混合性抑制,其抑制常数Ki247.79 mg·L-1,Kis321.79 mg·L-1.结论:三七总皂苷对大鼠肝脏CYP3A的活性有明显抑制作用.
-
重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶动力学分析
目的 对重组的日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)进行酶动力学特征分析.方法 用阿糖胞苷-2',5’-二磷酸琼脂糖凝胶通过亲和层析纯化重组SjTGR蛋白.利用紫外分光光度计(UV-2550,SHIMADZU),在25℃条件下分别以5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、胰岛素、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、β-羟乙基二硫化物(HED)为底物,测定SjTGR的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷氧还蛋白(Grx)活性及其米氏常数.以金诺芬为抑制剂,测定其对SjTGR活性的抑制作用及抑制常数.结果 SjTGR是一种具有TrxR,GR,Grx活性的多功能酶,酶活性分别为8.11、2.19和12.10 μmol·min-1 mg-1.不同的酶底物得到的Km值分别为(21.42士0.44)μmol· L-1(NADPH)、(3.24士0.40)μmol·L-1 (Trx)、( 145.05±6.31)μmol·L-1 (DTNB)、(49.55士6.31)μmol·L-1 (GSSG)、(2 792±231)μmol·L-1 (HED)、(1 698±54) μmol·L-1( GSH).金诺芬对SjTGR活性有明显的抑制作用,5 nmol·L-1重组SjTGR的TrxR、GR、Grx半数抑制浓度(IC50)值分别为6.89、0.47和8.12 nmol·L-1,TrxR、GR的抑制常数(K1)分别为为0.762和0.034 nmol· L-1.金诺芬对SjTGR的TrxR活性抑制作用为竞争抑制,而对SjTGR的GR活性的抑制作用为非竞争抑制作用.结论 SjTGR具有TrxR、GR、Grx三种酶活性,能被金诺芬所抑制,是开发抗日本血吸虫新药的分子靶标.
-
Pro167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶的动力学特征
目的 对Pr0167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的动力学特征进行分析与评价.方法 以携带CTX-M-14基因的大肠埃希菌临床株为模板,克隆目的 基因,重组工程菌,并表达CTX-M-14型ESBL.进而采用基于重叠延伸PCR法的定点突变技术,将CTX-M-14型ESBL的167位点Pro(P)分别突变为Gly(G)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T),重组构建P167G、P167Q、P167S和P167T四株突变型的CTX-M-14工程菌.表达与纯化野生型、重组型和突变型CTX-M-14型ESBL,检测其水解β-内酰胺类抗菌素的酶动力学参数(Kcat、Km和Km).结果 对野生型与重组型CTX-M-14型ESBL的酶动力学参数进行配对t检验,结果显示两者Kcat(t=1.796,P=0.123)、Km(t=0.559,P=0.596)、Kcat/Km(t=0.893,P=0.406)间的差异无统计学意义(P>0.1).与重组CTX-M-14型ESBL相比,P167S突变型酶对头孢他啶的Km值大幅降低,为突变前的1/16(8.39/134.85);Kcat和Km值分别为突变前的2.87倍(1.81/0.63)和43.6倍(0.218/0.005);且对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松和头孢噻肟的Kcat/Km值都呈现出显著减小的趋势(P<0.05).与重组CTX-M-14 ESBL相比,P167Q和P167G突变型酶对头孢他啶的Kcat值亦大幅减小(P<0.01),而P167T突变型对头孢他啶的酶动力学参数无明显变化.结论 重组型与野生型CTX-M-14 ESBL之间各项酶动力学参数的差异无统计学意义(P>0.1).而P167S位点的突变,不仅增强了CTX-M-14型ESBL对头孢他啶的亲和力,也加快了酶-底物复合物的转换速率.通过对Pr0167位点4种突变型酶的动力学参数比较,初步说明突变型CTX-M ESBL对头孢他啶所具备的高水解活性机制,不能简单地归结于Pro167位点被小侧链氨基酸残基取代而导致酶活性中心空间扩大的解释.
-
VEB-3型与VEB-1型超广谱β-内酰胺酶生化特性的比较
目的研究VEB-3型超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的生化特性,并与VEB-1型ESBL进行比较.方法将blaVEB-3和blaVWEB-1基因连接至pET28a载体上,并用重组质粒转化大肠埃希菌BL21进行克隆表达,分别挑选blaVEB-3或blaVEB-1阳性表达的菌落测定β-内酰胺类抗生素对其低抑菌浓度(MIC),同时提取酶蛋白进行等电点和酶动力学分析.结果 VEB-3和VEB-1型ESBL具有基本一致MIC和相同的等电点(pI=7.45),但两者的酶动力学性质存在一定的差异:对头孢他啶和头孢噻肟,VEB-3较VEB-1表现出更高的亲和力,两者Km相差一倍左右;对头孢噻吩,VEB-1比VEB-3更具亲和力;而对阿莫西林,VEB-1型ESBL表现出很高的亲和力,而VEB-3仅有低的亲和力,两者Km相差20多倍.结论 VEB-3和VEB-1型ESBL具有相同的等电点,不同的动力学参数,blaVEB-1基因中Leu56→Phe突变可能导致了两者酶动力学性质的差异.
-
葡萄糖激酶基因突变导致的永久性新生儿糖尿病一例及其功能学研究
目的：探讨1例永久性新生儿糖尿病患者的致病基因及其致病机制。方法对2013年8月北京协和医院诊治的1例永久性新生儿糖尿病患者，分析其临床特点并抽提相关家系成员的基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)扩增后进行葡萄糖激酶(GCK)基因直接测序。构建野生型和突变型质粒，体外表达并纯化GCK重组蛋白，进行酶动力学和热稳定性分析。两组间数据比较采用t检验。结果在该新生儿糖尿病患者发现GCK基因c.571 C>T(R191W)和c.1136 C>A(A379E)复合杂和突变。功能学分析显示，与野生型相比，R191W和A379E突变导致蛋白产量明显下降[分别为(86±9)比(48±8)mg/L、(86±9)比(54±5)mg/L，t=5.56、5.36，均P<0.01]；当ATP为饱和浓度时酶促反应速度达到1/2大反应速度时的葡萄糖浓度(S0.5)显著升高[分别为(7.63±0.21)比(35.27±2.20) mmol/L、(7.63±0.21)比(13.30±0.44) mmol/L，t=-21.70、-20.32，均P<0.001]；当葡萄糖为饱和浓度时酶促反应速度达到1/2大反应速度时的ATP浓度(ATP-Km)显著升高[分别为(0.30±0.01)比(0.42±0.01) mmol/L、(0.30±0.01)比(0.54±0.04)mmol/L，t=-17.02、-10.68，均P<0.001]；突变蛋白对葡萄糖的催化常数显著下降[分别为(20.9±2.1)/s比(6.5±1.0)/s、(20.9±2.1)/s比(10.5±1.1)/s，t=10.61、7.58，均P<0.01]。突变蛋白的热稳定性下降，表现为同一孵育温度下或同一温度更短时间内酶活性的快速丧失。结论 GCK基因c.571 C>T (R191W)和c.1136 C>A(A379E)复合杂和突变是该新生儿糖尿病的致病原因。突变导致的蛋白表达下降、酶对葡萄糖和ATP的亲和力下降以及热稳定性的下降可能是其致病机制。
-
G6PD缺乏症杂合子检测方法的研究进展
G6PD缺乏症是常见的遗传性酶缺乏疾病,全世界约4亿人受累,多分布在非洲、中东地区和东南亚.我国则主要分布在两广(广东、广西)地区.1967年WHO制定了根据酶活性和酶动力学鉴定G6PD酶变异型的统一方案.现已鉴定出400余种G6PD生化变异型[1].1986年国外实验室可克隆出了G6PD的cDNA并获得了cDNA顺序.1991年美籍华人Ellson发表了G6PD基因组全序列.应用克隆G6PD基因技术或PCR联合直接测序,现已鉴定出140种G6PD基因突变型[2].
-
槲皮素-7,4′-二硫酸酯钠对重组人CK2全酶的抑制作用及动力学分析
目的观察槲皮素-7,4′-二硫酸酯钠(sodium quercetin-7,4′-disulphate,SQDS)对重组人CK2全酶的直接作用及酶动力学机制.方法通过测定转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP的32P放射活度检测不同条件下的重组人CK2全酶的活性.结果重组人CK2是一种Ca2+,cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶,与天然CK2的性质一致.SQDS对重组人CK2全酶有很强的抑制作用,IC50为4.4 μmol·L-1,抑制作用大于已知CK2抑制剂DRB和A3.CK2的动力学研究表明:SQDS与ATP和酪蛋白分别呈竞争性和非竞争性抑制作用.结论 SQDS是有效的CK2抑制剂,对于开发更有效的CK2抑制剂及将SQDS用于临床提供了一定的实验依据.
-
瑞香素在大鼠肝S9中体外代谢研究
瑞香素给药后在大鼠体内快速代谢消除,但机制仍不清楚.本研究开展瑞香素体外代谢特征分析,鉴定了瑞香素在大鼠肝S9 (RLS9)中的代谢产物结构,测定了不同代谢路径的动力学参数.HPLC-DAD-MS检测发现,瑞香素在RLS9中转化为6个代谢产物,包括7-或8-葡糖醛酸和硫酸酯代谢物、8-甲基代谢物及7-硫酸酯-8-甲基代谢物.动力学分析表明,瑞香素在RLS9的葡糖醛酸化和甲基化反应符合米氏动力学,7-O-磺酸化反应和8-O-磺酸化反应分别符合双位点和底物抑制动力学.3条代谢路径中,清除率大的为磺酸化反应,其次为甲基化和葡糖醛酸化反应.借助体外代谢动力学数据和体外-体内关联方法,预测获得的瑞香素在大鼠体内肝清除率(54.9 mL·min-1·kg-1)与文献报道的大鼠体内总清除率(58.5 mL·min-1·kg-1)接近.结果表明,肝脏是瑞香素在大鼠体内主要代谢位点.磺酸化、甲基化和葡糖醛酸化反应是瑞香素在大鼠肝脏中主要清除路径.
-
LC-MS/MS研究新型酪氨酸酶抑制剂UP302在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学
目的 建立并验证测定大鼠肝微粒体孵育液中UP302含量的高效液相色谱-串联质谱法,研究UP302在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学.方法 经大鼠肝微粒体孵育的UP302样品,经色谱柱分离,电喷雾离子化负离子检测,扫描方式为选择反应监测,用于定量分析的离子反应分别为m/z 301.1→135.2(UP302)和m/z252.9→132.O(内标大豆苷元).考察不同孵育时间、底物浓度和微粒体浓度对UP302代谢的影响,确定佳反应条件.结果 标准曲线线性范围为0.1～20 μmol·L-1,线性关系良好,日内日间准确度在86.42％～ 112.59％,日内日间精密度均小于9.09％,回收率在100.50％ ～ 109.91％之间.确定了酶动力学参数,大反应速度Vmax为196.08 μmol·L-1·min-1·g-1,米氏常数km为14.98μmol·L-1,内在代谢清除率CLint为13.09 mL-1·min-1·g-1.结论 该检测方法快速、专属、灵敏度高,可满足酶动力学检测要求.
关键词： UP302 肝微粒体 酶动力学 液相色谱-质谱联用法 -
3,6-二羟黄酮对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析
目的观察3,6-二羟黄酮对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制,寻找CK2的抑制剂.方法以重组人CK2全酶为分子靶点,检测不同浓度3,6-二羟黄酮对CK2活性的影响,并通过酶的动力学分析其抑制作用机制.CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP的[32P]放射活度来检测.结果重组人CK2与天然CK2的性质完全一致.3,6-二羟黄酮对重组人CK2全酶具有较强的抑制作用,IC50为13.93 μmol·L-1;进一步分析,它与ATP呈竞争性抑制CK2的活性,抑制常数Ki值为10.67μmol·L-1;与酪蛋白呈以非竞争性为主的混合性抑制CK2的活性,抑制常数Ki值为17.34 μmol·L-1.结论3,6-二羟黄酮是一种重组人蛋白激酶CK2的抑制剂.重组人CK2可作为一种较为简便地筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点.
-
β-内酰胺酶抑制剂——他佐巴坦与舒巴坦酶动力学的比较研究
目的:比较他佐巴坦与舒巴坦的抑酶强弱.方法:测定Ki值及IC50.结果:他佐巴坦的Ki值大于舒巴坦的Ki值;他佐巴坦的IC50小于舒巴坦的IC50.结论:他佐巴坦的抑酶作用强于舒巴坦.
-
AG372对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制动力学研究
目的观察Tyrphostin中的AG372对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制.方法利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和β亚基,在体外等摩尔数混合构成有大生物活性的重组CK2全酶,在不同条件下测定CK2的活性.CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP或[γ-32P]GTP的[32P]放射活度来检测.结果重组人CK2是一种Ca2+,cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶,与天然CK2的性质一致.AG372对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用,IC50为627.1 nmol*L-1,抑制作用远大于已知CK2抑制剂DRB和A3.AG372对重组人CK2的动力学研究表明:它与GTP呈竞争性抑制作用, 与酪蛋白呈非竞争性抑制作用.结论 AG372是一种很强的重组人CK2抑制剂.重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便筛选和开发有效的CK2抑制剂的分子靶点.
-
糖尿病周围神经病变治疗近况
糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)患病率达84.29%[1].由于对其发病机理尚未完全明了,治疗上从已知的研究成果:神经病变超微结构的变化;神经血流量改变;神经营养因子IGF的缺乏;酶动力学的异常和药物新剂型方面的改进入手.
-
巴马香猪、人和大鼠洛伐他汀体外代谢的比较
目的 体外研究巴马香猪、人和大鼠肝微粒体中洛伐他汀代谢的酶动力学差异,并用人体肝微粒体细胞色素P450 3A(CYP3A)酶特异性抑制剂酮康唑(KCZ)进行抑制,观察抑制活性反应的差异,评估巴马香猪作为人体CYP3A酶代谢药物研究实验动物模型的可行性.方法 制备巴马香猪、人和大鼠的肝微粒体,构建肝微粒体与洛伐他汀的反应体系以及抑制剂抑制反应体系,利用RP-HPLC测定洛伐他汀代谢的变化,并对其相应活性值进行比较.结果 巴马香猪肝微粒体代谢洛伐他汀的酶动力学变化比大鼠更为与人体相似.人体CYP3A特异性抑制剂均可以显著抑制三者的代谢,但是巴马香猪代谢速率下降程度与人体接近. 结论 巴马香猪与大鼠相比,更适用于作为人CYP3A酶代谢的相关药物研究的良好动物模型.
-
海兔素在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究
目的建立测定大鼠肝微粒体孵育液中海兔素含量的高效液相色谱法（HPLC），研究海兔素在大鼠肝微粒体中代谢的酶动力学以及CYP3A特异性抑制剂酮康唑对其代谢反应的影响。方法考察不同孵育时间、肝微粒体蛋白浓度、海兔素浓度对代谢反应的影响，并采用双倒数作图法计算海兔素的酶促反应动力学参数；观察不同浓度酮康唑（0.5，2，5，10，20，40 mg/L）对海兔素体外代谢的影响。结果海兔素的标准曲线线性范围为0.5~100 mg/L，线性关系良好，日内、日间精密度均小于3.18%，提取回收率在96.19%~97.83%，室温24 h和﹣20℃冷冻一周稳定性良好；海兔素在大鼠肝微粒体中代谢的佳温孵时间为30 min、佳蛋白浓度为1 mg/ml，并确定了酶动力学参数， Km为19.72 mg/L、Vmax为0.35 mg/（min·g） Protein、CLint为17.75 ml/(min·g) Protein；CYP3A的特异性抑制剂酮康唑能够明显抑制海兔素的体外代谢。结论该检测方法简单、快速、专属性和灵敏度高，适用于海兔素在大鼠肝微粒体中的酶促反应动力学研究，并推测CYP3A可能参与海兔素的体外代谢。[营养学报，2015，37（1）：62－67]
-
绞股蓝总苷对大鼠心、脑Na+,K+-ATP酶的抑制作用及其动力学分析
目的 观察绞股蓝总苷对心、脑微粒体Na+,K-ATP酶活性的抑制作用及动力学分析.方法 采用离心法制备大鼠心、脑组织微粒体酶,以比色法测定Na+,K-ATP酶活力,通过酶动力学研究方法分析绞股蓝总苷对心、脑微粒体Na+,K-ATP酶活性的抑制作用.结果 绞股蓝总苷体外可逆性抑制大鼠心、脑微粒体Na+,K-ATP酶活性,并呈浓度依赖性,且对脑微粒体Na+,K-ATP酶的抑制作用较强,其IC50分别为(58.79±8.25)、(52.07±6.25)mg/L.降低Na+,K+浓度或增加ATP浓度则增强其抑制酶活性作用.酶动力学分析显示,绞股蓝总苷对微 粒体Na+,K-ATP酶的作用近似Na+的竞争性拮抗剂、底物ATP的反竞争性抑制剂、K+的混合性抑制剂.结论 绞股蓝总苷通过抑制心、脑Na+,K-ATP酶活性而发挥其强心作用和中枢抑制作用.
-
槲皮素对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析
目的观察槲皮素对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制.方法利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和β亚基,在体外等摩尔数混合构成有大生物活性的重组CK2全酶,在不同条件下测定CK2的活性.CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP的[32P]放射活度来检测.结果重组人蛋白激酶CK2是一种Ca2+、cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶,与天然CK2的性质一致.槲皮素对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用,IC50为522 nmol/L,抑制作用大于CK2已知抑制剂DRB和A3.槲皮素对重组人蛋白激酶CK2的动力学研究表明:它与ATP和酪蛋白分别呈竞争性和非竞争性抑制作用.结论槲皮素是CK2有效抑制剂,该抑制作用可能是槲皮素抗肿瘤作用又一分子机制,为今后筛选更有效的CK2抑制剂提供了一种较为简便的筛选方法.
-
糖尿病周围神经病变治疗近况
糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病常见的并发症之一,患病率达84.25%[1].由于对其发病机制尚未完全明了,治疗上从已知的研究成果入手,如神经病变超微结构的变化;神经血流量改变;神经营养因子IGF的缺乏;酶动力学的异常和药物新剂型方面的改进等.DPN治疗首先在于有效地降低过高的血糖,血糖早期得到控制是防治其慢性并发症的关键.在控制血糖的基础上.针对神经病变累及到感觉神经、运动神经和自主神经所引起的一系列症状以及导致患者的生活质量严重下降进行治疗,下面就对DPN治疗近况作一简述.
-
普洛萨姆对大鼠肝微粒体细胞色素P450 3A酶动力学的影响
[目的] 研究普洛萨姆对大鼠肝微粒体细胞色素P450 3A(CYP3A)酶动力学的影响.[方法] 以CYP3A的探针反应,睾酮6β羟基化反应,来标记CYP3A的活性进行酶动力学体外研究.[结果] 普洛萨姆浓度在0.1%～0.5%时,大鼠CYP3A活性略升高,但与对照组无显著差异(P> 0.05);当浓度高于0.5%时,能抑制CYP3A活性,且抑制程度随浓度提高而加大.当浓度在0.8%～2%时,CYP3A活性有一定程度降低,但与对照组无显著差异(P>0.05),当浓度高于3%时,能观察到活性被抑制了约27.2%,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),当浓度为5%时,抑制百分比已达42.3%.动力学研究表明,0.2%普洛萨姆对CYP3A动力学参数没有显著影响(P> 0.05),但是2%普洛萨姆对CYP3A动力学参数有显著影响,Vmax、S50、CL均被低估,同时Hill系数被高估.[结论] 普洛萨姆对大鼠CYP3A活性有浓度依赖性的影响,普洛萨姆在较高浓度能影响CYP3A酶的动力学性质.
-
超广谱β-内酰胺酶SHV-18的表达纯化及活性验证
目的:产超广谱β-内酰胺酶是肠杆菌科细菌和肺炎克雷伯菌对β-内酰胺酶类抗生素耐药的重要机制,该类酶主要水解青霉素类、头孢菌素类以及单环酰胺类抗生素.自从1983年第一次有关β内酰胺酶的报道开始,至今已经发现超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的种类超过400种,其中SHV型是常见的ESBLs类型之一.本研究主要探讨了超广谱β-内酰胺酶SHV-18的原核表达载体的构建、酶的纯化和活性验证.方法:利用肺炎克雷伯菌ATCC700603全基因组为模板,应用分子生物学技术钓取SHV-18基因,构建pET22b(+)-SHV-18表达质粒,经测序鉴定后,转化大肠杆菌Transetta (DE3),IPTG诱导表达并亲和纯化,进一步通过抗生素水解实验,检测其水解活性,测定其酶动力学参数.结果:成功构建了可以以裂解上清形式高效表达SHV-18的工程菌.通过亲和纯化终获得纯度达到90％以上的β-内酰胺酶SHV-18.获得的SHV-18蛋白能够水解青霉素G、头孢拉定、头孢唑肟、头孢他啶、头孢吡肟等多个抗生素.结论:获得了对青霉素和头孢菌素类具有水解活性的超广谱β-内酰胺酶SHV-18,并对其酶动力学参数进行了检测.在实验室研究了β-内酰胺酶SHV-18对不同抗生素的水解特性,更加有利与指导临床抗生素的合理使用.
关键词： SHV-18 超广谱β-内酰胺酶(ESBLs) 表达 纯化 酶动力学
