重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶动力学分析

目的 对重组的日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶(SjTGR)进行酶动力学特征分析.方法 用阿糖胞苷-2',5’-二磷酸琼脂糖凝胶通过亲和层析纯化重组SjTGR蛋白.利用紫外分光光度计(UV-2550,SHIMADZU),在25℃条件下分别以5-联硫代-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)、胰岛素、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、β-羟乙基二硫化物(HED)为底物,测定SjTGR的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷氧还蛋白(Grx)活性及其米氏常数.以金诺芬为抑制剂,测定其对SjTGR活性的抑制作用及抑制常数.结果 SjTGR是一种具有TrxR,GR,Grx活性的多功能酶,酶活性分别为8.11、2.19和12.10 μmol·min-1 mg-1.不同的酶底物得到的Km值分别为(21.42士0.44)μmol· L-1(NADPH)、(3.24士0.40)μmol·L-1 (Trx)、( 145.05±6.31)μmol·L-1 (DTNB)、(49.55士6.31)μmol·L-1 (GSSG)、(2 792±231)μmol·L-1 (HED)、(1 698±54) μmol·L-1( GSH).金诺芬对SjTGR活性有明显的抑制作用,5 nmol·L-1重组SjTGR的TrxR、GR、Grx半数抑制浓度(IC50)值分别为6.89、0.47和8.12 nmol·L-1,TrxR、GR的抑制常数(K1)分别为为0.762和0.034 nmol· L-1.金诺芬对SjTGR的TrxR活性抑制作用为竞争抑制,而对SjTGR的GR活性的抑制作用为非竞争抑制作用.结论 SjTGR具有TrxR、GR、Grx三种酶活性,能被金诺芬所抑制,是开发抗日本血吸虫新药的分子靶标.

金诺芬的RP-HPLC法测定

目的:研究反相高效液相色谱(RP-HPLC)内标定量法测定金诺芬含量.方法:采用ODS柱,甲醇-(0.01mol·L-1)KH2PO4缓冲溶液为流动相,0.10mg·mL-1尿苷乙腈-水(60:40)溶液作内标及样品溶剂,紫外检测波长210nm.结果:平均回收率99.85%,RSD为0.27%(n=5),线性范围为0.10～2.20mg·mL-1,检出限10ng·mL.结论:本法精密度高,重现性好,分析结果可靠.

半胱氨酸蛋白酶抑制剂金诺芬在实体瘤细胞中的作用及其分子机制

半胱氨酸蛋白酶抑制剂金诺芬是一种含+1价金、磷化氢及硫醇的药物,常用于风湿性疾病的治疗.近年来研究发现,金诺芬具有抗实体瘤细胞的能力,其通过抑制硫氧蛋白还原酶,增加活性氧簇及氧化应激反应,从而影响肿瘤氧环境和组织结构,诱导含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶系统活化.体内外结果研究显示,金诺芬可诱导多种肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖及侵袭,发挥抗肿瘤作用.另外,金诺芬与传统抗肿瘤药联合应用,可发挥一定的协同作用.

改变病情药物与关节炎的治疗

非甾体类抗炎药为关节炎的症状性治疗药物,与它们相对而言还有一类药物具有减缓、停止,甚至修复关节病变的作用,称为改变病情药物.然而,这类药物却无一具有根治类风湿关节炎(RA)和强直性脊柱炎的功能.1.改变病情药物的种类金制剂:包括注射金和口服金二种剂型.前者疗效较快,作用较好,但毒副作用大,我国至今尚无此剂型.为了克服注射制剂的缺点,口服金应运而生.我国自1990年以来,在临床上广泛应用口服金制剂,即金诺芬(Auranofin),系烷磷化氢金烃基化合物,每片3mg含金量29%,该品疗效好,不良反应少.

低浓度金诺芬对中性粒细胞生物学功能的影响

金诺芬是一种含磷金类化合物,具有较强的免疫抑制和抗炎作用,在临床上广泛地应用于对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的治疗,抗炎、镇痛作用效果明显[1].

金诺芬分子结构、晶体结构及熔点的研究

研究金诺芬分子结构、晶体结构、熔点与重结晶条件的相互联系。用多种溶剂进行重结晶。结果表明：随重结晶条件改变，可以得到112～114℃、118～120°C或114～118℃等多种熔点的金诺芬，生成的金诺芬熔点主要取决于重结晶速度，与所用溶剂无关。改变重结晶速度，可使不同熔点的金诺芬互相转变。对不同熔点的金诺芬进行元素分析、比旋光度分析及1H-NMR、13C-NMR、MS、IR分析，结果表明，不同熔点的金诺芬其分子结构完全一致。X-衍射表明，不同熔点的金诺芬分属于两种晶系。

金诺芬抗日本血吸虫活性机制及其细胞毒性的探讨

目的 探讨金诺芬对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)童虫和成虫作用效果的差异及其作用靶点,测定金诺芬对宿主细胞的毒性.方法 用二硫苏糖醇(DTT)/胰岛索还原法体外测定金诺芬对重组SjTrx-1酶活性的影响.用日本血吸虫尾蚴感染4～6周龄雌性昆明鼠(童虫组10只小鼠,600～800条/只；成虫组10只小鼠,80～100条/只),灌注法收集童虫(15d)和成虫(35 d).虫体经无菌生理盐水充分洗涤后,转移至预先添加培养基的12孔板中,分别加入金诺芬和吡喹酮至其终浓度为1、5和10 μg/ml,显微镜下观察化合物处理2、24、48和72 h后虫体的形态改变和死亡情况.CCK-8试剂盒测定金诺芬(5和10 μg/ml)对3种人源宿主细胞(Hep G2、293T和Hela)的毒性. 结果 10 μg/ml金诺芬作用下,40 min内重组SjTrx-1还原胰岛素的总量减少54.5％.5μg/ml金诺芬体外作用24 h后,成虫死亡率达75％,而童虫未见死亡；10 μg/ml金诺芬作用72 h后,童虫和成虫均全部死亡,但童虫死亡时间较成虫延迟.金诺芬和吡喹酮作用后,光镜下观察,虫体均出现颜色变灰暗、挛缩和卷曲等现象;电镜下可见虫体表被膜结构严重破坏.细胞毒性测试结果显示,5 μg/ml金诺芬可使细胞相对活力降低85％以上,而10 μg/ml时细胞几乎全部死亡.结论 SjTrx-1是金诺芬作用靶点之一.金诺芬具有较强的细胞毒性作用,对日本血吸虫成虫和童虫的作用效果存在差异,对成虫的作用效果更显著.

金诺芬治疗类风湿关节炎(摘要)

大麻素受体激动剂WIN55,212-2联合金诺芬对人肝癌细胞HepG2增殖与凋亡的影响

目的 探讨大麻素受体激动剂WIN55,212-2(WIN)联合金诺芬(AF)对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响,并对其机制进行初步研究.方法 分别用5 μmol/L WIN、0.25 μmol/L AF、5μmol/L WIN联合0.25μmol/L AF处理HepG2细胞24h和48 h后,MTS法检测细胞活力;采用AnnexinV-FITC和PI双染色法并通过流式细胞仪分析细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bip、ATF4、PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9)表达的变化.分别用5μmol/L WIN联合0.25 μmol/L AF、Z-VAD-FMK以及Z-VAD-FMK预处理1h后再用5 μmol/L WIN联合0.25 μmol/L AF处理HepG2细胞24 h,Western blot检测蛋白PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的变化.结果 与两药单独使用相比,WIN联合AF明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,可以引起Bcl-2蛋白表达水平下调,内质网应激反应相关蛋白Bip、ATF4蛋白表达水平上调,以及活化Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9,引起PARP蛋白的切割.加入Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK处理细胞后,能部分逆转联合用药的细胞凋亡比例.结论 大麻素受体激动剂WIN联合AF能有效诱导肝癌细胞凋亡,其机制可能与Bcl-2表达下调、内质网应激反应和Caspase系统活化相关.

抗类风湿病药金诺芬对中性粒细胞自发性凋亡的影响

目的研究抗类风湿病药金诺芬(AF)对中性粒细胞自发性凋亡的影响.方法运用流式细胞技术和MTS细胞活性测定技术对不同浓度的金诺芬影响下的中性粒细胞活性及其凋亡进行观察,并用低分子质量DNA"梯形条带"(DNAlad-der)检测技术对其凋亡进行鉴定.结果低浓度金诺芬(1 μmol/L)可通过延迟中性粒细胞的自发性凋亡而增加其生命期限;但当金诺芬浓度大于5 μ.mol/L时,中性粒细胞的坏死则明显增加,因而缩短了其生命期限.结论金诺芬临床治疗量时的血清浓度一般在0.7 μmol/L左右,在此浓度下,中性粒细胞通过延迟自发性凋亡来延长其功能性生命期限,所以金诺芬对类风湿关节炎患者的抗炎、抗风湿作用不可能通过直接清除炎症局部的中性粒细胞来完成;金诺芬的抗炎、抗风湿作用可能存在更为复杂的作用机制.

金诺芬-β-环糊精包合物的研究

采用饱和溶液法制备金诺芬-β-环糊精包合物.首次使用电镜复染技术对包合物进行鉴定,清楚显示一分子β-环糊精(β-CD)包合两分子金诺芬(1).用分光光度法测定包合物中1含量,操作简便、快速、结果准确,在10～50μg/ml范围内,线性良好,r=0.9999.结果表明,制成包和物后1在水中溶解度显著提高达309.75μg/ml(20℃),为原药的22.95倍.