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中药复方PC-SPES Ⅱ抑制人前列腺癌细胞LNCaP增殖及其对AR,PSA表达的影响
基于雄激素受体(AR)信号通路探讨中药复方PC-SPESⅡ抑制人前列腺癌细胞LNCaP增殖的作用.采用MTT法检测PC-SPESⅡ对LNCaP细胞增殖的影响,显示PC-SPESⅡ质量浓度为180～1 440 mg·L-1时能显著抑制LNCaP细胞增殖,PC-SPESⅡ作用24,48 h的IC50分别为311.48,199.01 mg.L-1;流式细胞仪检测细胞周期分布的变化发现240 mg·L-1 PC-SPESⅡ能阻滞细胞于G2/M期,在G0/G1峰前出现明显的凋亡峰,随作用时间的增加而升高;同时采用Hoechst 33258染色观察凋亡细胞形态和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测凋亡细胞比例,PC-SPESⅡ质量浓度为480 mg·L-1时凋亡细胞比率增加,作用效果均呈一定剂量依赖性;通过ELISA法检测LNCaP细胞分泌PSA的水平,以25mg.L-1Bic作为阳性对照药,发现480 mg· L-1PC-SPESⅡ能显著降低细胞分泌PSA;采用qRT-PCR和Western blot方法检测AR,PSA mRNA和蛋白表达的变化,结果显示以人工合成雄激素25 μg· L-1R1881诱导LNCaP细胞后,240～480 mg· L-1 PC-SPESⅡ能显著下调AR,PSAmRNA和蛋白表达,抑制AR由细胞质转移入细胞核.以上结果表明,PC-SPESⅡ对LNCaP细胞体外增殖有抑制作用,阻滞细胞周期于G2/M期并诱导细胞凋亡,其机制可能与下调AR,PSA的表达,抑制AR核转位有关.
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1α,25(OH)2D3抑制前列腺癌机制研究进展
1α,25(OH)2D3是一种类固醇激素,在抑制前列腺癌发生和发展中具重要作用.1α,25(OH)2D3抑制前列腺癌涉及多方面的分子过程,包括G1/S细胞周期阻滞、促癌细胞凋亡、抗血管生成和阻止癌细胞迁移等.本文将从维生素D3合成代谢羟化酶表达调控、VDR基因多态性、雄激素及受体调控、抗炎因子表达调控、胰岛素样生长因子及相关结合蛋白表达调控等方面阐述了近年来1α,25(OH)2D3抑制前列腺癌分子机制的研究进展,为维生素D3预防和治疗前列腺癌的应用提供了参考.
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前列腺癌抗原1蛋白表达下调对前列腺癌LNCaP细胞恶性生物学行为的影响
目的 探讨前列腺癌抗原1(PCA-1)蛋白表达下调对前列腺癌LNCaP细胞增殖、细胞周期分布和细胞侵袭能力的影响,及其可能的分子机制.方法 将PCA-1-siRNA和对照siRNA转染前列腺癌LNCaP细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞术和Transwell侵袭实验检测前列腺癌LNCaP细胞增殖、细胞周期分布和细胞侵袭能力,采用Western blot法检测前列腺癌LNCaP细胞中Bcl-xl、细胞周期素E(cyclin E)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和p21蛋白的表达水平.采用免疫组织化学法检测126例前列腺癌组织和88例良性前列腺增生(BPH)组织中PCA-1蛋白的表达情况.结果 重组质粒PCA-1-siRNA可明显抑制前列腺癌LNCaP细胞中PCA-1蛋白的表达,转染48 h后,未转染组、对照组和实验组LNCaP细胞中PCA-1蛋白的相对表达量分别为0.816±0.078、0.799±0.081和0.226-±0.013.PCA-1蛋白表达下调能明显抑制前列腺癌LNCaP细胞增殖,将细胞周期阻滞在S期,并降低细胞的侵袭能力.PCA-1蛋白表达下调能明显降低LNCaP细胞中Bcl-xl、cyclin E和MMP-9的表达,同时提高p21的表达.PCA-1蛋白在前列腺癌组织和BPH组织中的阳性表达率分别为77.8％ (98/126)和10.2％ (9/88),差异有统计学意义(P＜0.05).PCA-1蛋白表达与前列腺癌患者的Gleason评分、临床分期和骨转移情况有关(均P＜0.05).结论 PCA-1蛋白表达可能在前列腺癌的发展中具有重要作用,下调PCA-1表达可导致前列腺癌LNCaP细胞增殖、细胞周期分布和侵袭能力的改变,这可能与Bcl-xl、cyclin E、MMP-9和p21蛋白的表达变化相关.
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雄激素非依赖性前列腺癌耐药转化过程中异常甲基化基因的鉴定
目的 探讨DNA甲基化在雄激素非依赖性前列腺癌耐药转变过程中的作用.方法 以雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞为对照组,雄激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI为实验组,采用Illumina DNA甲基化芯片检测两组细胞基因组DNA甲基化水平,并对甲基化芯片数据进行生物信息学分析;实时荧光定量RT-PCR检测前列腺特异抗原PSA mRNA的相对表达量.结果 LNCaP细胞相比,发现LNCaP-AI细胞共有2619个基因甲基化水平发生改变,其中758个基因发生高甲基化,占差异基因的28.9％,1860个基因表现为低甲基化,占差异基因的71.1％,这些差异甲基化基因涉及Notch信号通路和胰岛素样生长因子1信号通路.LNCaP-AI细胞PSA基因甲基化水平上升了3.67倍,其PSA mRNA表达水平下调了6.5倍.结论 DNA甲基化参与了前列腺癌雄激素非依赖性转变的过程,可能是导致前列腺癌耐药的诱因之一.
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GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位
目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位.方法:采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体.重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布.结果:重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312 bp的条带,与预期结果一致.测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列.在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符.荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合.结论:成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性.
关键词： GFP-SUMO-3融合蛋白 重组蛋白质类 LNCaP细胞 基因表达 -
YKL-40转染对前列腺癌LNcap细胞增殖及侵袭活性的影响
目的 探讨外源性YKL-40基因转染对前列腺癌LNcap细胞增殖、侵袭、迁移及黏附活性的影响.方法 RTPCR法检测前列腺癌细胞LNcap、PC-3、DU-145 YKL-40基因内源性表达情况;用pcDNA3.1-YKL-40质粒转染LNcap细胞,分别经MTT法、Boyden小室法及黏附试验检测转染前后细胞增殖、侵袭、迁移及黏附活性,并进行体外药敏试验.结果 仅DU-145细胞可内源性表达YKL-40基因;pcDNA3.1-YKL-40转染的LNcap细胞在第2～5天的A490值均显著高于对照组(P<0.05),其侵袭(75.11±4.40)和迁移穿膜细胞数(133.00±5.07)及黏附率(107.57%)均显著高于对照组(P<0.05),对5-FU、顺铂和依托泊苷的IC50值分别为(31.15±0.43)、(4.15±0.13)和(55.22±0.57)μmol/L,均显著高于对照组(P<0.05).结论 YKL-40基因能促进LNcap细胞增殖,提高细胞侵袭、迁移及黏附活性,并使其对5-FU、顺铂和依托泊苷具有一定的耐药性.
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异黄酮对前列腺癌细胞的激素受体基因表达的影响
[目的]通过大豆异黄酮的活性物质染料木黄酮和大豆苷元抑制前列腺癌PC-3和LNCaP细胞增殖和对激素基因表达的影响,探讨大豆异黄酮治疗和预防前列腺癌的可能机制.[方法]0、10、20、40、60、80和160μmol/L剂量组的染料木黄酮和大豆苷元处理前列腺癌细胞,细胞存活率用MIT方法检测,α雌激素受体(ERα)、β雌激素受体(ERβ)、雄激素受体(AR)和血管上皮生长因子(VEGF)等基因的mRNA表达用RT-PCR进行检测.[结果]染料木黄酮和大豆苷元对PC-3、LNCaP细胞具有明显的抑制生长作用,在160μmol/L的浓度时,染料木黄酮、大豆苷元作用72 h后,PC-3细胞的存活率分别为12.28%和44.88%,LNCaP细胞的存活率分别为25.48%和43.14%,其抑制效应具有时间和剂量依赖性,同时发现对PC-3细胞的VEGF、ERα和ERβ基因表达下调,AR基因处理前后没有检测到;对LNCaP细胞的VEGF和AR基因表达下调,ERα和ERβ的表达并无影响.[结论]大豆异黄酮能抑制前列腺癌细胞的增殖效应,存在时间和剂量效应关系,雌激素受体基因可能直接在大豆苷元抑制PC-3细胞的增殖中参与作用,而染料木黄酮抑制PC-3细胞和染料木黄酮及大豆苷元抑制LNCaP细胞可能主要是通过Akt通路影响VEGF和AR等基因而实现.
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BH3-HIV-TAT抗前列腺癌的活性
目的:探讨人工合成的BH3-HIV-TAT肽对前列腺癌细胞株LNCaP增殖的影响.方法:以25、50、1 000μmol/L的BH3-HIV-TAT处理LNCaP细胞12或24 h,以激光共聚焦显微镜观察BH3-HIV-TAT肽的细胞定位;观察经BH3-HIV-TAT肽处理后,LNCap细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化;用流式细胞仪分析不同时间不同浓度的短肽对细胞凋亡程度和周期的影响;以MTS/PMS测定,分析短肽对LNCaP细胞的增殖是否有浓度依赖性的影响.结果:激光共聚焦检测结果显示BH3-HIV-TAT肽主要定位在细胞核内;LNCap细胞经短肽处理后,可观察到分为2期的细胞凋亡过程;流式细胞仪检测结果证实了短肽对细胞凋亡程度和周期的影响;MTS/PMS测定表明该短肽具有浓度依赖性的抗前列腺癌细胞的活性.结论:BH3-HIV-TAT肽可有效地诱导前列腺癌细胞株LNCaP的凋亡,从而影响其增殖,实验结果为癌症靶向性治疗提供了依据.
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前列腺癌细胞激素非依赖性转化过程中microRNA的差异化表达
目的 对比观察雄激素依赖前列腺癌细胞(LNCaP)与雄激素非依赖前列腺癌细胞(LNCaP-AI)中microRNA的表达差异,探讨前列腺癌激素依赖向非依赖转化的转录后调控机制.方法 利用Agilent基因芯片检测LNCaP及LNCaPAI细胞microRNA的表达,用RT-PCR方法对其中6个microRNA进行验证,并对差异表达的microRNA所调控靶基因功能进行生物信息学分析.结果 基因芯片检测发现:与LNCaP相比,LNCaP-AI细胞有27个microRNA表达降低,11个microRNA表达升高.对其中6个microRNA进行RT-PCR验证,结果与基因芯片结果一致.通过检索http://www.mirbase.org/针对microRNA调控的靶基因,并参考已知的与雄激素非依赖相关基因的功能,发现LNCaP细胞转化为激素非依赖的LNCaP-AI细胞过程中,差异表达的microRNA主要调控表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Bcl-2及雄激素相关代谢酶.结论 前列腺癌激素非依赖转化过程中存在microRNA的差异表达,可能涉及雄激素受体(AR)旁路信号通路、金属酶、抗凋亡基因及雄激素相关代谢酶基因等.
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前列腺组织与LNCaP细胞的雄激素受体亚型研究
目的:研究雄激素受体(AR)亚型在人前列腺良性增生与前列腺癌组织以及LNCaP细胞系中的表达,探讨AR亚型表达组织之间的差异. 方法:应用氚标技术与聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳的方法,对相应组织的AR亚型进行分析. 结果:41例AR阳性的前列腺增生组织、3例前列腺癌组织和LNCaP细胞中,发现有3个AR亚型的表达,其等电点(pI)分别在 6.5、 6.0和 5.3.在前列腺增生标本中,15例(36.5%)表达pI 6.5、 6.0、 5.3亚型,10例(24.4%)表达pI 6.5、 5.3亚型,5例(12.2%)表达pI 6.5、 6.0亚型,4例( 9.8%)表达pI 6.0、 5.3亚型,2例( 4.9%)表达pI 6.5亚型,2例( 4.9%)表达pI 6.0亚型,3例( 7.3%)表达pI 5.3亚型.在3例前列腺癌组织中,1例表达pI 6.5、 6.0、 5.3亚型,1例表达pI 6.5、 6.0亚型,1例3种亚型均不表达.LNCaP细胞表达pI 6.5、 6.0、 5.3亚型.氚标的双氢睾酮(DHT)与3种受体亚型的结合,可以被非氚标的DHT、睾酮(T)竞争抑制,而孕酮、雌二醇和己烯雌酚对此却无竞争抑制作用. 结论:AR亚型的表达,在不同的病人与疾病和LNCaP前列腺癌细胞系之间存在差异,提示不同病人对前列腺癌的内分泌疗法有不同的反应性.
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下调基因PTTG1表达对前列腺癌LNCaP-AI细胞增殖、侵袭和凋亡的影响
目的:探讨下调垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)表达对雄激素非依赖性前列腺癌LNCaP-AI细胞增殖、侵袭、凋亡,以及对雄激素拮抗剂敏感性的影响. 方法:LNCaP-AI细胞转染靶向PTTG1基因的siRNA,MTT法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测PTTG1、p-Akt、p-ERK等蛋白表达水平,琼脂糖凝胶电泳法检测PTTG1 mRNA表达水平. 结果:siRNA有效抑制了PTTG1的表达;下调PTTG1表达有效抑制了LNCaP-AI细胞在去雄激素培养液中的增殖,24、48、72 h抑制率分别为(19.47±2.12)％、(24.01±2.13)％、(48.02±2.22)％,组间比较有显著性差异(P＜0.05);降低其侵袭力,Transwell试验显示,对照组、转染24、48、72 h后穿过聚碳酸酯膜细胞个数分别为111.11±13.47、74.67±9.85、56.44±8.66、37.33±6.14,组间比较有显著性差异(P＜0.01);siRNA-PTTG1转染LNCaP-AI细胞后,空白对照组、转染24、48、72 h后凋亡率分别为(2.17±0.49)％、(18.32±0.94)％、(19.94±1.30)％、(21.73±1.88)％,各组间比较有显著性差异(P＜0.05).siRNA联合氟他胺组对LNCaP-A1增殖的抑制作用和促凋亡作用显著强于siRNA或者氟他胺组,并呈氟他胺浓度相关性;50 nmol/L氟他胺、siRNA联合50 nmol/L氟他胺对LNCaP-AI的抑制率分别为(27.13±3.52)％、(67.51±5.13)％,两组间比较有显著性差异(P＜0.05);凋亡率分别为(3.94±0.48)％、(19.93±1.72)％,两组间比较有显著性差异(P＜0.05);100 nmol/L氟他胺、siRNA联合100 nmol/L氟他胺的抑制率分别为(43.72±3.90)％、(73.19±4.78)％,两组间比较有显著性差异(P＜0.05);凋亡率分别为(5.33±0.66)％、(23.43±1.76)％,两组间比较有显著性差异(P＜0.05). 结论:siRNA下调mG1表达能够抑制LNCaP-AI的增殖和侵袭,促进凋亡,提高了LNCaP-AI细胞对雄激素拮抗剂氟他胺的敏感性,抑制mG1表达可能会强化雄激素剥夺治疗晚期前列腺癌的作用.
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垂体肿瘤转化基因1在雄激素非依赖性前列腺癌发生过程中的表达变化
目的:探讨垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)在前列腺癌由激素依赖性转化为激素非依赖性过程中的表达变化. 方法:通过在去雄激素培养条件下长期培养雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP,建立并验证雄激素非依赖性亚系LNCaP-AI细胞模型,用Western印迹、RT-PCR方法每2周检测在去雄激素培养过程中PTTG1的表达改变. 结果:经过3个月培养,成功建立雄激素非依赖性亚系LNCaP-AI细胞模型;在LNCaP细胞中,随着去雄激素培养时间延长,PTTG1的表达水平逐渐升高,基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9表达有同步升高趋势.结论:PTTG1表达在雄激素非依赖性前列腺癌发生过程中逐渐增强,可能是晚期前列腺癌基因治疗的靶标之一.
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环巴胺对人前列腺癌LNCaP细胞增殖和凋亡作用及对PCA3基因表达的影响
目的:探讨环巴胺对人前列腺癌LNCaP细胞增殖和凋亡的作用及对PCA3基因表达的影响. 方法:不同浓度环巴胺(1、5、10、15 μmol/L)干预LNCaP细胞,以只加入RPMI 1640培养液为空白对照组,分别在不同作用时间(24、48、72 h),用MTT法检测其对细胞增殖的抑制、流式细胞术观察细胞凋亡率变化、Hoechst染色观察凋亡细胞形态变化、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)观察对PCA3基因表达的影响. 结果:5、10、15μmol/L环巴胺对LNCaP细胞增殖均有显著抑制作用,与空白对照组相比差异有显著性(P＜0.01),10 μmol/L组于48 h达到半数抑制量(ICS0);10、15 μmol/L组24、48、72 h LNCaP细胞的凋亡率分别为37.21％、57.38％、57.98％和21.16％、71.31％、72.90％,与空白对照组相比差异均有显著性(P＜0.01).随着环巴胺浓度增大和作用时间的延长,LNCaP细胞凋亡显著增加.PCA3基因的表达随着环巴胺浓度的上升呈现明显的递减趋势,较空白对照组显著降低(P＜0.01).浓度为10 μmol/L时,不同作用时间PCA3基因的表达均极低. 结论:环巴胺浓度为10、15 μmol/L作用48、72 h时能够明显抑制LNCaP细胞的增殖,诱导细胞凋亡,并显著下调LNCaP细胞PCA3基因的表达.
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硼替佐米增强前列腺癌细胞对NK细胞介导细胞杀伤作用的敏感性
目的:探讨硼替佐米是否能够增强前列腺癌细胞对NK细胞介导杀伤作用的敏感性,以及是否在不同类型的人前列腺癌细胞系中有相似的作用. 方法:以激素依赖性的前列腺癌细胞株LNCaP和激素非依赖性的前列腺癌细胞株DU145为模型,不同浓度(0、5、10、15、20、25 nmol/L)硼替佐米处理细胞后,CCK-8法检测肿瘤细胞的增殖,Annexin V/PI法检测细胞凋亡率. 结果:15、20、25 nmol/L硼替佐米处理DU145细胞48、72 h后,各处理组细胞的增殖率分别为(82.79±2.04)％、(73.59±2.95)％、(74.16±6.16)％和(71.24±5.30)％、(51.20±2.91)％、(38.02±2.67)％,同样处理LNCaP细胞后,各处理组细胞的增殖率分别为(77.04±7.74)％、(42.61±6.62)％、(23.85±6.04)％和(36.45±7.02)％、(14.94±5.76)％、(11.65±5.87)％.与对照组相比,硼替佐米强烈抑制两种细胞系的增殖(P＜0.05).15、20、25 nmol/L硼替佐米处理DU145细胞24h后,DU145细胞的凋亡率分别为(14.41±1.32)％、(16.13±1.55)％、(14.48±1.42)％,而在lNCaP细胞,20、25 nmol/L硼替佐米处理24h后,凋亡率为(12.77±1.28)％和(14.84±1.65)％,与对照组相比有统计学差异(P＜0.05),DU145细胞对硼替佐米诱导的凋亡作用较LNCaP细胞更加敏感.但是,在短期分析中硼替佐米不能致敏两种细胞系对NK细胞介导的杀伤作用.在长效分析中,用硼替佐米处理肿瘤细胞后,20 nmol/L硼替佐米±NK组诱导的DU145细胞和LNCaP细胞凋亡率分别为(41.83±5.06)％和(30.31±3.62)％,较单独应用硼替佐米或者NK细胞更高(P＜0.05).结论:硼替佐米能够应用于致敏前列腺癌细胞对NK细胞介导的杀伤作用的敏感性,提高当前前列腺癌的治疗水平.而且此治疗策略对雄激素非依赖性的前列腺癌患者更有效.
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5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人前列腺癌裸鼠移植瘤生长及雄激素受体表达影响的研究
目的 探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,5-Aza-CdR)对LNCaP荷瘤裸鼠的肿瘤生长及雄激素受体(androgen receptor,AR)表达的影响.方法 裸鼠皮下接种LNCaP细胞,建立人前列腺癌裸鼠移植瘤模型,待肿瘤长至300 mm3大小时,荷瘤裸鼠腹腔内注射5-Aza-CdR,0.25 mg/kg,隔天1次.对照组给予生理盐水注射.每3天测量肿瘤体积1次,共观察24 天.实验结束时处死裸鼠,取出肿块称重后,肿瘤组织抽提RNA和蛋白质,分别应用实时定量PCR和western blot方法,检测AR在mRNA和蛋白质水平上的表达.结果 LNCaP荷瘤裸鼠经5-Aza-CdR治疗后,与对照组相比,肿瘤生长缓慢.第24天观察结束时,5-Aza-CdR处理组肿瘤体积[(982±83)mm3]显著低于对照组[(1 867±195) mm3](P＜0.01).移植瘤重量与对照组相比明显下降[(796±178)mg vs(1 267±252) mg],抑瘤率为37.2%,差异有统计学意义(P＜0.01).5-Aza-CdR组游离PSA(FPSA)浓度相对对照组显著下降,分别为(40.25±13.3)ng/mL和(79.7±13.2)ng/mL,差异有统计学意义(P＜0.01).荷瘤裸鼠经5-Aza-CdR处理后,AR在mRNA水平上的表达下降为对照组的0.5倍,在蛋白质水平上的表达也显著降低(P＜0.01).结论 5-Aza-CdR能够有效抑制LNCaP荷瘤裸鼠移植瘤的生长,并显著降低AR基因表达,为前列腺癌的去甲基化治疗提供了理论依据.
关键词： 前列腺癌 雄激素受体 LNCaP细胞 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 -
人同源盒基因Nkx3.1启动子的克隆及活性测定
目的:克隆Nkx3.1基因5'上游1.06kb片段,构建pGL3L3-1.06kb载体,测定其启动子活性.方法:采用PCR方法从人基因组DNA中扩增Nkx3.1基因5'上游1.06kb片段并构建到荧光素酶报道基因pGL2-basic载体中,与内参照质粒pRL-Tk共转染前列腺癌LNCaP细胞,通过双荧光素酶活性检验测定其启动子活性.结果:PCR扩增的1.06kb片段经测序正确无误;pGL3-1.06kb转染LNCaP细胞48 h后,双荧光素酶活性测定M1/M2=2.7,为pGL3-control活性的1.5倍,为pGL3-basic活性的50倍.结论:克隆的人Nkx3.1基因5'上游1.06kb片段具有较强的启动子活性.
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Notch信号报告系统在前列腺肿瘤细胞系中的建立
目的 在前列腺肿瘤细胞系LNCaP中建立Notch信号报告系统.方法 采用In-Fusion酶系统将巨细胞病毒(CMV)启动子和Notch蛋白胞内结构域(ICD)细胞核内DNA结合蛋白CSL的8拷贝串联DNA序列克隆入pLVX-acGFP-N1慢病毒载体,构建Notch信号报告重组慢病毒表达质粒(pLVX-8XCSL-acGFP).在人胚肾293T细胞中转染pLVX-8XCSL-acGFP质粒或对照质粒pLVX-acGFP,6h后再转染Notch受体的细胞内结构域(NICD)的表达质粒pETP-NICD(过表达NICD)或对照质粒pETP.转染48 h后用荧光显微镜观察GFP的表达,用流式细胞仪进行荧光定量分析.然后将pLVX-8XCSL-acGFP质粒及对照质粒包装成慢病毒转导前列腺癌细胞系LNCaP,72 h后荧光显微镜观察绿色荧光,用流式细胞仪分选出GFP荧光强度强5％及弱5％的细胞.提取这两部分细胞的RNA,采用qRT-PCR方法检测细胞中Notch1、Notch2以及Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达.结果 在转染pLVX-8XCSL-acGFP的293T细胞中,转染pETP-NICD的细胞荧光强度较转染pETP对照质粒的细胞增加了约10倍;而在转染pLVX-acGFP的293T细胞中,转染pETP-NICD的细胞与转染pETP对照质粒的细胞荧光强度无明显差异.根据pLVX-8XCSL-acGFP荧光强度分选出的LNCaP细胞,荧光强度高的细胞Notch1、Notch2、Hey1表达高于荧光强度弱的细胞(P均＜0.05).结论 在LNCaP细胞中pLVX-8XCSL-acGFP可以作为报告Notch信号水平的有效工具.
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萝卜硫素对 LNCaP 细胞增殖、周期、凋亡及 IGFBP-3、NF-κB表达的影响
目的：观察萝卜硫素（ SFN）对人前列腺癌LNCaP细胞增殖、周期及凋亡的影响以及IGFBP-3及NF-κB在此过程中的变化。方法：观察不同浓度SFN对LNCaP细胞增殖的影响后将LNCaP细胞分为4组：对照组、SFN处理组、IGFBP-3 siRNA＋SFN处理组以及IGFBP-3 siRNA处理组。 MTT法分析各组细胞的增殖情况；流式细胞技术分析各组细胞的细胞周期及凋亡。实时荧光定量PCR技术和Western blot 技术分析各组细胞IGFBP-3、NF-κB mRNA和蛋白表达的变化。结果：随SFN浓度的升高，LNCaP细胞存活率呈下降趋势（F＝1391．781， P＜0．001）。IGFBP-3抑制能有效减弱SFN诱导的细胞增殖抑制、G2期抑制与凋亡（F交互＝271．130、121．133和95．000， P＜0．05）。 IGFBP-3抑制可降低SFN处理后IGFBP-3 mRNA和蛋白表达的升高，升高SFN处理后NF-κB mRNA和蛋白表达的降低（F交互＝8．595和279．490，P＜0．05）。结论：SFN对LNCaP细胞的抑制作用可能与IGFBP-3有关，后者可能通过改变NF-κB的表达来发挥作用。
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苦参碱对雄激素依赖性前列腺癌细胞的影响
目的:探讨苦参碱(Matrine)对雄激素依赖性前列腺癌细胞株(LNCaP)凋亡及前列腺特异抗原(prostate specific antigen,PSA)表达的影响.方法:分别用0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L浓度的苦参碱作用于LNCaP细胞12 h、24 h、36 h后MTT法检测细胞生长活性;24 h后流式细胞仪测定细胞凋亡的变化;24 h后Western印迹法检测细胞内Bcl-2和Bax的表达;12 h、24 h、36 h后化学发光法检测LNCaP细胞培养液中PSA的变化.结果:苦参碱能抑制LNCaP细胞的生长,呈剂量与时间依赖性,不同浓度苦参碱组之间与不同作用时间组之间的差异均有统计学意义(P(0.05).苦参碱诱导LNCaP细胞凋亡,各浓度组凋亡细胞比例均显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);LNCaP细胞内Bcl-2含量呈浓度依赖性下降,Bax含量呈浓度依赖性升高(P＜0.01);LNCaP细胞培养液中PSA的表达显著下降(P均d0.05).结论:苦参碱能显著抑制LNCaP细胞的体外生长,诱导其凋亡,并抑制PSA的表达.
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小干扰RNA对LNcap细胞CXCR4基因表达的影响
目的:研究小于扰RNA(siRNA)对LNcap细胞中CXC趋化因子4(CXCR4)基因表达的影响.方法:用针对CXCR4基因的siRNA表达质粒pSilencer-CXCR4转染人前列腺癌细胞株LNcap细胞,用RT-PCR方法检测其CXCR4基因表达水平的变化.结果:重组体pSilencer-CXCR4转染LNcap细胞后,能明显抑制CXCR4基因的表达;转染48 h后,其表达水平下降75%,与空白对照组和阴性对照组比较,其差异有统计学意义(P＜0.01).结论:利用RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为下一步有关CXCR4的研究奠定一定的基础.
