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三阴性乳腺癌中上皮-间充质转化相关标记分子的研究
目的 检测乳腺癌细胞中上皮-间充质转化(EMT)相关分子标志物如钙黏蛋白、波形蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板源生长因子(PDGF)-D和核因子-κB(NF-κB),讨论它们与EMT之间的关系以及在乳腺癌进展中的作用.方法 应用免疫组织化学方法检测57例浸润性导管腺癌患者钙黏蛋白、波形蛋白、EGFR、NF-κB和PDGF-D的表达.患者分为3组:A[雌激素受体(ER)+和/或孕激素受体(PR)+,人类表皮生长因子受体-2(Her-2)/neu ˉ]、B(ER+和/或PR+,Her-2/neu+)、C(三阴性:ERˉ、PRˉ、Her-2/neu ˉ).免疫组织化学镜下阅片记录染色强度(0、+、++和+++)和阳性细胞百分比,并将数据进行统计分析.结果 膜钙黏蛋白在所有57例中均表现为阳性(100％),然而,与A组比较,胞质钙黏蛋白在B组和C组有表达(B组:21％,C组:7％,A组:0％).所有A组病例波形蛋白和EGFR均为阴性.三阴性乳腺癌病例中波形蛋白、EGFR和NF-κB的表达上调,与A组和B组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 波形蛋白、EGFR和NF-κB在三阴性乳腺癌中表达明显上调,与这一类型肿瘤细胞的高侵袭特性一致.
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胰腺癌组织中糖原合成激酶-3β的表达及其与上皮-间充质转化的相关性
目的 探讨糖原合成激酶-3β(GSK-3β)在胰腺癌组织中的表达及其与上皮-间充质转化的相关性.方法 选取胰腺癌病例标本60例,35例有配对的癌旁正常组织,行GSK-3β、丝氨酸-9、酪氨酸-216、Snail和E-钙黏蛋白(E-cadherin)免疫组织化学及Western blot检测,分析GSK-3β与胰腺癌临床病理特征和上皮-间充质转化相关分子之间的相关性.结果 GSK-3β在胰腺癌中阳性率为65.0％,显著高于癌旁组织(22.8％),GSK-3β表达与胰腺癌临床分期、分级、分化程度以及淋巴结转移呈正相关,而与患者年龄、性别和肿瘤大小无相关.丝氨酸-9在癌旁组织表达水平高于胰腺癌组织,而酪氨酸-216和Snail表达与之相反,E-cadherin在胰腺癌及癌旁组织表达水平均较低.Pearson相关分析发现,GSK-3β与上述指标均显著相关.结论 GSK-3β在胰腺癌组织中表达显著高于癌旁组织,与胰腺癌临床分期、肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移之间呈正相关,而与患者年龄、性别及肿瘤大小无相关.此外,GSK-3β还与胰腺癌上皮-间充质转化具有密切关系.
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乳腺浸润性导管癌组织中转录因子Twist和缺氧诱导因子-1α表达与上皮-间充质转化的关系
目的 探讨转录因子Twist、缺氧诱导因子(HIF)-1α在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及其与上皮-间充质转化的关系.方法 采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法检测90例乳腺浸润性导管癌组织及其对应癌旁组织标本中Twist、HIF-1α、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及波形蛋白(Vimentin)的表达.结果 在乳腺癌组织中Twist、HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的阳性率分别为73.3％、68.9％、15.6％和64.4％,癌旁组织中的阳性率分别为7.8％、8.9％、75.6％和34.4％.该4种蛋白在肿瘤组织中的表达率与癌旁组织之间差异均有统计学意义(P＜0.05).Twist与HIF-1α的表达均与组织学分级和腋窝淋巴结转移有关(P＜0.05).Twist与HIF-1α的表达呈正相关(P＜0.05).Twist、HIF-1α的表达也均与E-cadherin的低表达和Vimentin的高表达密切相关(P＜0.05).结论 Twist、HIF-1α和Vimentin在乳腺癌组织中呈高表达,而E-cadherin呈低表达.HIF-1α可能通过上调Twist表达,促进上皮-间充质转化发生,成为乳腺癌浸润转移的途径之一.
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肿瘤发展过程中间充质-上皮转化的研究进展
间充质-上皮转化(MET)与其相反过程上皮-间充质转化(EMT)共同参与细胞可塑性的调节,使其保持相对平衡,并且在胚胎发生和肿瘤进展等方面起至关重要的作用.肿瘤发展过程中的MET与肿瘤转移灶的形成密不可分,这其中涉及众多与MET相关的分子蛋白、细胞间的相互作用、肿瘤干细胞以及肿瘤微环境等方面的内容.我们从与MET相关的细胞表型、分子蛋白、肿瘤干细胞以及肿瘤微环境等方面进行深入探讨,综合MET在肿瘤发生过程中的新研究进展,将对寻求关键靶点来抑制肿瘤细胞的运动与转移能力和实施有效的治疗方案起到重要的理论指导意义.
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微小RNA-497对膀胱癌上皮-间充质转化过程的影响
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-497在膀胱癌细胞株中的表达,探讨miR-497对膀胱癌上皮-间充质转化(EMT)过程的影响.方法 采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-497在膀胱细胞株和正常膀胱黏膜组织中的表达.将miR-497 mimics/inhibitor分别瞬时转染至膀胱癌EJ细胞中,通过显微镜细胞形态学观察、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验,分析过表达或下调内源性miR-497的表达对EJ细胞形态、迁移和侵袭的影响;Western blot法检测EMT标志物相关蛋白表达的变化.结果 与膀胱永生化上皮细胞(SV-HUC-1),miR-497在5株膀胱癌细胞株中均呈低表达状态(P =0.000).过表达miR-497后,EJ细胞表现为上皮样细胞形态,EJ细胞的迁移率为(25.33 ±6.11)％,较其阴性对照组(74.00±3.61)％降低2.96倍,侵袭细胞个数为(109 ±3)个,较其阴性对照组[(219±17)个]降低2倍;而抑制miR-497表达后,EJ细胞表现为间质样细胞形态,EJ细胞的迁移率为(74.00±3.61)％,较其阴性对照组[(51.33±6.51)％]增加1.45倍,侵袭细胞个数为(320±14)个,较其阴性对照组[(248±16)个]增加1.29倍.Westem blot结果显示:与阴性对照组比较,过表达miR-497可使EJ细胞的E-钙黏素(E-cadherin)表达增加(P =0.000),N-钙黏素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)表达减少(P=0.001,P=0.000).结论 miR-497可能参与膀胱癌EMT过程的调节.
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丙酮酸激酶M2亚型在肾癌迁移侵袭中的作用及其机制
目的 探讨敲低丙酮酸激酶M2亚型(PKM2)对肾癌细胞株ACHN迁移侵袭的影响及其机制.方法 构建靶向PKM2基因的pLV载体,筛选稳定转染的细胞株.采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测敲低PKM2对ACHN细胞增殖的影响.在Transwell小室的上室和下室之间不放置基质胶测定细胞的迁移能力,在Transwell小室的上室和下室之放置基质胶测定细胞的侵袭能力.通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot的方法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的变化.结果 CCK-8实验结果显示敲低PKM2抑制了ACHN的增殖.对照组的葡萄糖消耗率和乳酸生成率分别为(3.493 ±0.179)和(3.553±0.185) nmol/106 cells/min,而shPKM2组的葡萄糖消耗率和乳酸生成率分别为(1.457 ±0.081)和(5.820±0.352) nmol/106 cells/min(P =0.001,P=0.005).Transwell迁移实验结果显示shPKM2组和对照组到达下室的细胞数分别为(62±6)个和(39±5)个(P=0.001).Transwell侵袭实验结果显示shPKM2组和对照组到达下室的细胞数分别为(40±7)个和(26±6)个(P =0.009).通过Western blot和RT-qPCR检测shPKM2组中E-cadherin蛋白和mRNA的相对表达量分别为1.560±0.110和2.534±0.342,而对照组中E-cadherin蛋白和mRNA的相对表达量分别为0.833 ±0.070和1.312±0.284(P =0.001,P =0.009),shPKM2组中Vimentin蛋白和mRNA的相对表达量分别为0.340 ±0.110和1.631±0.123,而对照组中Vimentin蛋白和mRNA的相对表达量为0.653±0.100和3.530 ±0.511(P=0.022,P=0.003).结论 敲低PKM2表达显著抑制了肾癌细胞的有氧糖酵解、增殖、迁移和侵袭能力,并影响了上皮-间充质转化(EMT)过程.
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沉默畸胎瘤衍生生长因子-1基因表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响
目的 探讨小干扰RNA(siRNA)沉默畸胎瘤衍生生长因子-1(TDGF-1)基因对人前列腺癌细胞PC3迁移的影响及机制.方法 通过Silintfect分别将阴性对照siRNA、TDGF-1 siRNA转染到PC3细胞,空白(Blank)组无需特殊处理.分别纯化各组所提取的总RNA和蛋白;运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测TDGF-1 mRNA和蛋白表达变化、Western blot法测上皮-间充质转化(EMT)相关标志物蛋白:波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达变化.Transwell观察细胞迁移能力的变化.结果 与阴性对照(0.988±0.011)、空白组(1.000±0.000)比较,实验干扰组(0.250±0.046)的TDGF-1 mRNA相对表达量明显降低(P =0.007,P=0.006).干扰组的TDGF-1、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达量较阴性对照、空白组明显降低,E-cadherin蛋白则显著升高.Transwell实验结果示实验组[(84.667±7.572)个]细胞的迁移能力较空白组[(174.333±10.017)个]、阴性对照组[(168.333±4.041)个]明显减弱(P =0.022,P=0.025).结论 下调TDGF-1基因的表达能够减弱细胞的迁移能力,其机制可能与EMT有关.
关键词： 畸胎瘤衍生生长因子-1 前列腺癌 小干扰RNA 上皮-间充质转化 迁移 -
转化生长因子-β1抑制人肾小管上皮细胞株HK-2中N-Myc下游调节基因2表达及意义
目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)对人肾小管上皮细胞株HK-2中N-myc下游调节基因2(NDRG2)表达的影响.方法 按照是否孵育TGF-β1分别设置对照组和实验组,取两组细胞分别提取蛋白及RNA行Western blot及实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR),检验两组上皮细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)和Snail蛋白的表达差异.然后根据孵育TGF-β1的不同浓度梯度设置不同组别,分别取各组细胞提取蛋白及RNA行Western blot及RT-qPCR以检验NDRG2在TGF-β1作用后的人肾小管上皮细胞(HK-2)中的表达.结果 结果表明对照组和实验组在蛋白水平相关表达量分别为E-cadherin(1.0±0.2比0.3±0.2)(t=4.850,P=0.008),α-SMA(1.0±0.1比2.6±0.4)(t=6.721,P=0.003),Vimentin(1.0±0.1比2.6±0.4)(t=6.721,P=0.003),Snail(1.0±0.1比2.5±0.2)(t=11.620,P=0.000),以上标志物两组之间差异均有统计学意义.对照组和实验组在mRNA水平相关表达量分别为E-cadherin(1.0±0.2比0.2±0.1)(t=7.686,P=0.002),α-SMA(1.0±0.3比2.4±0.3)(t=5.715,P=0.005),Vimentin(1.1±0.2比2.6±0.5) (t=4.977,P=0.008),Snail(0.9±0.2比1.9 ±0.2)(t=6.124,P=0.004),以上标志物两组之间差异均有统计学意义.同时在TGF-β1孵育后,HK-2细胞中NDRG2在蛋白和RNA水平都明显下调,各组在蛋白水平相关表达量分别为1.00±0.04比0.80±0.03比0.50±0.05比0.30±0.03比0.20±0.02(P =0.019),在mRNA水平相关表达量分别为1.00±0.05比0.70±0.03比0.50±0.04比0.30±0.02比0.20±0.05(P=0.021).尤其当孵育TGF-β1浓度大于10 ng/ml时这种作用为显著,各组表达水平之间差异有统计学意义.结论 TGF-β1可以促进HK-2细胞中上皮-间充质转化(EMT)过程,同时TGF-β1可以下调HK-2细胞中NDRG2在蛋白和RNA水平的表达量.
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血管活性肠肽对前列腺癌DU145细胞迁移侵袭及上皮-间充质转化的影响
目的 观察血管活性肠肽(VlP)对前列腺癌(DU145)细胞迁移、侵袭的影响并探讨其在上皮-间充质转化(EMT)过程中机制.方法 用浓度分别为0、25、50、100 μmol/L的VIP处理DU145细胞,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测24h时DU145细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snail mRNA和蛋白的表达;采用划痕实验和Transwell迁移、侵袭实验检测48 h时DU145细胞运动、迁移、侵袭能力变化.结果 随着VIP浓度的增加,在2Ah时,细胞中E-cadherin、Vimentin、Snail mRNA表达增加(0.897±0.053、0.715±0.041、0.521±0.036、0.343±0.029;0.586±0.061、0.827±0.089、1.329±0.107、1.764±0.135;0.645±0.055、0.917±0.074、1.383±0.097、1.725±0.124),差异有统计学意义(P＜0.05);在48 h,划痕实验显示DU145运动能力逐渐增加,Transwell迁移、侵袭实验显示穿越小室的细胞个数也增多[(76.7±5.8)、(104.5±6.7)、(128.3 ±10.4)、(147.7±12.6)个;(84.2±6.4)、(118.3±10.3)、(142.1±13.7)、(173.6±15.4)个],差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 VIP可通过EMT促使前列腺癌DU145细胞运动、迁移及侵袭能力增加.
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Krüppel样因子17抑制肾癌786-0细胞迁移和侵袭及机制
目的 探讨Krüppel样因子17(KLF17)是否通过调控上皮-间充质转化(EMT)抑制786-0细胞的迁移侵袭能力.方法 设计并合成特异性小干扰RNA(siRNA)下调肾癌细胞株786-0中KLF17的表达,并利用划痕实验及Transwell实验检测其迁移侵袭能力的变化,通过Western blot检测EMT相关分子表达水平变化.结果 siRNA能有效下调肾癌786-0细胞株中KLF17的蛋白及mRNA的表达量.细胞划痕实验结果显示下调KLF17表达后,细胞迁移能力增强(P＜0.01);Transwell实验中阴性对照组穿膜细胞数为(18.16±2.21)个,而siRNA1组为(29.03 ±2.48)个(P＜0.01),siRNA2组为(28.93 ±3.00)个(P＜0.01).KLF17-siRNA介导的基因沉默下凋了上皮细胞表面标记E-钙黏蛋白(E-cadherin)、β-连环蛋白(β-catenin)的表达,上调了间充质干细胞表面标记N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达.结论 KLF17可通过调节EMT的进程影响肾癌细胞的迁移侵袭能力.
关键词： 肾癌 Krüppel样因子17 迁移 侵袭 上皮-间充质转化 -
膀胱移行上皮癌临床进展与微小RNA-107调节脂质代谢的关系
目的 探讨碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)、脂肪酸合酶(FASN)与膀胱移行上皮癌(BTCC)临床病理特征之间的关系,分析其与微小RNA(miRNA,miR)-107、Snail1的表达相关性.方法 选用膀胱移行细胞癌手术切除标本48例,每例标本均选用癌组织、癌旁组织以及远端正常黏膜作为对照.采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测切除标本中的miR-107、Snail1、ChREBP、FASN的表达,并分析与各临床病理特征之间的关系.结果 (1)ChREBP、FASN在BTCC组织中的表达明显高于正常黏膜组织(12.278±4.035比8.442±7.658,13.536 ±4.776比9.183±6.112,P＜0.05),其在高级别尿路上皮癌中的表达高于乳头状瘤,与肿瘤分化程度有关(14.963±5.367比10.738±5.332,14.558±7.728比9.738±5.332,P＜0.05),与肿瘤浸润深度、淋巴结转移无明显相关(P＞0.05).(2) miR-107与ChREBP、FASN在BTCC中表达呈正相关,癌旁组织中miR-107、Snail1与ChREBP、FASN表达呈负相关(67.5％比32.4％,73.0％比27.0％,P＜0.05).结论 ChREBP、FASN与膀胱移行上皮癌病理分级相关,miR-107可能通过调控ChREBP、FASN通路,改变肿瘤细胞内传统代谢通路,促进膀胱癌进展.
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上调人滋养层细胞表面抗原-2基因对人前列腺癌细胞迁移、侵袭及上皮-间充质转化的影响
目的 观察过表达人滋养层细胞表面抗原-2(TROP-2)基因对人前列腺癌细胞的迁移和侵袭及上皮-间充质转化的影响.方法 将TROP-2基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1,构建TROP-2基因过表达真核表达质粒.PC-3细胞分为3组:空白对照组、空载对照组和TROP-2过表达组.转染PC-3细胞后,采用Western blot法观察TROP-2蛋白表达,采用Transwell方法检测癌细胞迁移和侵袭能力,采用Western blot法检测癌细胞E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白表达.结果 成功构建TROP-2基因真核表达质粒.与空白对照组和空载对照组比较,TROP-2过表达组TROP-2蛋白明显升高.Transwell迁移实验结果显示,空白对照组、空载对照组和TROP-2过表达迁移细胞数分别为(132.6±2.2)、(130.8±1.8)和(189.6±2.6)个.与空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);Transwell侵袭试验显示,空白对照组、空载对照组和TROP-2过表达迁移细胞数分别为(118.16±1.96)、(117.52±1.85)和(166.38±1.65)个.与空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).Western blot结果显示,与空白对照组比较,TROP-2过表达细胞组E-钙黏蛋白表达降低,而N-钙黏蛋白表达增高.结论 TROP-2过表达可促进入前列腺癌细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与促进上皮-间充质转化有关.
关键词： 滋养层细胞表面抗原-2 前列腺癌 侵袭 上皮-间充质转化 -
下调高迁移率族蛋白A2表达对前列腺癌细胞迁移侵袭能力的影响
目的 观察小干扰RNA(siRNA)靶向下调高迁移率族蛋白A2(HMGA2)基因表达对人雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞迁移、侵袭能力的影响.方法 人前列腺癌PC3细胞培养后分为3组:小干扰(siRNA)组、阴性对照(NC)组通过LipofectaminTM2000分别将HMGA2 siRNA、阴性对照siRNA转染到细胞,空白组(Blank)常规培养;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Westernblot法分别检测HMGA2 mRNA和蛋白的表达;Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力的变化;Westem blot法检测转染后上皮-间充质转化(EMT)相关标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达变化.结果 siRNA组HMGA2 mRNA的相对表达量(0.561±0.087)较Blank组(0.932±0.037)、NC组(0.892±0.035)显著下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).siRNA组HMGA2、N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平较Blank组、NC组明显降低,siRNA组E-cadherin蛋白表达水平较后两组显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).Transwell实验结果表明,siRNA组细胞的迁移和侵袭能力较后两组明显减弱(P＜0.05).结论 下调HMGA2的表达能够抑制前列腺癌PC3细胞的HMGA2基因mRNA及蛋白的表达,并能降低细胞迁移及侵袭能力,其作用机制可能是通过影响EMT实现的.
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钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ对前列腺癌PC3细胞增殖、侵袭及上皮-间充质转化的影响
目的 观察钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)活化的抑制对人前列腺癌PC3细胞增殖、侵袭能力及上皮-间充质转化(EMT)相关信号通路的影响.方法 通过CaMKⅡ特异性抑制剂KN93处理PC3细胞,抑制其活化后,采用噻唑蓝(MTT)法检测PC3细胞增殖抑制率,Transwell小室法检测PC3细胞侵袭能力,Western blot测定PC3细胞中磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)、核因子-κB(NF-κB)、锌指转录因子(Snail)、Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的表达.结果 不同浓度KN93处理PC3细胞24 h后,5、10、20 μmol/L药物组p-CaMKⅡ蛋白表达(0.453 ±0.070、0.368±0.076、0.308±0.011)较对照组(0.596±0.028)显著减少(P＜0.05),40 μmol/L药物组未见明显蛋白表达.各药物组24 h增殖抑制率分别为(6.88±1.79)％、(12.92 ±2.74)％、(17.88±2.86)％、(31.23 ±4.24)％;48 h增殖抑制分别为(16.53±2.45)％、(29.02±1.74)％、(40.52±1.98)％、(52.26±3.51)％.Transwell小室培养48 h后,对照组和各药物组穿膜细胞数分别为(149±17)、(97±7)、(59±9)、(51±7)、(24±3)个/高倍视野,各药物组穿膜细胞数均明显减少(P＜0.01).Western blot结果示,对照组和各药物组NF-κB p65蛋白的相对表达量差异无统计学意义(P＞0.05),而各药物组p-NF-κB p65蛋白的相对表达量(0.483±0.052、0.490±0.064、0.432±0.057、0.341 ±0.008)较对照组(0.597±0.020)明显降低(P＜0.05).与对照组(0.716±0.046)比较,5、10 μmol/L药物组Snail蛋白的相对表达量(0.337±0.058、0.137±0.045)显著降低(P＜0.01),20、40 μmol/L药物组甚至未见明显蛋白表达.而药物组RKIP蛋白的相对表达量(0.720 ±0.003、0.732±0.008、0.991±0.025、1.116±0.020)显著高于对照组(0.372±0.010,P＜0.01).结论 CaMKⅡ可能为EMT相关信号通路NF-κB/Snail/RKIP的上游分子,抑制CaMKⅡ的活化,能降低前列腺癌PC3细胞的增殖、侵袭能力并可能逆转EMT过程.
关键词： 前列腺癌 钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ 增殖 侵袭 上皮-间充质转化 -
基质交联分子1对前列腺癌DU145细胞迁移侵袭及上皮-间充质转化的影响
目的 观察基质交联分子1(STIM1)对前列腺癌DU145细胞迁移、侵袭的影响并探讨其在上皮-间充质转化(EMT)过程中的作用.方法 将携带STIM1基因的小干扰RNA(siRNA)慢病毒载体STIM1-pGCSIL-GFP转染人激素非依赖性前列腺癌DU145细胞(KD组),同时设阴性对照组(NC组)及空白对照组(CON组).逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot验证抑制STIM1表达的有效性.采用划痕实验及Transwell迁移、侵袭实验检测抑制STIM1对肿瘤细胞运动及迁移、侵袭能力的影响.采用半定量RT-PCR及Western blot分别在mRNA及蛋白水平检测EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波动蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在各组细胞中的差异.结果 与对照组比较,转染STIM1-pGCSIL-GFP后,DU145细胞内STIM1的mRNA及蛋白水平均明显降低.划痕实验显示KD组DU145细胞的运动能力明显降低.细胞迁移结果显示,CON、NC、KD组每个视野细胞数分别为(92.0±14.2)、(87.3±2.3)、(60.8±10.3)个,KD组数目明显减少(P＜0.05);细胞侵袭实验提示,CON、NC、KD组每视野细胞数分别为(79.6±3.7)、(80.0±3.5)、(45.8±5.8)个,KD组侵袭数目明显减少(P＜0.05).RT-PCR和Western blot结果显示,KD组上皮标志物E-cadherin mRNA及蛋白表达水平增高(分别为NC组的1.38、1.72倍);间质标志物Vimentin的mRNA及蛋白表达水平降低(分别为NC组的0.67、0.74倍),α-SMA mRNA及蛋白表达水平降低(分别为NC组的0.23、0.54倍,P＜0.05).结论 抑制前列腺癌DU145细胞中STIM1表达后,细胞运动及迁移、侵袭能力均明显降低,这可能与逆转EMT相关.
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柚皮素对高侵袭性人肝癌细胞株MHCC97-H凋亡与上皮-间充质转化能力的影响及其机制
目的 探讨柚皮素(Nar)对高侵袭性人肝癌细胞株MHCC97-H凋亡及上皮-间充质转化(EMT)的影响及其分子机制.方法 常规培养高侵袭性人肝癌细胞株MHCC97-H.噻唑蓝(MTT)法检测0、40、80、160、320 μmol/L的Nar干预对细胞活性的影响.流式细胞术(FCM)检测Nar对MHCC97-H细胞凋亡率的影响.划痕实验及Transwell小室实验检测Nar对细胞EMT能力的影响.实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot方法检测Nar干预前后相关基因的表达变化.结果 MTT结果显示,Nar作用后,MHCC97-H细胞活性明显降低,0、40、80、160、320 μmol/L的Nar作用24 h后细胞的活性分别为(96.49±13.28)％、(73.65±8.93)％、(60.75±15.75)％、(37.31±7.77)％、(33.20±10.00)％ (F =31.028,P=0.000).FCM结果显示,与对照组比较,Nar作用后,MHCC97-H细胞的凋亡率明显升高(t=8.368,P=0.000).与对照组比较,Nar作用后MHCC97-H细胞的迁移、侵袭能力下降(t=2.964,P=0.014;t=8.899,P=0.000).RT-qPCR和Western blot结果显示,与对照组比较,Nar作用后MHCC97-H细胞凋亡及细胞外基质相关基因和蛋白发生改变.结论 Nar具有促进肝癌细胞凋亡、抑制细胞EMT的能力.
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黑色素瘤分化相关基因-7逆转上皮-间充质转化抑制肝癌细胞的侵袭转移机制
目的 观察黑色素瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24(MDA-7/IL-24)基因对肝癌细胞株MHCC97-H侵袭转移及上皮-间充质转化(EMT)特性的影响.方法 构建携带MDA-7/IL-24基因的腺病毒载体,转染肝癌细胞株MHCC97-H,噻唑蓝(MTT)、免疫荧光检测转染效率.采用Transwell侵袭实验和迁移实验分别检测未转染细胞(空白对照组)、转染阴性对照组(Ad.vec组)和实验组(转染Ad.MDA-7细胞组)侵袭转移能力.镜下观察转染前后细胞形态的变化,免疫荧光检测转染前后细胞上皮表型蛋白和间质表型蛋白的定位和表达,实时定量聚合酶链反应(Real-timePCR)检测转染后细胞MDA-7/IL-24基因的表达,Western blot检测E-钙黏蛋白(E-cad)、N-钙黏蛋白(N-cad)、波形蛋白(Vim)蛋白的表达.结果 MDA-7/IL-24可以有效转染肝癌细胞株MHCC97-H,稳定表达MDA-7/IL-24 mRNA(空白组:2.042±0.915比Ad.MDA-7组:37.512±2.354,P＜0.05)和蛋白.转染MDA-7/IL-24的肝癌细胞株MHCC97-H较空白对照组和阴性对照组侵袭迁移能力明显受到抑制(实验组迁移率:空白组迁移率=1.00：0.46,实验组侵袭率:空白组侵袭率=1.00：0.61,P＜0.01).镜下观察肝癌细胞株MHCC97-H转染MDA-7/IL-24后,由成纤维细胞纺锤体样、排列分散,转变为细胞排列紧密如圆形或椭圆形铺路石样.免疫荧光可见肝癌细胞株MHCC97-H转染后细胞膜表达的E-cad荧光由胞质转移至细胞周边浓聚,而Vim的荧光强度较前下降.Western blot进行蛋白定量分析,转染后MHCC97-H细胞上皮表型标志性蛋白E-cad表达量增高,间质表型标志性蛋白Twist、Vim表达降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 再表达MDA-7/IL-24基因的MHCC97-H细胞可以增加上皮表型蛋白表达,减少间质表型蛋白,改变细胞骨架构型,逆转肝癌细胞EMT过程,使肿瘤细胞侵袭能力减弱.
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生长抑素受体-2基因逆转上皮-间充质转化抑制肝癌细胞侵袭转移机制的研究
目的 观察生长抑素受体-2(SSTR2)基因对肝癌细胞株MHCC-97H侵袭转移及上皮-间充质转化(EMT)特性的影响.方法 构建慢病毒3FLAG-puromycin-LV及SSTR2-LV,转染肝癌细胞株MHCC-97H,噻唑蓝(MTT)、免疫荧光检测转染效率.采用Transwell侵袭实验和迁移实验分别检测未转染细胞(空白对照组)、转染3FLAG-puromycin-LV细胞(阴性对照组)和转染SSTR2-LV细胞(实验组)侵袭转移能力的强弱.镜下观察转染前后细胞形态的变化,免疫荧光检测转染前后细胞上皮表型蛋白和间质表型蛋白的定位和表达,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测转染后细胞SSTR2的表达,Westem blot检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白的表达.结果 SSTR2-LV可以有效转染肝癌细胞株MHCC-97H,稳定表达SSTtR2的mRNA和蛋白.转染SSTR2-LV的肝癌细胞株MHCC-97H较空白对照组和阴性对照组侵袭迁移能力明显受到抑制(P＜0.05).镜下观察肝癌细胞株MHCC-97H转染SSTR2-LV后,由成纤维细胞样、排列分散,转变为细胞排列紧密如铺路石.免疫荧光染色结果可见肝癌细胞株MHCC-97H转染后细胞膜表达的E-cadherin荧光由胞质转移至细胞周边浓聚,而Vimentin的荧光强度较前下降.采用Western blot进行蛋白定量分析,转染后MHCC-97H细胞上皮表型标志性蛋白E-cadherin、β-连环蛋白(β-catenin)表达量增高,间质表型标志性蛋白N-cadherin、Vimentin表达量减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 转染再表达SSTR2MHCC-97H细胞可以增加上皮表型蛋白表达,减少间质表型蛋白,从而逆转肝癌细胞EMT,导致肿瘤细胞侵袭能力减弱.
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上皮-间充质转化在营养剥夺促进肝癌细胞侵袭中的作用
目的 观察上皮-间充质转化在营养剥夺条件下促进肝癌细胞侵袭的作用.方法 以Hank's平衡盐缓冲液对肝癌细胞株HepG2和BEL7402细胞进行营养剥夺培养,观察营养剥夺对肝癌细胞上皮间质标记表达和侵袭能力的影响,并以转化生长因子(TGF)-β/Smad3通路抑制剂SIS3(2μmol/L)处理营养剥夺的肝癌细胞,分析上皮间质标记表达与细胞侵袭力之间的关系.结果 平衡盐缓冲液显著增加HepG2和BEL7402肝癌细胞的侵袭数[(58 450±1245)个；(61 750±1800)个,P＜0.05],同时其上皮标记CK18表达下调而间质标记纤维连接蛋白(fibronectin)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达升高.以TGF-β/Smad3通路抑制剂SIS3处理平衡盐溶液培养的HepG2和BEL7402细胞后,较对照组细胞未出现明显上皮间质标记表达改变,细胞侵袭数较SIS3未处理组也明显减少[(16500±1050)个比(15 450±985)个,P＜0.05].结论 上皮-间充质转化可能是营养剥夺条件下促进肝癌细胞侵袭性的机制之一.
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过表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5对肺腺癌上皮-间充质转化的影响及临床意义
目的 观察磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5(GPC5)对肺腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT)过程的影响,并探讨其与EMT关键蛋白在人肺腺癌组织中的临床表达相关性.方法 构建以慢病毒为载体、荧光素酶标记的过表达GPC5的稳转肺腺癌A549细胞株(OE-GPC5)及阴性对照组(NC组),采用Western blot法比较两组间EMT相关蛋白上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)、碱性螺旋-环-螺旋转录因子1(Twist1)、波形蛋白(Vimentin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)的表达水平差异;应用免疫荧光法检测EMT转化生长因子-β(TGF-β) 10 ng/ml干预36 h后两组间E-cadherin和Vimentin的表达水平;在134例肺腺癌组织中,采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)方法检测标本中GPC5、E-cadherin、Vimentin基因mRNA的表达水平,并运用Pearson法进行临床表达相关分析.结果 过表达GPC5可上调A549细胞株中E-cadherin的蛋白表达水平(P=0.008),而下调Vimentin(P=0.012),N-cadherin(P=0.001)和Twist1(P=0.001)的蛋白表达水平;免疫荧光实验结果显示在TGF-β干预后过表达GPC5组的E-cadherin的绿色荧光强度较NC组有所增强(P=0.020),而Vimentin的绿色荧光强度较NC组明显减弱(P=0.001);Pearson相关分析结果表明在人肺腺癌组织中GPC5与E-cadherin的mRNA表达呈正相关(P =0.007),而与Twist1的mRNA表达呈负相关(P =0.023).结论 GPC5可能通过逆转肺腺癌的EMT过程发挥抑癌基因的作用.
关键词： 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-5 上皮-间充质转化 肺腺癌
