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钙调蛋白抑制剂N-(6-氨基己基)-5-氯-1-萘磺酰胺通过逆转上皮-间充质转化抑制胶质母细胞瘤细胞的侵袭、迁移
目的 探讨钙调蛋白(CaM)抑制剂N-(6-氨基己基)-5-氯-1-萘磺酰胺(W-7)通过逆转上皮-间充质转化(EMT)抑制胶质母细胞瘤(GBM)细胞侵袭、迁移能力.方法 细胞计数试剂盒(CCK-8)检测W-7对U87、U251胶质瘤细胞存活率的影响.Transwell侵袭实验检测对照组和W-7处理组穿过小室底膜的U87、U251细胞数目.划痕愈合实验检测各组U87、U251细胞相对迁移距离.Western blot法检测各组U87、U251细胞中上皮标志物(E-钙黏蛋白)和间质标志物(N-钙黏蛋白、波形蛋白)以及转录因子(ZEB1蛋白)的相对表达水平.倒置显微镜下观察各组U87、U251细胞形态变化.免疫荧光检测各组胶质瘤细胞N-cadherin的表达差异.结果 W-7处理组穿过小室底膜的U87、U251细胞数少于对照组(P=0.001);W-7处理组U87、U251细胞愈合速率低于对照组,24 h后差异均有统计学意义(P=0.001、0.006).W-7处理组中U87、U251细胞E-钙黏蛋白的相对表达水平高于对照组(P =0.001),而N-钙黏蛋白、ZEB1、波形蛋白相对表达水平低于对照组(P=0.001).与对照组比较,W-7处理组U87、U251细胞形态呈椭圆形、圆形改变,细胞迁移能力减弱.结论 CaM抑制剂W-7能够通过逆转EMT抑制GBM细胞的侵袭、迁移能力.
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同源异型核基因1过表达诱导上皮-间充质转化促进乳腺癌细胞转移能力的研究
目的 观察同源异型核基因1(Prrx1)过表达对乳腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT)作用及迁移能力的影响.方法 用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)从MCF-7、MDA-MB-468、BT-549乳腺癌细胞中筛选出Prrx1低表达细胞株.用Prrx1过表达慢病毒载体感染筛选出的Prrx1低表达乳腺癌细胞株,Western blot验证感染成功后,观察感染前后乳腺癌细胞形态变化.Real-time PCR检测感染对乳腺癌细胞E-钙黏蛋白及波形蛋白表达的影响.Transwell细胞迁移实验检测Prrx1对乳腺癌细胞迁移能力的影响.结果 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-468、BT-549细胞的Prrx1 mRNA的相对表达量分别为15.05±0.18、11.78±0.42、7.98±0.37,因此3种乳腺癌细胞中MCF-7细胞Prrx1表达量低,Prrx1过表达慢病毒载体感染成功后,MCF-7细胞形态由多角形变为长梭形.Real-time PCR实验结果显示,感染后Prrx1 mRNA在实验组、空白对照组、病毒对照组的相对表达量分别为2.16±0.07、10.18±0.07、10.20±0.07,Prrx1 mRNA水平是感染前的259.57倍(t=227.100,P=0.000) ,两对照组比较差异无统计学意义 (t=1.315,P=0.202) .感染后E-钙黏蛋白mRNA在实验组、空白对照组、病毒对照组的相对表达量分为别4.00±0.02、3.56±0.02、3.51±0.05,E-钙黏蛋白mRNA水平是感染前的0.71倍(t=6.007,P=0.000),而两对照组比较差异无统计学意义(t=0.730,P=0.476).感染后波形蛋白mRNA在实验组、空白对照组、病毒对照组的相对表达量分别为8.79±0.42、10.18±0.06、9.97±0.05,波形蛋白mRNA水平是感染前的2.27倍(t=11.900,P=0.000),两对照组比较差异无统计学意义(t=2.052,P=0.057).Transwell实验显示Prrx1过表达组发生迁移的细胞数[(73.40±10.21)个]高于病毒对照组[(44.60±8.24)个]及空白对照组[(45.60±6.62)个],差异有统计学意义(t=6.837,P=0.000),空白对照组和病毒对照组差异无统计学意义(t=0.295,P=0.772).结论 Prrx1基因过表达可诱导乳腺癌细胞发生EMT使其迁移能力增强.
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前列腺癌中精子相关抗原9与上皮-间充质转化、细胞外基质异常相关分析
目的 探讨精子相关抗原9 (SPAG9)与上皮-间充质转化(EMT)、细胞外基质(ECM)相关蛋白在前列腺癌中的表达及相关性.方法 应用免疫组织化学技术检测60例前列腺癌和30例前列腺增生组织中SPAG9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达,并分析SPAG9与E-cadherin、Vimentin及MMP-2之间的相关性.结果 在转移性前列腺癌、非转移性前列腺癌和前列腺增生组织中,SPAG9蛋白表达的平均吸光度(A)值为466.34±13.52、284.98±25.69和106.01±13.58,而E-cadherin蛋白在3组中表达的平均A值为148.62±28.31、286.73±18.73和417.73±12.90,组间比较差异均有统计学意义(P=0.000),Vimentin为285.79±15.85、184.20±21.31和79.56±7.96,组间比较差异均有统计学意义(P=0.000),MMP-2为269.97±15.74、175.82 ±21.81和87.86±17.61,组间比较差异均有统计学意义(P=0.000);SPAG9、E-cadherin、Vimentin和MMP-2经Spearman等级相关分析,其相关系数为-0.431、0.443和0.610,P值分别为0.017、0.014和0.001,差异有统计学意义,说明SPAG9、E-cadherin、Vimentin和MMP-2在前列腺癌组织中的表达明显相关,且与E-cadherin呈负相关,而与Vimentin、MMP-2呈正相关.结论 SPAG9可能通过调控EMT、ECM相关蛋白E-cadherin、Vimentin和MMP-2促进前列腺癌的发生、转移.
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人Runt相关转录因子3通过调控上皮-间充质转化抑制涎腺腺样囊性癌转移
目的 观察过表达人Runt相关转录因子3(RUNX3)对腺样囊性癌细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响.方法 利用慢病毒感染腺样囊性癌SACC-83、SACC-LM细胞,获得稳定过表达RUNX3的细胞株(过表达RUNX3组),并设置空白慢病毒感染的阴性对照细胞株(阴性对照组).用Western blot法检测RUNX3蛋白过表达;采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测过表达RUNX3对SACC-83、SACC-LM细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)及Snail基因mRNA和蛋白表达水平的影响;采用Western blot检测过表达RUNX3对SACC-83、SACC-LM细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9表达的影响.采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力.结果 慢病毒感染SACC-83、SACC-LM细胞后,其RUNX3蛋白表达[(0.968±0.035)、(0.956±0.037)]均显著上调,与阴性对照组[(0.425±0.031)、(0.196±0.028)]比较差异有统计学意义(P=0.002、P=0.000).RT-qPCR和Western blot检测表明,与阴性对照组比较,过表达RUNX3组的Vimentin、Fibronectin、Snail mRNA表达下降34.2％～61.9％、蛋白表达下降31.8％～71.8％;而SACC-83细胞的E-cadherin mRNA和蛋白分别上调2.671、2.237倍,SACC-LM细胞的E-cadherin mRNA和蛋白分别上调3.687、5.454倍.Westem blot检测显示,与阴性对照组比较,过表达RUNX3组的MMP-2和MMP-9表达显著下降(P=0.005、P=0.004).细胞划痕实验显示,过表达RUNX3细胞的迁移率较低.结论 RUNX3可以抑制人腺样囊性癌细胞的EMT,这是其抑制腺样囊性癌细胞侵袭与转移的机制之一.
关键词： 涎腺腺样囊性癌 runt相关转录因子3 上皮-间充质转化 转移 -
微小RNA-30a靶向调控Snail影响胃癌SGC7901细胞迁移和侵袭能力
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-30a影响胃癌细胞迁移和侵袭能力的分子机制.方法 将Snail 3'端非编码区(3'-UTR)野生型及突变型载体与miR-30a模拟物或miR-30a阴性对照共转染胃癌SGC7901细胞,双荧光素酶报告基因验证Snail是否为miR-30a下游的靶基因.实验分miR-30a组(转染miR-30a mimics)、miR-30a-Snail组(转染miR-30a mimics及Snail过表达质粒)、空白对照组(转染空白质粒NC)3组;Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测各组细胞上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)、波形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达水平.结果 双荧光素酶实验结果显示,共转染miR-30a和Snail基因3'-UTR质粒后,细胞中荧光素酶活性明显降低,miR-30a能与Snail的3,-UTR结合,并抑制其表达.Transwell迁移和侵袭实验结果显示,miR-30a组穿过细胞数分别为[(100.0±5.8)、(56.8±3.7)],较空白对照组[(197.3±11.6)、(151.3±10.6)个]、miR-30a-Snail 组[(183.0±7.4)、(163.0±7.4)个]明显降低,差异有统计学意义(P =0.002、0.000).Western blot 实验结果显示,E-cadherin蛋白水平,miR-30a组(38 954±173)较空白对照组(3416±20)及miR-30a-Snail组(4097 ±27)明显上升,差异有统计学意义(P=0.000),两对照组间差异无统计学意义(P=0.704);Fibronectin、Vimentin、N-cadherin蛋白水平,miR-30a组(8 793±314、5 473±97、5 911±144)较空白对照组(19 273±324、11 046±117、13 116±239)及miR-30a-Snail组(17 463±290、12 781±177、14 103±210)明显降低,差异有统计学意义(P=0.004),两对照组间差异无统计学意义(P =0.530).结论 miR-30a可能通过靶向调控Snail影响胃癌EMT进程,进而影响胃癌细胞的迁移和侵袭能力.
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上皮细胞转化序列2诱导肝癌细胞上皮-间充质转化促进侵袭转移
目的 观察上皮细胞转化序列2(ECT2)对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力及其对肝癌细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响.方法 应用Western blot检测5例肝细胞癌标本及其配对癌旁组织ECT2的表达;通过慢病毒介导的方法构建过表达ECT2肝癌细胞,采用克隆形成实验和Transwell小室等方法观察其与对照组比较增殖、迁移及侵袭能力的变化,分析ECT2诱导肝癌细胞上皮-间充质转化进而促进转移复发的相关机制.结果 ECT2在肝癌组织中的表达较其在癌旁组织中明显升高;体外实验结果显示慢病毒转染的高表达ECT2的HEP3B细胞增殖较其对照组明显增高[(84.2±12.3)个比(26.7±5.7)个,P＜0.05],对照组及过表达组发生迁移的细胞数分别为[(38.6±15.6)个比(103.9±21.2)个,P＜0.05].通过上调肝癌细胞ECT2蛋白的表达能够诱导肝癌细胞发生EMT,其上皮化表型E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)的表达下调,间质化表型N-钙黏蛋白(N-cadherin)和纤维连接蛋白(Fibronectin)上调.结论 ECT2可能通过诱导肝癌细胞发生EMT进而参与调控其侵袭转移的进程.
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AMD3100联合吉西他滨对胆管癌细胞侵袭转移能力和上皮-间充质转化的影响
目的 观察AMD3100联合吉西他滨(GEM)对胆管癌细胞侵袭转移能力和上皮-间充质转化(EMT)的影响.方法 将细胞株分为对照组、AMD3100组、GEM组、AMD3100与GEM联合干预组共4组,应用噻唑蓝(MTT)和Transwell小室的方法检测AMD3100联合GEM对RBE-TCHU179细胞增殖和侵袭转移能力的影响.应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot法检测CXC趋化因子受体4(CXCR4)蛋白和mRNA的变化,应用Western blot法检测侵袭转移相关因子血管内皮生长因子(VEGF)-C、基质金属蛋白酶(MMP)-9和EMT相关基因N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达变化.结果AMD3100及基质细胞源性因子-1α(SDF-1α)对细胞生存率无明显影响.AMD3100不能影响GEM对细胞增殖的抑制作用.联合组细胞迁移率[(232.50±4.33)个/视野]比GEM组[(282.70±3.65)个/视野]显著降低.联合组较GEM组EMT相关蛋白N-cadherin蛋白(1.340±0.240比2.160±0.254)表达显著降低,E-cadherin蛋白(0.863±0.245比0.430±0.154)表达显著升高;CXCR4蛋白(0.885±0.163比1.565±0.148)及mRNA转录水平均显著降低;CXCR4下游基因VEGF-C(1.565±0.332比3.250±0.212)、MMP-9(1.340±0.098比1.980±0.212)蛋白表达均显著降低.结论AMD3100能够通过SDF-1/CXCR4轴增强胆管癌细胞对GEM的敏感性,逆转EMT的发生,降低转移能力.
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配对相关同源框-1基因过表达对人胰腺癌细胞侵袭及上皮-间充质转化的影响
目的 观察配对相关同源框-1(Prrx-1)基因过表达对胰腺癌细胞侵袭及上皮-间充质转化(EMT)的影响.方法 培养人正常胰腺导管上皮细胞HPDE6-C7和3株胰腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1,采用Western blot方法检测Prrx-1蛋白表达.采用Prrx-1基因过表达慢病毒载体转染胰腺癌BxPC-3细胞,构建高表达Prrx-1基因过表达BxPC-3细胞(简称Prrx-1过表达细胞)后,采用Western blot方法检测癌细胞Prrx-1蛋白水平;采用显微镜观察癌细胞形态;采用Westernblot方法检测各组癌细胞中上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和间叶标志物波形蛋白(Vimentin)蛋白;采用Transwell方法观察癌细胞侵袭能力.结果 Western blot检测结果显示:Prrx-1蛋白在HPDE-C7细胞不表达,而在AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1均高表达.选取BxPC-1进一步研究.采用Western blot方法检测结果显示,与空载对照组比较,Prrx-1过表达组细胞Prrx-1基因蛋白水平明显升高;形态学观察结果显示,Prrx-1基因过表达组细胞出现EMT改变;Western blot检测结果显示,与空载对照组比较,Prrx-1过表达组细胞E-Cadherin表达下调,Vimentin表达上调;Transwell方法检测发现,空载对照组和Prrx-1过表达组穿膜细胞数分别为(89 ±5)个和(139±8)个(P＜0.05).结论 Prrx-1过表达可促进人胰腺癌细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与促进EMT有关.
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Notch-1和微小RNA-200家族在胰腺癌上皮-间充质转化中的作用
目的 观察Notch-1和微小RNA(miRNA,miR)-200家族在吉西他滨(Gem)诱导的人胰腺癌PANC-1细胞上皮-间充质转化(EMT)中的作用.方法 体外培养PANC-1细胞并诱导细胞EMT,Western blot实验和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Notch-1 、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、相关转录因子及miR-200家族成员的表达;Transwell小室检测具有EMT改变的PANC-1细胞迁移和侵袭能力.结果 Gem诱导PANC-1细胞EMT适药物浓度为10 nmol/L,适时间为9 d.Western blot灰度分析显示未经Gem处理的亲代细胞(parental)组Notch-1、E-cadherin、V imentin、slug、snail、twist、E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)的表达分别为0.840±0.002、0.995±0.008、1.158 ±0.001、0.253 ±0.004、0.528 ±0.003、0.346 ±0.002,0.291 ±0.006,Gem(+)组分别为1.599±0.001、0.483 ±0.001、1.821 ±0.003、0.719 ±0.004、0.919 ±0.005、0.762 ±0.002、0.701±0.004,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR检测parental组Notch-1、E-cadherin、Vimentin、slug、snail、twist、ZEB1 mRNA的表达分别为(2.200 ±0.010)×10-5、(1.540 ±0.002)×10-4、1.003 ±0.004、(8.580±0.003) ×10-4、(5.040±0.007) ×10-3、(6.930 ±0.001) ×10-5、(2.010 ±0.001)×10-4,Gem(+)组分别为(5.870±0.004)×10-5、(1.430±0.001)×10-5、1.660±0.007、(4.030±0.002)×10-3 、(8.980 ±0.005)×10-3 、(3.300 ±0.020)×10-4、(1.120 ±0.003)×10-3,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR法检测parental组miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429的表达水平分别为(2.340±0.002)×10-5、(4.280±0.001) ×10-6、(3.250 ±0.003) ×10-5、(2.470±0.004) ×10-5、(6.230±0.005) ×10-4,Gem(+)组分别为(0.801 ±0.000) ×10-5、(2.030±0.004)×10-6、(5.000 ±0.050)×10-6 、(3.670 ±0.003)×10-6、(1.310 ±0.002)×10-4,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).PANC-1细胞EMT改变后侵袭能力明显增强,parental组迁移和侵袭实验细胞计数分别为(25.70 ±3.67)个和(16.30±2.21)个,Gem(+)组分别为(77.40 ±3.01)个和(68.00 ±8.76)个,两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Gem可诱导PANC-1细胞EMT,Notch-1可能是该过程的重要信号通路,并参与miR-200家族的调控.
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DNA损伤结合蛋白2抑制肝门部胆管癌上皮-间充质转化及转移的作用
目的 观察DNA损伤结合蛋白2(DDB2)在肝门部胆管癌上皮-间充质转化及转移中的作用.方法 构建DDB2干扰质粒和高表达质粒,经反转录病毒稳定转染肝门部胆管癌细胞株QBC939细胞,建立DDB2沉默及高表达稳定转染细胞株.通过Western blot检测上皮-间充质转化标志物[E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)]表达变化;经划痕实验及Transwell迁移实验检测QBC939细胞迁移能力改变;经Matrigel侵袭实验检测QBC939细胞侵袭能力改变.结果 在QBC939细胞中沉默DDB2能够明显抑制上皮细胞标志物E-cadherin的表达而促进间质细胞标志物(Vimentin)的表达,在Transwell实验中可增强细胞的迁移能力[(100.00±5.37)％比(214.66±10.04)％,P＜0.05],在Matrigel实验中可增强细胞的侵袭能力[(100.00±11.18)％比(238.02±32.46)％,P＜0.05]同时增强细胞的迁移和侵袭能力;在QBC939细胞中高表达DDB2能够明显促进上皮细胞标志物E-cadherin的表达而抑制间质细胞标志物(Vimentin)的表达,在Transwell实验中可降低细胞的迁移能力[(100.00± 18.76)％比(49.31±10.21)％,P＜0.05],在Matrigel实验中可降低细胞的侵袭能力[(100.00± 12.81)％比(35.37±4.92)％,P＜0.05].同时降低细胞的迁移和侵袭能力.结论 DDB2能够抑制肝门部胆管癌细胞上皮-间充质转化及转移.
关键词： DNA损伤结合蛋白2 肝门部胆管癌 上皮-间充质转化 转移 -
抑制上皮-间充质转化对肾癌细胞转移和肾癌放疗的影响
目的 观察抑制上皮-间充质转化(EMT)与肾癌细胞转移的相关性及其在肾癌放疗中的作用.方法 实验设对照组、脂质体转染组(Lipofectamine组)、微小RNA(miRNA,miR)-200类似物转染组(miR-200组)和无义序列组(Negative-Mimics转染组).用miR-200类似物转染肾癌细胞,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测EMT相关分子E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin) mRNA变化确定miR-200对EMT的抑制效果;Transwell迁移实验、划痕实验检测各组肾癌细胞迁移能力;用2Gy剂量X线照射各组细胞,微核实验、免疫荧光检测、p53结合蛋白1焦点数(53BP1 foci)实验检测肾癌细胞损伤程度,克隆存活实验检测细胞存活能力.结果 Real-time PCR结果证明E-cadherin、N-cadherin和Vimentin在对照组中的表达量为1.01 ±0.01、1.00±0.02、1.01 ±0.02;与对照组比较,这3个基因在Lipofectamine组和Negative-Mimics组的表达量为0.92±0.04、1.07±0.01、0.99 ±0.03;0.94±0.03、0.99±0.02、0.97 ±0.03,差异无统计学意义(P＞0.05);在miR-200组的表达量为3.16 ±0.07、0.75±0.07、0.22±0.03,差异有统计学意义(P＜0.05),证明miR-200能显著抑制肾癌细胞EMT过程.对照组、Lipofectamine组、Negative-Mimics转染组和miR-200类似物转染组Transwell迁移实验和划痕实验结果分别为(203 ±4)、(191 ±5)、(198±2)、(201 ±5)个细胞和(21.9±1.9)、(22.5±2.6)、(21.8±3.5)、(20.7±1.8)个细胞,组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05);X线处理后,对照组微核率和克隆存活率为(9.3±0.4)个、(1.02±0.03)％,53BP1 foci为(18.4±1.1)个;与对照组比较,Lipofectamine组和Negative-Mimics转染组微核和克隆存活率为(9.4±0.3)个、(1.09±0.05)％和(9.1±0.2)个、(0.94±0.02)％,53BP1 foci为(18.5±0.3)个和(17.9±0.4)个,差异无统计学意义(P＞0.05);miR-200类似物转染组微核率和克隆形成率为(15.2±0.2)个和(0.39 ±0.03)％,53BP1foci为(24.9±1.1)个,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 EMT抑制对肾癌细胞转移能力没有影响,但是能够增强放射治疗对肾癌细胞的杀伤作用.
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信号素3A对肺癌A549细胞上皮-间充质转化的调节作用
目的 观察外源性信号素3A (SEMA3A)对转化生长因子-β1(TGF-β1)介导的肺癌A549细胞发生上皮-间充质转化(EMT)的调节作用.方法 常规培养肺癌A549细胞并分为3组:对照组、TGF-β1诱导组、SEMA3A干预组,观察细胞形态,采用划痕实验检测细胞迁移能力,免疫细胞化学染色检测波形蛋白(Vimentin)的表达,Western blot法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)和Vimentin的蛋白表达水平.结果 予以5 μg/L TGF-β1诱导48h后,可见A549细胞由原有的铺路石样,转化成纺锤体形或长梭形,细胞间连接消失,细胞间隔变大,呈离散状态.划痕实验结果显示,TGF-β1能够显著促进A549细胞迁移,迁移率为(75.67 ±4.51)％,是对照组[(33.00±7.00)％]的2.29倍(P＜0.01);免疫细胞化学染色结果显示,对照组无Vimentin阳性表达,而予以TGF-β1诱导后,可见Vimentin阳性表达,胞质内出现棕黄色丝状排列结构;Western blot结果显示TGF-β1诱导48 h后,Vimentin蛋白表达明显上调,是对照组的6.86倍,E-cadherin蛋白表达明显下调,是对照组的5.70％.而予以SEMA3A预处理后,A549细胞基本保持原有的铺路石样状态,细胞迁移能力降低,Vimentin表达下调,E-cadherin表达上调.结论 SEMA3A能够通过上调E-cadherin蛋白的表达,抑制Vimentin蛋白的表达,显著抑制TGF-β1介导的A549细胞发生的EMT,同时抑制TGF-β1诱导的细胞迁移能力的提高,从而发挥抗非小细胞肺癌发生、发展的作用.
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上调叉头框转录因子M1基因对人肿瘤细胞迁移侵袭及上皮-间充质转化的影响
目的 探讨上调叉头框转录因子M1(FoxM1)基因对人卵巢癌细胞迁移侵袭的影响及其分子机制.方法 构建FoxM1过表达慢病毒载体.HO-8910细胞分为3组,空白对照组、空载对照组和FoxM1慢病毒过表达组.转染HO-8910细胞后,采用Western blot方法观察FoxM1蛋白表达,采用划痕修复试验检测癌细胞迁移能力,采用Transwell方法检测癌细胞侵袭能力,采用Western blot法检测癌细胞E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白水平.结果 与空白对照组和空载对照组比较,FoxM1过表达组FoxM1蛋白明显升高.划痕修复试验结果显示,空白对照组、空载对照组和FoxM1过表达迁移细胞迁移距离分别为(156.80 ±2.26)、(161.60±1.81)和(278.60±2.62) μm.统计学分析发现,与空白对照组比较,P ＜0.01;Transwell侵袭试验显示,空白对照组、空载对照组和FoxM1过表达迁移细胞数分别为(68.56±1.69)、(67.27±1.36)和(126.38 ±1.56)个.统计学分析发现,与空白对照组比较,P＜0.01.Western blot结果显示,与空白对照组比较,FoxM1过表达细胞组E-钙黏蛋白表达降低,而N-钙黏蛋白表达增高.结论 FoxM1过表达可促进人卵巢癌细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与促进上皮-间充质转化有关.
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CXC趋化因子配体12/CXC趋化因子受体4生物轴在吉西他滨影响胆管癌细胞上皮-间充质转化及侵袭转移能力中的作用
目的 探讨CXC趋化因子配体12(CXCL12)/CXC趋化因子受体4(CXCR4)生物轴在吉西他滨(GEM)对胆管癌细胞上皮-间充质转化(EMT)及侵袭转移影响中的作用机制.方法 利用基质细胞源性因子-1α(SDF-1α,100 ng/ml)激活高表达CXCR4的胆管癌细胞的CXCL12/CXCR4生物轴建立体外模型,将胆管癌RBE细胞随机分为正常对照组和吉西他滨组.应用噻唑蓝(MTT)的方法检测增殖率,应用Transwell小室观察细胞的侵袭转移.应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测不同浓度GEM对CXCR4 mRNA及蛋白表达的影响,应用Western blot检测侵袭转移相关因子血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、基质金属蛋白酶(MMP)-9,以及EMT相关N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达变化.结果 吉西他滨组细胞生存率分别为76.65％、71.40％、52.25％,生存率明显下降;吉西他滨组[(282.00 ±3.45)个/视野]细胞侵袭转移大于对照组[(168.00±2.49)个/视野];吉西他滨组CXCR4蛋白(0.965±0.163、1.895±0.191、3.975±0.120、3.355±0.163、3.572±0.198、6.154 ±0.113)及mRNA(1.021±0.210、2.442±0.556、2.774±0.146、2.961±0.275、3.279±0.228、5.010±0.826)随浓度提高表达上调;吉两他滨组与对照组比较,CXCR4、VEGF-C、MMP-9(1.565±0.148比1.014±0.156、3.250±0.212比1.025±0.318、1.980±0.212比1.025 ±0.318)表达上调,EMT相关N-cadherin蛋白(2.162±0.254比1.025±0.318)表达上调,E-cadherin蛋白(0.430±0.154比1.025±0.318)表达下调.结论 吉西他滨能够显著抑制胆管癌RBE细胞的生长,促进EMT的发生,促进侵袭转移,其机制可能是通过激活CXCL12/CXCR4轴及下游相关因子实现的.
关键词： 吉西他滨 胆管癌 CXC趋化因子受体4 CXC趋化因子配体12 上皮-间充质转化 转移 -
肝细胞核因子4在肝癌细胞干细胞特性及上皮-间充质转化中的作用
目的 观察肝细胞核因子4(HNF4)在肝癌细胞SMMC7721中对干细胞特性及上皮-间充质转化的影响.方法 分别利用烟酸己可碱33342(Hoechst33342)染色及CD133流式细胞术分选肝癌细胞SMMC7721,通过Western blot检测侧群细胞及CD133+细胞中HNF4的表达水平,转染HNF4特异性siRNA沉默HNF4的表达,通过Western blot检测细胞中上皮-间充质转化相应标志蛋白的变化;后通过流式细胞术及体外细胞球体形成实验检测沉默HNF4对干细胞特性的影响.结果 Hoechst33342阴性的侧群细胞占细胞总数的比例为(8.77±0.59)％,而CD133+细胞占细胞总数比例为(4.19±-0.26)％,侧群细胞及CD133+细胞中HNF4的表达水平分别较Hoechst33342阳性及CD133-细胞明显降低,而沉默HNF4可促进细胞上皮性标志蛋白的下降,伴随间质性标志蛋白升高;沉默HNF4后可升高肝癌细胞中的侧群细胞比例(NC比si-HNF4=7.73±0.57比22.38±2.56)及CD133+细胞比例(NC比si-HNF4=4.67±0.56比17.31 ±1.77),同时促进SMMC7721细胞成球(NC比si-HNF4=1.67±0.62比5.33±1.52).结论 HNF4在维持肝癌细胞干细胞特性发挥重要作用,沉默其表达可促进肝癌细胞上皮-间充质转化,并增强肝癌细胞的干细胞特性.
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高尔基体膜蛋白Ⅱ在肝细胞肝癌转移、复发和上皮-间充质转化的相关机制
目的 探讨高尔基体膜蛋白Ⅱ(GOLPH2)促进人肝细胞肝癌(HCC)细胞上皮-间充质转化(EMT)转移复发的机制.方法 利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测8种肝癌细胞株中GOLPH2的表达,选择其中高表达GOLPH2的MHCC-97H肝癌细胞利用慢病毒载体介导的RNA干扰GOLPH2的表达,观察侵袭、转移能力及EMT相关生物学特性是否因GOLPH2表达水平改变而发生变化.结果 RT-PCR结果显示GOLPH2的表达在HCC细胞株中随着恶性程度的增加而明显上升.在体外实验显示GOLPH2-RNA干扰(RNAi)转染组细胞克隆形成数(17.8±7.5)个显著低于对照组(41.7±5.3)个(P＜0.05).转染组及对照组发生迁移的细胞数分别为(27.8±11.6)个比(278.2±23.4)个(P＜0.01).转染组的迁移和侵袭能力明显减弱.同时转染组细胞间质表型N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)下调而上皮表型E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)的表达上调(P＜0.01).结论 在HCC细胞中GLOPH2可通过调节EMT进而调控肝癌细胞侵袭转移.
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肾上腺髓质素诱导上皮-间充质化促进胆囊癌细胞侵袭转移
目的 探讨在人胆囊癌中肾上腺髓质素(ADM)诱导上皮-间充质转化(EMT)影响胆囊癌细胞侵袭迁移能力及其相关的分子机制.方法 利用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术分析ADM在25例胆囊癌及其对照组织中基因水平的表达;在人胆囊癌细胞株中进行细胞增殖、侵袭等功能实验,并分析ADM过表达后细胞上皮间质表型的变化.结果 ADM在人胆囊癌中较胆囊炎组织表达上调(P＜0.01).克隆形成实验结果示pWPI-ADM转染组细胞克隆形成数(57.1±8.5)个显著高于对照组(27.7±8.3)个,差异有统计学意义(P＜0.05).它能促进胆囊癌细胞迁移,过表达ADM组迁移能力明显高于对照组.在体外实验显示慢病毒转染的ADM高表达胆囊癌细胞株GBC-SD发生EMT,其表现为间质化表型神经钙黏素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)上调和上皮化表型上皮钙黏素(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)的表达下调.结论 ADM在胆囊癌组织中高表达与其进展有直接联系,其具体机制可能是通过诱导EMT促进胆囊癌的转移复发.
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骨桥蛋白诱导人胆囊癌细胞发生上皮-间充质转化促进转移复发
目的 探讨在人胆囊癌中骨桥蛋白(OPN)的临床意义及其促进转移复发的机制.方法 利用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术分析OPN在15例胆囊癌及其对照组织中基因水平的表达;在人胆囊癌细胞株中通过细胞增殖、侵袭等功能实验分析OPN诱导胆囊癌细胞上皮-间充质转化(EMT)促进转移复发的具体机制.结果 OPN在人胆囊癌中较胆囊炎组织表达上调(P＜0.01).克隆形成实验结果显示pWPI-OPN转染组细胞克隆形成数为(59.9±10.3)个,显著高于对照组的(23.7±9.2)个,差异有统计学意义(P＜0.05).在体外实验显示慢病毒转染的OPN高表达胆囊癌细胞株GBC-SD发生EMT,其表现为间质化表型神经钙黏素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)上调和上皮化表型上皮钙黏素(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)的表达下调.同时,它能促进胆囊癌细胞运动和侵袭,过表达OPN组及对照组发生迁移的细胞数分别为[(369.3±23.4)、(84.7±18.7)个,P＜0.01].结论 OPN在胆囊癌组织中高表达与其进展有着直接的联系,其具体机制可能是通过诱导EMT促进胆囊癌的转移复发.
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磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基3在非小细胞肺癌上皮-间充质转化及迁移中的作用
目的 观察磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基3(PIK3R3)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达,及PIK3R3对NSCLC细胞株A549和PC-9上皮-间充质转化(EMT)及迁移的影响.方法 分别提取22对NSCLC患者的肿瘤组织和癌旁组织中的总RNA及和7对标本中总蛋白,分别检测PIK3R3mRNA水平和蛋白表达;在A549和PC-9中通过感染慢病毒高表达或抑制PIK3R3后,通过Transwell迁移实验检测其对细胞迁移的影响,通过Western blot法检测上皮细胞钙黏蛋白(CDH1)、波形蛋白(VIM)、蜗牛族锌指1(SNAI1)及蜗牛族锌指2(SNAI2)等EMT相关蛋白的变化,并通过染色质免疫共沉淀法检测SNAI1及SNAI2结合于CDH1启动子的能力,通过双荧光素酶报告系统检测CDH1的转录活性变化.结果 在NSCLC临床标本中,PIK3R3在肿瘤组织中的表达水平高于癌旁组织;在A549和PC-9中高表达PIK3R3后,穿膜细胞数增加[A549 Control:(46 ±3)个,PIK3R3:(92±5)个;PC-9 Control:(25±2)个,PIK3R3:(53±3)个],细胞的迁移能力增强,同时EMT相关的上皮标志蛋白CDH1表达降低,而间质标志蛋白VIM、SNAI1及SNAI2的表达升高,SNAI1及SNAI2结合于CDH1启动子的能力分别增强9.0倍及3.8倍,同时CDH1的转录活性降低70％;而抑制HK3R3的表达后,穿膜细胞数[A549 sh-Control:(58±5)个,sh-HK3R3:(13±3)个;PC-9 sh-Control:(28±5)个,sh-PIK3R3:(10±3)个],细胞的迁移能力减弱,伴随CDH1表达增高,而VIM、SNAI1及SNAI2的表达降低,同时SNAI1及SNAI2结合于CDH1启动子的能力分别降低70％,相应CDH1的转录活性增高3.6倍.结论 在NSCLC标本中PIK3R3的表达增高,在NSCLC细胞株中高表达PIK3R3可诱使其发生EMT,并促进其迁移能力,而抑制PIK3R3的表达可逆转上述过程.
关键词： 磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基3 非小细胞肺癌 迁移 上皮-间充质转化 -
甘露糖敏感性绿脓杆菌制剂抑制肝癌上皮-间充质转化的作用
目的 观察甘露糖敏感性绿脓杆菌制剂(PA-MSHA)对肝细胞肝癌上皮-间充质转化(EMT)的作用.方法 培养人肝癌细胞株MHCC97L及HepG2,以不同剂量的PA-MSHA作用于肝癌细胞,显微镜观察细胞形态学变化,免疫荧光技术及Western blot检测PA-MSHA作用前后肝癌细胞EMT相关基因及转录因子的表达,免疫组织化学及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测PA-MSHA治疗前后裸鼠模型肝癌组织中钙黏蛋白(E-cadherin)及转录因子Snail和Slug表达.结果 Western blot结果显示与对照组比较PA-MSHA治疗组肝癌细胞E-cadherin表达显著增强,而波形蛋白(Vimentin)、纤维粘连蛋白(Fibronecin)、核因子-kappa B(NF-κB)以及转录因子Snail和Slug的表达显著降低,其效应呈剂量依赖性,而外源性甘露糖显著抑制PA-MSHA对上述蛋白的调控作用.免疫荧光也显示PA-MSHA上调肝癌细胞E-cadherin表达而抑制Vimentin的表达,显微镜下细胞形态也由不规则的梭形转变为相对规则的卵圆形.免疫组织化学结果显示荷瘤裸鼠经PA-MSHA治疗后肝癌组织E-cadherin的表达显著增强,而Snail及Slug的转录则受到显著抑制(P＜0.05).结论 PA-MSHA可以通过识别结合肝癌细胞表面的甘露糖显著抑制肝癌EMT的发生.
