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微小RNA-30a靶向Beclin1抑制舌鳞状细胞癌细胞自噬活性的研究
目的：研究微小RNA（miRNA）-30a转染对舌鳞状细胞癌细胞自噬相关基因Beclin1表达及其自噬活性的影响，探讨舌鳞状细胞癌细胞自噬活性调控的相关机制。方法利用脂质体转染技术，将内源性miRNA-30a模拟物和抑制物分别转染至舌鳞状细胞癌UM1、UM2和SCC25细胞。实验设miRNA-30a mimic组、miRNA-30a inhibitor组和对照组；通过实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测转染前后Beclin1基因mRNA表达变化，通过Western blot检测Beclin1、LC3的蛋白表达变化。结果在miRNA-30a mimic组中，Beclin1和自噬标记蛋白LC3-Ⅱ表达量与对照组相比均明显下降（P＜0.05）；在miRNA-30a inhibitor组中，Beclin1和LC3-Ⅱ表达量较对照组均明显上升（P＜0.05）。结论 miRNA-30a负调控Beclin1表达，并抑制舌鳞状细胞癌细胞的自噬水平。
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2型糖尿病并重症肾衰竭连续肾脏替代治疗临床效果及对血清瘦素和微小RNA-30a水平的影响
目的 观察2型糖尿病并重症肾衰竭连续肾脏替代治疗临床效果及对血清瘦素和微小RNA-30a(miR-30a)水平的影响.方法 选取2型糖尿病并重症肾衰竭64例,根据透析方法不同将其分为观察组和对照组两组各32例.观察组给予连续肾脏替代治疗,对照组给予普通血液透析治疗.观察比较两组治疗后临床效果,治疗前后血糖指标、血清瘦素、肾功能指标、血清miR-30a水平,以及治疗期间不良反应发生情况.结果 治疗后,观察组总有效率为90.63％,对照组总有效率为75.00％,观察组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).治疗前,两组血糖指标、血清瘦素、肾功能指标、血清miR-30a水平比较差异均无统计学意义(P>0.05).治疗后,观察组空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)水平及血清瘦素水平均明显低于治疗前,对照组血清瘦素水平明显低于治疗前,观察组FPG、HbA1c水平及血清瘦素水平均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).治疗后,两组血清尿素(BUN)、肌酐(Scr)及miR-30a水平均较治疗前明显下降,观察组血清BUN、Scr及miR-30a水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).两组治疗期间均未出现低血压、心律失常、出血、感染及透析器凝血等不良反应.结论 2型糖尿病并重症肾衰竭患者连续肾脏替代治疗效果良好,并可控制血糖指标和血清瘦素水平,同时可改善肾功能指标、降低血清miR-30a水平.
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微小RNA-30a在胃癌患者的表达及临床意义
目的 探讨胃癌患者血浆微小RNA-30a (miRNA-30a)的表达及其临床意义.方法 采用荧光定量PCR检测64例胃癌患者(A组)和36例健康人群(C组)血浆miRNA-30a的表达水平,分析其与胃癌临床病理参数间的关系.结果 A组miRNA-30a表达水平低于C组(0.436±0.261 vs.0.599±-0.348)(P＜0.01).miRNA-30a在胃癌患者血浆中的表达水平与胃癌的分化程度、侵润深度及淋巴结转移明显相关(P＜0.05),但与患者的年龄、性别、肿瘤分期无显著相关(P＞0.05).结论 miRNA-30a在胃癌患者血浆中低表达,与胃癌发生和发展密切相关,可能成为胃癌早期诊断的指标之一.
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微小RNA-30a靶向调控Snail影响胃癌SGC7901细胞迁移和侵袭能力
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-30a影响胃癌细胞迁移和侵袭能力的分子机制.方法 将Snail 3'端非编码区(3'-UTR)野生型及突变型载体与miR-30a模拟物或miR-30a阴性对照共转染胃癌SGC7901细胞,双荧光素酶报告基因验证Snail是否为miR-30a下游的靶基因.实验分miR-30a组(转染miR-30a mimics)、miR-30a-Snail组(转染miR-30a mimics及Snail过表达质粒)、空白对照组(转染空白质粒NC)3组;Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测各组细胞上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)、波形蛋白(Vimentin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达水平.结果 双荧光素酶实验结果显示,共转染miR-30a和Snail基因3'-UTR质粒后,细胞中荧光素酶活性明显降低,miR-30a能与Snail的3,-UTR结合,并抑制其表达.Transwell迁移和侵袭实验结果显示,miR-30a组穿过细胞数分别为[(100.0±5.8)、(56.8±3.7)],较空白对照组[(197.3±11.6)、(151.3±10.6)个]、miR-30a-Snail 组[(183.0±7.4)、(163.0±7.4)个]明显降低,差异有统计学意义(P =0.002、0.000).Western blot 实验结果显示,E-cadherin蛋白水平,miR-30a组(38 954±173)较空白对照组(3416±20)及miR-30a-Snail组(4097 ±27)明显上升,差异有统计学意义(P=0.000),两对照组间差异无统计学意义(P=0.704);Fibronectin、Vimentin、N-cadherin蛋白水平,miR-30a组(8 793±314、5 473±97、5 911±144)较空白对照组(19 273±324、11 046±117、13 116±239)及miR-30a-Snail组(17 463±290、12 781±177、14 103±210)明显降低,差异有统计学意义(P=0.004),两对照组间差异无统计学意义(P =0.530).结论 miR-30a可能通过靶向调控Snail影响胃癌EMT进程,进而影响胃癌细胞的迁移和侵袭能力.
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微小RNA-30a通过靶向调节锌指结构E-box同源结合框2抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭
目的 观察微小RNA (miR)-30a对乳腺癌细胞增殖、侵袭能力的影响,并探讨其与锌指结构E-box同源结合框2(ZEB2)的关系.方法 采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)技术检测乳腺癌组织及癌旁组织中miR-30a的表达.用miR-30a的模拟物片段(has-miR-30a mimics)瞬时转染乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231.通过细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)检测miR-30a对细胞增殖能力的影响.通过小室(Transwell)检测miR-30a对乳腺癌细胞侵袭能力的影响.通过TargetScan软件预测miR-30a的潜在靶基因为ZEB2,并利用荧光素酶报告基因实验和Western blot法证实miR-30a直接靶向靶基因ZEB2.结果 乳腺癌组织与癌旁组织的miR-30a相对表达水平的比值为0.47 ±0.01(P＜0.05).在MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中过表达miR-30a,培养48 h后的吸光度值分别为2.03±0.19、2.56±0.21,低于对照组3.22±0.07、3.49±0.19,细胞侵袭抑制率分别为(36.04±0.03)％、(53.61±0.03)％,ZEB2的蛋白表达水平分别下调了40％和60％(P＜0.05).荧光素酶报告基因实验证实ZEB2是miR-30a的直接靶基因.结论 miR-30a在乳腺癌组织和细胞中的表达明显下调,miR-30a可以通过靶向ZEB2抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭.
关键词： 乳腺癌 微小RNA-30a 锌指结构E-box同源结合框2 侵袭 -
微小RNA-30a对胃癌细胞株SGC7901增殖凋亡及侵袭转移的影响
目的 观察微小RNA-30a(miR-30a)对胃癌细胞生物学行为的影响.方法 将miR-30a模拟物及抑制物瞬时转染胃癌细胞株SGC7901,实验分未转染组、空白对照组、miR-30a模拟物转染组、miR-30a抑制物转染组4组,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-30a的表达水平,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,Transwell小室检测细胞体外侵袭迁移能力.结果 与两对照组比较,胃癌SGC7901细胞在转染模拟物后,miR-30a表达明显上调,而转染抑制物后miR-30a表达明显受抑,差异有统计学意义(P＜0.叭).与对照组及抑制物转染组比较,miR-30a模拟物转染组细胞增殖活性、迁移和侵袭能力相对减弱(P＜0.05),而细胞凋亡率[(32.1±2.1)％]较未转染组[(18.8±1.2)％]、空白对照组[(18.6±1.1)％]和抑制物转染组[(16.4±1.9)％]增加(P＜0.05),细胞周期S期增多达(36.7±3.6)％,出现S期阻滞.结论 miR-30a可明显抑制胃癌细胞株SGC7901的增殖,促进其凋亡,抑制其迁移及侵袭能力.
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微小RNA-30a在老年特发性肺间质纤维化患者肺泡灌洗液中的表达及其下游靶基因预测
目的 检测老年特发性肺间质纤维化(IPF)患者肺泡灌洗液中微小RNA(miRNA.miR)-30a的表达,并对其进行潜在靶基因预测和验证.方法 选择我院呼吸内科IPF患者32例为观察组,与观察组年龄和性别相匹配的健康体检者16例为对照组.提取分离所有受试者肺泡灌洗液中的miRNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法,检测miR-30a的表达水平,运用miRanda、PicTar和TergetScan等靶基因预测分析软件及其他生物信息学方法,筛选miR-30a潜在调控的靶基因,并对关键基因进行验证.结果 与对照组比较,71.8％ (23/32)的IPF组中miR-30a表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01).预测的56个交集靶基因涉及到离子通道、细胞凋亡、细胞分化、信号传导、免疫自噬等通路,并检验确证miR-30a与转化生长因子-β(TGF-β)激酶1(TAK1)结合蛋白3(TAB3)存在直接的调控关系.结论 miR-30a在IPF患者肺泡灌洗液中低表达,由此产生的基因TAB3高表达可能是导致纤维化加剧的关键因素之一.
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微小RNA-30a在乳腺癌组织中的表达及其临床意义
目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-30a在乳腺癌组织中的表达及其临床意义.方法 搜集46例具有完整临床病理资料及5年以上随访资料的石蜡包埋乳腺癌组织及其配对癌旁组织的病例.抽提总RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术检测miR-30a在乳腺癌及其癌旁组织中的表达水平,并分析其与临床病理特征和患者预后的关系.结果 36例癌组织中miR-30 mRNA的相对表达水平为4.22±6.37,显著低于配对癌旁组织中miR-30a的表达(12.36±23.77,P＜0.01).乳腺癌组织中的miR-30a表达水平下调与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移、雌激素受体(ER)以及孕激素受体(PR)表达明显相关(P＜0.05).Kaplan-Meier生存分析表明,miR-30a高表达组平均生存时间为92个月[95％可信区间(CI):87 ～ 109],低表达组平均生存时间为70个月(95％ CI:57 ～ 83),两组差异有统计学意义(x2=8.092,P＜0.01).Cox回归分析表明miR-30a低表达是乳腺癌预后不良的独立指标[风险比(HR)=4.07,95％ CI:2.89～ 5.26,P＜0.05].结论 miR-30a在乳腺癌组织中表达下调,与乳腺癌患者预后不良相关.
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微小RNA-30a在肝纤维化中的表达及其影响
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-30a在肝纤维化中的表达及其对肝纤维化的影响.方法 通过C57BL/6小鼠胆管结扎(对照组10例,胆管结扎组15例)和10 ng/ml转化生长因子-β1(TGF-β1)处理肝星状细胞(LX-2和HSC-T6)分别构建体内和体外肝纤维化模型.通过转染miR-30a mimics和miR-30a agomir分别在肝星状细胞和小鼠体内过表达miR-30a.提取总RNA和全蛋白进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot实验检测miR-30a、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(collagen Ⅰ)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1).通过苏木素-伊红(HE)染色、胶原纤维染色(Masson染色)检测肝组织纤维化程度.结果 RT-PCR检测10例对照组和15例胆管结扎组小鼠肝脏miR-30a相对表达水平(2.037 ±0.256,n=10;1.007 ±0.126,n=15;P＜0.01).10 ng/ml TGF-β1处理肝星状细胞24h和48 hmiR-30a相对表达水平(LX-2:24 h,0.578±0.055,48 h,0.585±0.048;HSC-T6:24 h,0.698±0.055,48 h,0.610±0.033),明显低于对照组(LX-2:1.013±0.080;HSC-T6:1.001±0.013,P＜0.05),表明miR-30a在体内和体外诱导的肝纤维化模型中表达下降.通过miR-30a mimics转染肝星状细胞株诱导细胞内过表达miR-30a、α-SMA相对表达水平(LX-2:对照组1.024±0.106,miR-30a高表达组0.464±0.021,P＜0.05;HSC-T6:对照组1.031±0.095,miR-30a高表达组0.352±0.042,P＜0.05).通过尾静脉注射miR-30a agomir在小鼠体内高表达miR-30a,胆管结扎预处理小鼠α-SMA相对表达水平(对照组2.618±0.116,miR-30a高表达组1.207±0.197,P＜0.05).表明过表达miR-30a能够抑制体内和体外肝纤维化进程.结论 miR-30a在肝纤维化中表达下降,过表达miR-30a能抑制肝纤维化进程.
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微小RNA-30a通过靶向调控FOXA1的表达抑制肝细胞癌细胞增殖
目的 探索微小RNA-30a(miR-30a)在肝细胞癌(HCC)中的表达及调控HCC细胞增殖的相关分子机制. 方法 收集配对的HCC及癌旁组织30对,分别采用实时荧光定量PCR和Western印迹法检测叉头框蛋白A1 (FOXA1) RNA和蛋白表达,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测HepG2细胞增殖,萤光素酶报告基因检测验证miR-30a与FOXA1的靶点关系,MTT和Western blot法检测转染miR-30a后HepG2细胞增殖及FOXA1蛋白的表达.两组数据分析比较采用t检验,多组数据分析比较采用单因素方差分析,P＜ 0.05为差异有统计学意义.结果 miR-30a在HCC组织中的相对表达量为1.049±0.380显著低于癌旁组织的1.982±1.013,t=3.985,P＜0.001,差异有统计学意义.过表达miR-30a 72h后,空白对照组HepG2细胞增殖能力为0.821±0.006,miR-30a-NC组为0.816±0.013,miR-30a组为0.546±0.020,过表达miR-30a能显著降低HepG2细胞的增殖,F=3.396,P＜0.05,差异有统计学意义.FOXA1是miR-30a的靶基因,其蛋白表达被miR-30a负调控,荧光素酶的活性在野生型FOXA1-3'UTR载体中的表达量为1.221±0.024,在突变型FOXA1-3'UTR载体中的表达量为2.658±0.031,F=6.737,P＜0.05,差异有统计学意义.过表达miR-30a能显著抑制FOXA1在HepG2细胞中的蛋白水平,FOXA1在空白对照组相对表达量为1.019±0.016,miR-30a-NC组为1.022±0.017,miR-30a组为0.227±0.021,F=45.43,P＜0.05,差异有统计学意义.上调FOXA1的蛋白水平能够逆转miR-30a对HepG2细胞增殖的抑制作用,HepG2细胞的增殖能力在miR-30a组为0.524±0.023,在miR-30a+FOXA1组为0.843±0.019,t=2.507,P＜0.05,差异有统计学意义.结论 miR-30a对HCC细胞增殖的抑制作用是通过负调控FOXA1的表达而实现.
