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MicroRNAs在未分化甲状腺癌侵袭转移中的调控作用
上皮细胞受到细胞外因子刺激后向间质细胞转化的现象与肿瘤的侵袭转移密切相关.在此过程中上皮细胞的极性丧失、迁移和运动能力增强,同时上皮表型丢失并逐渐获得间质表型.目前的研究表明,两类微小RNA(microRNAs),即miR-200和miR-30家族的表达改变可影响未分化甲状腺癌(ATCs)的侵袭性.同时,microRNAs也可通过调控E-钙黏蛋白的表达及TGF-β信号转导通路,调节间充质-上皮转化/上皮-间充质转化(MET/EMT)过程,影响ATCs的侵袭性.
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辣椒素对膀胱癌细胞侵袭转移的影响
目的 探讨辣椒素对膀胱癌细胞系253J与RT112侵袭转移的影响.方法 以0、100、200 μmol/L辣椒素分别作用于人膀胱癌253J与RT112细胞0、12、24 h,采用MTT法检测253J与RT112细胞活力,划痕实验检测253J与RT112细胞迁移能力,Transwell法检测253J与RT112细胞侵袭能力.Western blotting法检测上皮间充质转化相关蛋白(E-钙黏蛋白,N-钙黏蛋白,波形蛋白)和Nrf2相关蛋白的表达水平.结果 与0 μmol/L比较,在100、200 μmol/L辣椒素作用下,253J与RT112各组细胞活性降低(P<0.01),侵袭能力下降(P<0.01),迁移能力也下降(253J:P<0.01;RT112:P=0.026或P=0.014).细胞E-钙黏蛋白、C-nrf2表达上升,而波形蛋白与N-nrf2蛋白表达减弱,并呈剂量-时间依赖性.结论 辣椒素可抑制人膀胱癌细胞的侵袭与转移,该作用可能与Nrf2的调节有关.
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整合素连接激酶在缺氧晶状体上皮细胞中的表达变化及其对细胞上皮-间充质转化的影响
目的 观察整合素连接激酶(ILK)在缺氧晶状体上皮细胞(HLECs)中的表达变化及其对细胞上皮-间充质转化(EMT)的影响.方法 体外培养HLEC-B3,以不同浓度CoCl2培养液进行干预,CCK-8法筛选佳的CoCl2作用浓度.以100μmol/L的CoCl2作用于HLECs建立缺氧模型,分别于缺氧0、6、12、24、48 h时以Western blotting法检测HLECs中的ILK.将HLECs分为CoCl2组、ILK抑制剂组、对照组,其中CoCl2组和ILK抑制剂组加入100μmol/L的CoCl2制作缺氧模型,ILK抑制剂组用ILK特异性抑制剂QLT0267(10 nmol/L)预处理1 h,对照组常规培养.三组继续培养24 h后采用Western blotting法检测细胞中的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤维连接蛋白(FN),采用实时荧光定量PCR法检测α-SMA、FN mRNA.结果 缺氧6、12、24、48 h时ILK蛋白相对表达量均增高,其中缺氧12、24 h时ILK蛋白相对表达量高于缺氧6、48 h时(P均<0.05).CoCl2组细胞中α-SMA、FN蛋白相对表达量高于对照组,ILK抑制剂组细胞中α-SMA、FN蛋白相对表达量低于CoCl2组(P均<0.01).CoCl2组细胞中α-SMA、FN mRNA相对表达量高于对照组,ILK抑制剂组细胞中α-SMA、FN mRNA相对表达量低于CoCl2组(P均<0.01).结论 CoCl2诱导的缺氧HLECs中ILK表达增高;抑制ILK表达后,HLECs中EMT标志蛋白表达下调,EMT过程受到抑制.
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Wnt信号通路阻滞剂DKK-1对人结肠癌细胞HCT116侵袭能力的影响
目的 探讨Wnt信号通路阻滞剂DKK-1对人结肠癌细胞HCT116侵袭能力的影响及其分子机制.方法 将HCT116细胞随机分为观察组和对照组,分别给予DKK-1 100 ng/mL及等量细胞培养液继续培养48 h.采用Transwell侵袭实验观测肿瘤细胞侵袭能力的变化,分别采用Western blot法、RT-PCR法检测肿瘤细胞中Wnt信号通路关键基因β-catenin、EMT调控因子Snail及上皮细胞标记物E-cadherin、间质细胞标记物Vimentin的蛋白及mRNA表达,结果 观察组穿膜细胞数为(45.29±6.25)个/HP,低于对照组的(76.36±8.32)个/HP,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,观察组HCT116细胞中β-catenin、Snail、Vimentin蛋白及mRNA表达水平均降低,E-cadherin蛋白及mRNA表达水平增高(P均＜0.05).结论 Wnt信号通路阻滞剂DKK-1可能通过抑制肿瘤细胞上皮-间充质转化过程,进而降低人结肠癌细胞HCT116的侵袭能力.
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同源盒A13在胃癌组织中表达对SGC-7901细胞增殖和侵袭的影响
目的 探讨胃癌组织及癌旁组织中同源盒A13(homeobox gene A13,HOXA13)表达差异,及下调胃癌SGC-7901细胞HOXA13基因表达对细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 取109例胃癌患者手术切除的胃癌组织和癌旁正常组织,采用免疫组织化学法检测HOXA13蛋白表达;取对数生长期SGC-7901细胞分为转染组(转染siRNA-HOXA13)、阴性对照组(转染siRNA-NC)和空白对照组(不作任何处理),采用MTT法检测转染12、24、48、72、96 h时细胞增殖能力,Transwell法检测转染后培养48 h时细胞侵袭能力,Western blot法检测转染后培养48 h时细胞HOXA13、Twist、E-cadherin和Vimentin蛋白表达.结果 胃癌组织HOXA13蛋白阳性表达率(75.23％)高于癌旁正常组织(33.94％)(P＜0.05);HOXA13蛋白阳性表达率在进展期胃癌(82.98％)、低分化程度(84.93％)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(86.27％)、有淋巴结转移者(84.38％)均高于早期胃癌(26.67％)、中高分化程度(55.56％)、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(65.52％)、无淋巴结转移者(62.22％)(P＜0.05),在性别、年龄、肿瘤直径上差异均无统计学意义(P＞0.05);转染组转染后培养24、48、72、96 h时吸光度值低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);转染组转染后培养48 h时侵袭细胞数(97.14±10.03)个]均较阴性对照组[(115.39±5.77)个]和空白对照组(125.11±12.45)个]少(P＜0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);转染组转染后培养48 h时细胞HOXA13、Twist和Vimentin蛋白表达(0.24±0.05、0.34±0.07、0.36±0.04)均低于阴性对照组(0.87±0.11、0.75±0.02、0.75±0.07)和空白对照组(0.88±0.05、0.76±0.05、0.72±0.06) (P＜0.05),E-cadherin蛋白表达(0.67±0.08)高于阴性对照组(0.33±0.06)和空白对照组(0.35±0.04) (P＜0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 胃癌组织中HOXA13蛋白呈高表达,其表达程度与肿瘤恶性程度有关;下调SGC-7901细胞HOXA13基因表达可抑制细胞增殖和侵袭能力.
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MG132对人晶状体上皮细胞增生、移行和上皮-间充质转化的抑制作用
背景 晶状体后囊膜混浊(PCO)发生的主要病理机制是白内障术后后囊膜残留的晶状体上皮细胞(LECs)的增生、移行和分化,研究发现蛋白酶体抑制剂MG132可抑制牛LECs的增生,但对人LECs的生物学影响尚不明确. 目的 研究蛋白酶体抑制剂MG132对体外培养的人LECs增生、移行和上皮-间充质转化(EMT)的抑制作用.方法 收集白内障超声乳化摘出术中连续环形撕囊的囊膜片用组织块培养法进行原代培养并传代,取第2代或第3代LECs进行常规消化,调整细胞密度至5×105个/ml,以200 μl/孔接种至96孔板常规培养24 h,分别加入成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、MG132或MG132+FGF-2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用MTT法测定吸光度(A490)值,计算LECs的增生率.在移行能力测定中,应用传代的人LECs分别加入FGF-2、MG132或MG132+FGF-2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,用无菌棉棒在细胞层中划出细胞裸露区,继续培养24 h,计数移行至裸露区的细胞,评估细胞移行率.在传代的人LECs培养液中分别加入转化生长因子-β2(TGF-β2)、MG132或MG132+TGF-β2,以基础培养液培养的细胞作为对照组,培养24 h后用免疫组织化学法检测细胞质中纤维连接蛋白(FN)的表达. 结果 对照组、FGF-2组、MG132组和MG132+FGF-2组的LECs增生值(A490)分别为0.582±0.020、0.723 ±0.010、0.434±0.011和0.465±0.008,总体差异有统计学意义(F=110.482,P＜0.01),FGF-2组LECs增生值明显高于对照组,MG132组和MG132+FGF-2组的LECs增生值明显低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).对照组、FGF-2组、MG132组和MG132+FGF-2组LECs移行数目分别为8.67±1.08、11.58±1.59、2.67±0.09和2.75±0.09,差异有统计学意义(F=34.301,P＜0.01),其中FGF-2组LECs的移行数明显多于对照组,而MG132组和MG132+FGF-2组LECs移行数明显少于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,MG132组LECs的增生率和移行率分别降低25.4％和75.0％,FGF-2组LECs增生率和移行率分别增加24.2％和33.6％,MG132+FGF-2组LECs的增生率和移行率分别下降20.1％和68.3％.对照组、TGF-β2组、MG132组和MG132+TGF-β2组LECs中FN表达量(A值)分别为1.242±0.023、2.329±0.113、1.043±0.021和1.163±0.018,差异有统计学意义(F=113.752,P＜0.01),TGF-β2组LECs中FN表达量明显高于对照组,而MG132组和MG132+TGF-β2组明显低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).TGF-β2可以诱导人LECs转分化,FN表达增强;MG132与TGF-β2同时存在时可以减弱人LECs转分化,FN表达下降. 结论 MG132抑制体外培养的人LECs的增生与移行,并可阻止TGF-β2诱导的人LECs的EMT.
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高糖刺激对人晶状体上皮细胞中KLF6基因表达的影响
背景 上皮-间充质转化(EMT)是后发性白内障的主要病理机制.锌指蛋白Kruppel样因子6( KLF6)在糖尿病肾病近曲小管中的表达增加,参与并促进转化生长因子-β(TGF-β)诱导的EMT.目的 观察高浓度葡萄糖刺激对人晶状体上皮细胞(LECs)中KLF6及其调控的靶基因转化生长因子β1(TGFB1)、转化生长因子βⅠ型受体(TGFBR1)、Ⅰ型胶原α1链(COLIAl)、热休克蛋白47(HSP47)等表达的影响.方法 用高浓度D-葡萄糖刺激人LECs系SRA01/04,运用荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot法检测KLF6mRNA及蛋白水平,同时运用荧光定量PCR检测KLF6下游靶基因TGFBI、TGFBR1、COLlA1、HSP47的mRNA 表达水平.结果 与对照组(5.5 mmol/L)比较,高浓度葡萄糖(22.2、44.4、66.6 mmol/L)刺激后的t-KLF6和wt-KLF6 mRNA水平明显上升,差异均有统计学意义(F=72.53、42.02,P＜0.01)；结合人体血糖范围,在进一步实验中选择22.2 mmol/L作为葡萄糖刺激浓度.各时间点t-KLF6和wt-KLF6 mRNA水平之间的差异有统计学意义(F=100.12、125.52,P＜0.01),两者mRNA水平均于处理后12h达到高峰,24 h则开始出现下降,48 h下降更为明显.Western blot结果显示,对照组(0 h)KLF6蛋白表达很弱,高糖处理24 h后的细胞表达KLF6蛋白增加,而处理48 h后的表达量进一步增加.随着KLF6表达的增加,TGFB1、TGFBR1、COLlA1、HSP47的mRNA水平在高糖刺激12h时明显上升,但24 h后开始下降,48 h时进一步下降至接近对照组水平(F=6.73、162.35、64.39、12.05,P＜0.05). 结论 高浓度葡萄糖可诱导人LECs上调KLF6基因的表达,并短暂促进了其下游与EMT密切相关的靶基因TGFB1、TGFBR1、COLlA1、HSP47等的转录表达.
关键词： 人晶状体上皮细胞 高糖 Kruppel样因子6 上皮-间充质转化 -
N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对高糖诱导足细胞损伤的保护作用及机制
目的 高糖可诱导足细胞损伤,促进糖尿病蛋白尿的产生及肾脏纤维化的进展.N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)是由血管紧张素转化酶水化的一种生理性四肽,可抑制肾脏纤维化.本文通过体外培养条件永生性小鼠足细胞,探讨AcSD-KP对高糖诱导足细胞损伤的保护作用及可能机制.方法 体外培养条件永生性小鼠足细胞,采用高糖(30 mmol/L)刺激48 h,同时予AcSDKP干预.分为正常对照组(常规低糖培养基培养)、高糖组、高糖+ AcSDKP组.采用免疫荧光法检测各组细胞足细胞特异性标记物nephrin的表达改变,采用免疫印迹法检测各组足细胞纤连蛋白(fibronectin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达改变,采用免疫荧光检测各组足细胞骨架,采用流式细胞仪检测各组足细胞凋亡率.结果 高糖可减少足细胞nephrin表达,AcSDKP处理后足细胞nephrin表达有所恢复.高糖组可促进足细胞间充质标记物fibronectin、α-SMA的表达升高,AcSDKP可抑制高糖刺激下足细胞fibronectin、α-SMA的表达.高糖可诱导足细胞骨架出现紊乱、重组,促进足细胞黏附性下降,诱导足细胞凋亡,AcSDKP可抑制足细胞骨架紊乱重组、改善足细胞黏附性、抑制足细胞凋亡.结论 AcSDKP可对高糖诱导的足细胞损伤发挥保护作用,其机制可能与逆转足细胞上皮-间充质转化,稳定细胞骨架、恢复足细胞黏附性及抑制足细胞凋亡有关.
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白细胞介素-6诱导CD44＋CD24－／low肿瘤干细胞生成促进乳腺癌MCF7细胞辐射抵抗的研究
目的：上皮-间充质转化（EMT）能诱导 CD44＋CD24－／low乳腺癌干细胞的产生，白细胞介素-6（IL-6）是很强的 EMT 诱导因子，探讨 IL-6是否通过诱导 CD44＋CD24－／low细胞的产生，从而促进乳腺癌 MCF7细胞的辐射抵抗。方法含50 ng／ml IL-6的培养基培养 MCF7细胞，流式细胞术检测 CD44＋CD24－／low乳腺癌干细胞标记的变化，实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）及Western blot 检测 EMT 标记分子的表达水平，进一步利用流式细胞术从诱导组中分选出 CD44＋CD24－／low细胞，克隆形成实验检测分选后细胞的辐射抵抗能力。结果IL-6能诱导 MCF7细胞发生间充质样转化，诱导5 d 后 CD44＋CD24－／low细胞显著富集，诱导形成的 CD44＋CD24－／low细胞的辐射抵抗能力显著提高。结论IL-6诱导了 CD44＋CD24－／low 乳腺癌干细胞的产生，从而促进MCF7细胞的辐射抵抗。
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程序性死亡受体配体-1促进食管癌细胞上皮-间充质转化的研究
目的 探讨程序性死亡受体配体-1(PD-L1)促进食管癌细胞Eca-109上皮-间充质转化(EMT)的作用机制.方法 选用人食管癌细胞Eca-109细胞,经转染重组慢病毒载体分别构建PD-L1下调表达(LV-PD-L1-shRNA)、PD-L1过表达(LV-PD-L1-WT-OE)、PD-L1胞内段缺失型过表达(LV-PD-L1-TN-OE)的稳定表达细胞株,以及对照组LV-NC及LV-Vector-Ctrl细胞株,经PD-1融合蛋白或对照IgG分别刺激上述5种细胞株,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测EMT相关标物上皮型钙黏蛋白(E-cad)、神经型钙黏蛋白(N-cad)、E盒结合锌指蛋白1(Zeb1)和波形蛋白(Vim)等mRNA表达,Western blot检测EMT相关标物E-cad、N-cad、Zeb1、Vim等蛋白表达水平.结果 成功构建LV-PD-L1-shRNA、LV-PD-L1-WT-OE、LV-PD-L1-TN-OE、LV-NC及LV-Vector-Ctrl细胞株.mRNA水平,LV-PD-L1-shRNA与LV-NC比较,E-cad显著上调、N-cad、Zeb1及Vim显著下调(P＜0.05);LV-PD-L1-WT-OE与LV-Vector-Ctrl比较,E-cad显著下调、N-cad、Zeb1及Vim显著下调(P ＜0.01);LV-PD-L1-TN-OE与LV-PD-L1-WT-OE比较,E-cad显著上调、N-cad、Zeb1及Vim显著下调(P＜0.01).选用PD-1融合蛋白(5μg/ml)对LV-PD-L1-shRNA、LV-PD-L1-WT-OE、LV-PD-L1-TN-OE、LV-NC、LV-Vector-Ctrl等细胞株刺激24 h,结果表明,LV-PD-L1-shRNA与LV-NC比较,N-cad及Zeb1表达水平显著降低(P＜0.05),LV-PD-L1-WT-OE与LV-Vector-Ctrl比较,N-cad、Zeb1及Vim表达水平显著增加(P＜0.05),LV-PD-L1-WT-OE与LV-PD-L1-TN-OE比较,Zeb1及Vim表达水平显著增加(P＜0.05),但LV-PD-L1-TN-OE及LV-Vector-Ctrl经PD-1融合蛋白刺激后,差异无统计学意义.结论 食管癌细胞异常表达PD-L1与EMT密切相关,PD-L1分子胞内段在调节食管癌细胞EMT过程中发挥重要作用.
关键词： 程序性死亡受体配体-1 食管癌 上皮-间充质转化 -
14-3-3ζ协同非典型蛋白激酶C-ι经上皮-间充质转化促进胆管癌侵袭转移
目的 探讨14-3-3ζ协同非典型蛋白激酶C-ι(aPKC-ι)促进胆管癌侵袭转移的机制.方法 应用免疫组织化学、Western blot和实时定量聚合酶链反应检测14-3-3ζ和aPKC-ι在64例胆管癌组织中的表达,Kaplan-Meier和COX多因素回归分析胆管癌预后影响因素.转化生长因子-β1(TGF-β1)构建胆管癌细胞上皮-间充质转化(EMT)模型,干扰14-3-3ζ或aPKC-ι的表达,检测EMT标志物的变化.抑制14-3-3ζ表达后,Transwell侵袭试验、划痕试验、克隆平板试验检测胆管癌细胞侵袭转移能力.结果 14-3-3ζ和aPKC-ι在癌组织中均呈高表达(56.25％,36/64;51.56％,33/64),呈正相关(r=0.406,P=0.001).两者低表达组的总体生存率显著高于过表达组(14-3-3ζ:x2=10.140,P=0.001;aPKC-ι:x2=12.575,P=0.000).14-3-3ζ和aPKC-ι均是胆管癌预后的独立影响因素.干扰两者的表达抑制细胞EMT相关标志物改变,胆管癌细胞侵袭、增殖和转移能力均受到抑制.结论 14-3-3ζ与aPKC-ι结合,协同促进胆管癌EMT及侵袭转移.
关键词： 14-3-3ζ 非典型蛋白激酶C-iota 胆管癌 上皮-间充质转化 侵袭转移 -
MLN4924对人肝癌细胞HepG2侵袭和迁移的影响及其机制
目的 观察选择性NEDD8活化酶(NAE)抑制剂MLN4924对人肝癌细胞HepG2侵袭和迁移的影响,探讨其相关机制.方法 将肝癌细胞株HepG2、Hep3B、SMMC-7721分别分为对照组与MLN4924干预组.细胞毒性/增殖检测试剂盒(CCK-8)方法检测细胞活性及半抑制浓度(IC50)值,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,细胞划痕和Transwell实验检测MLN4924对细胞侵袭和迁移的影响,Western blot法检测上皮-间充质转化(EMT)中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达变化.结果 CCK-8方法发现3种肝癌细胞均受到抑制,其中HepG2对MLN4924敏感,ICso值为3.34 μmol/L.流式细胞仪测得MLN4924能够明显促进肝癌细胞HepG2凋亡,细胞划痕实验和Transwell实验证实MLN4924能够明显抑制肝癌细胞HepG2侵袭和迁移,并且具有剂量依赖性(P=0.001).此外,用0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L的MLN4924处理24h后E-cadherin相对蛋白表达量分别为0.313 ±0.005、0.594 ±0.016、0.431 ±0.002、0.780±0.019、1.000±0.015,Vimentin相对蛋白表达量分别为1.000 ±0.012、1.158±0.035、1.087±0.076、0.635±0.028、0.351±0.010.结论 MLN4924可抑制肝癌细胞HepG2的增殖,促进其凋亡,并通过EMT抑制了肝癌细胞HepG2的侵袭和迁移.
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小干扰RNA沉默同源盒基因B9对前列腺癌细胞侵袭、迁移能力的影响
目的 观察小干扰RNA(siRNA)靶向沉默同源盒基因B9(HOXB9)基因对前列腺癌PC3和DU145细胞侵袭、迁移能力的调控.方法 将HOXB9siRNA、negative control (NC) siRNA通过Silentfect转染至PC3和DU145细胞株将细胞分为两组(si-HOXB9组和si-NC组),通过Western blot方法检测HOXB9基因表达变化;Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力;采用Western blot法检测两细胞株(PC3、DU145)转染后上皮-间充质转化(EMT)相关分子标志物:N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达变化.结果 转染HOXB9 siRNA后,PC3和DU145细胞内HOXB9相对表达水平明显下调,差异有统计学意义(PC3:si-HOXB9组(0.440±0.007)对比si-NC组(0.858±0.024,P=0.001);DU145:si-HOXB9组(0.480±0.009)对比si-NC组(0.960±0.014,P=O.001).两细胞株si-HOXB9组N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平较其si-NC组明显降低,E-cadherin则显著升高.Transwell侵袭、迁移实验显示转染后两细胞株的侵袭(P=0.005、0.002)和迁移(P =0.001、0.001)能力明显减弱.结论 HOXB9siRNA能特异性下调前列腺癌PC3和DU145细胞中HOXB9的表达,并降低细胞的侵袭和迁移能力,其作用机制可能与EMT相关.
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Oct4B1基因过表达增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂的耐药性及其机制
目的 探讨Oct4B1基因过表达是否增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂耐药性及其机制,以及与诱导细胞上皮-间充质转化(EMT)过程的关系.方法 实验分组:将SW620细胞随机平均分为实验组及对照组、实验组(SW620-Oct4B1):转染带G418抗性的Oct4B1过表达质粒;对照组(SW620-NC):转染带G418抗性的阴性对照质粒;筛选合适浓度G418建立稳定转染细胞株.对稳定转染两组细胞作如下检测:(1)噻唑蓝(MTT)法检测细胞对不同浓度奥沙利铂的敏感性;(2)Western blot检测P-糖蛋白(P-gp)及EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达;(3)划痕实验检测12、24 h迁移能力;(4)Transwell小室检测24 h时侵袭能力.结果 实验组与对照组比较:(1)对奥沙利铂敏感性实验组明显低于对照组(t =8.889、5.427、9.678、4.459、5.362,P=0.001、0.006、0.001、0.011、0.006);(2)P-gp表达两组分别为0.401、0.439、0.419(0.420±0.020)及0.099、0.110、0.120(0.110 ±0.010),实验组明显高于对照组(t=24.723,P=0.000);(3)12 h伤痕愈合率分别为32.196％、32.382％、33.441％ (32.670 ±0.670)％及23.049％、25.286％、23.674％ (24.000±1.150)％,实验组明显高于对照组(f=11.245,P=0.001);24 h伤痕愈合率分别为67.048％、68.650％、66.291％ (67.330±1.200)％和49.161％、47.632％、53.203％(50.000 ±2.880)％.实验组显著高于对照组(t=9.620,P=0.001);(4)24 h两组透膜细胞数分别为400.105、407.500、384.300(397.300±11.850)个及205.641、186.244、215.02(202.300±14.680)个,实验组显著多于对照组(t=17.905,P=0.000);(5)E-cadherin表达两组分别为0.186、0.190、0.223(0.200 ±0.020)及0.530、0.531、0.529(0.530 ±0.010),实验组明显低于对照组(t=28.143,P=0.000),而N-cadherin表达两组分别为0.949、0.935、0.906(0.930±0.020)及0.687、0.648、0.675(0.670±0.020),实验组显著高于对照组(t=15.181,P=0.000).结论 Oct4B1基因过表达能增强结直肠癌SW620细胞对奥沙利铂耐药性,其机制可能与诱导细胞EMT过程有关.
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CAPZA1在人胰腺癌侵袭转移中的作用及机制
目的 观察CAPZA1在胰腺癌组织中的表达及与预后的关系,探讨CAPZA1调控胰腺细胞的侵袭转移的作用及机制.方法 采用免疫组织化学法检测CAPZA1和上皮-间充质转化(EMT)标志物在胰腺癌组织中的表达,统计分析胰腺癌患者的预后情况.Western blot、实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测胰腺癌细胞中CAPZA1和EMT标志物的表达.Transwell、细胞计数试剂盒(CCK-8)检测胰腺癌细胞的迁移、侵袭和增殖.结果 CAPZA1表达水平与胰腺癌的生物学特性及患者的预后呈负相关.CAPZA1的表达水平与胰腺癌的侵袭转移潜能呈负相关,抑制CAPZA1的表达可促进胰腺癌的侵袭转移(192.0±13.8比153.0±17.1,P=0.004),而过表达CAPZA1可抑制胰腺癌的侵袭转移(107.0±18.5比153.0±17.1,P=0.004).过表达CAPZA1可以上调EMT标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin,0.76±0.09比0.57 ±0.14,P=0.034)而抑制N-钙黏蛋白(N-cadherin,0.53 ±0.12比0.74±0.10,P=0.017)和波形蛋白(Vimentin,0.56±0.20比0.93±0.19,P=0.017)的表达.结论 CAPZA1可通过调控肌动蛋白骨架的装配,从而抑制胰腺癌细胞EMT,降低胰腺癌细胞的侵袭能力.
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转化生长因子-β1诱导人肺腺癌细胞侵袭迁移的机制
目的 探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)影响肺腺癌细胞侵袭迁移,以及对上皮-间充质转化(EMT)和自噬的影响.方法 Transwell检测体外TGF-β1对肺腺癌细胞A549和SK-LU-1迁移与侵袭能力的影响;免疫荧光检测TGF-β1引起的A549细胞自噬水平变化;Western blot实验检测在A549细胞中TGF-β1对EMT标志分子及自噬调控基因表达的影响.结果 在A549和SK-LU-1细胞中,sh-TGF-β1干扰效率约为60％,GV358-TGF-β1过表达组过表达效率均在4倍以上;迁移实验结果显示,A549细胞中,随机干扰对照组(shNC组)迁移率为1.02±0.06,TGF-β1过表达组为5.14±0.43(t=16.440,P=0.004);SK-LU-1细胞中,shNC组迁移率为1.04±0.08,TGF-β1过表达组为4.92±0.48(t=13.810,P=0.005),差异均有统计学意义;侵袭实验结果显示,A549细胞中,随机干扰对照组(shNC组)侵袭率为0.96±0.07,TGF-β1过表达组为4.28 ±0.51(t=11.170,P =0.007);SK-LU-1细胞中,shNC组侵袭率为1.03±0.05,TGF-β1过表达组为4.11±0.36(t=10.410,P=0.009),差异均有统计学意义;免疫荧光实验结果可见,与对照组比较,TGF-β1过表达组点状分布的自噬小体数目明显增多(t=22.340,P=0.000),荧光强度显著增强;Westem blot实验结果显示,TGF-β1过表达组E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达量明显减少,波形蛋白(Vimentin)、Twist、Snail的表达显著增加;自噬相关蛋白Beclin1表达上调,磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达上调;而TGF-β1干扰组的结果则与过表达组相反.结论 在肺腺癌细胞中,TGF-β1阳性表达诱导的自噬和EMT可能与其增强肺腺癌细胞侵袭迁移能力相关.
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转录因子性别决定区Y框蛋白2在肝癌组织的表达及其对增殖及侵袭迁移能力的影响
目的 观察转录因子性别决定区Y框蛋白2(SOX2)在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响.方法 利用免疫组织化学方法分析SOX2在32例肝癌及其癌旁组织中的表达;在肝癌细胞株SMMC-7721中通过细胞增殖、侵袭等功能实验分析SOX2通过上皮-间充质转化(EMT)促进转移复发的具体机制.结果 在人肝癌组织标本中SOX2较其配对癌旁组织及正常组织表达上调,其在癌组织、癌旁组织及正常肝组织中SOX2的阳性率分别为73.8％、32.5％及12.4％ (P =0.008、0.006).在体外克隆形成实验结果示pWPI-SOX2转染组细胞克隆形成数为(654.9±39.4)个,显著高于对照组(232.7±19.4)个(P=0.000).Transwell小室实验结果显示它能促进肝癌细胞侵袭能力(P =0.003).慢病毒转染的SOX2高表达SMMC-7721肝癌细胞株发生EMT,上皮化表型E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白(ZO-1)的表达下调和间质化表型N-钙黏蛋白(N-cadherin)和纤维连接蛋白(Fn)表达上调.结论 SOX2表达与肝癌的发生、发展密切相关,其具体机制可能是通过诱导EMT促进肝癌的转移复发.
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转化生长因子-β1与其受体阻断剂作用于人胆管癌细胞株后对转化生长因子-Smad轴的影响
目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)相关信号通路在胆管癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用.方法 对胆管癌细胞株RBE细胞单独或联合应用TGF-β1及其受体阻断剂(TGFβRI)SB525334/SB431542,根据单独或联合用药共分为6个组.(1)观察细胞形态学改变.(2)Trasswell法检测RBE细胞迁移及侵袭性变化.(3)Western blot检测Smad4、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)及Slug的蛋白表达变化.计量资料采用均数±标准差(x-±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA).结果 (1)TGF-β1引发RBE细胞的形态由上皮样向间质样转变.(2) Transwell法迁移性改变:空白对照组为(85.66±7.76)个,TGF-β1组为(118.17±12.69)个,SB431542组为(53.00±5.51)个、TGF-β1+ SB431542组为(86.33±9.67)个,SB525334组为(52.50±7.45)个,TGF-β1+ SB525334组为(81.00±7.62)个.TGF-β1组比空白对照组,迁移细胞数目明显增多(P=0.000),SB525334组、SB431542组比空白对照组,迁移细胞数目明显减少(P值均为0.000).Transwell法检测侵袭性改变:空白对照组为(73.83±9.47)个,TGF-β1组为(127.83±7.33)个,SB431542组为(59.83±7.28)个、TGF-β1+ SB431542组为(79.67±7.31)个,SB525334为(55.67±7.26)个,TGF-β1+ SB525334组为(76.00±8.51)个.TGF-β1组比空白对照组,侵袭细胞数目明显增多(P=0.000),SB525334组、SB431542组比空白对照组,侵袭细胞数目明显减少(P值分别为0.000、0.003).(3)Western blot实验中TGF-β1组中Smad4蛋白的表达水平较空白对照组明显增高,差异有统计学意义(P =0.000).E-cadherin、N-cadherin、Slug蛋白的表达水平在TGF-β1组与空白对照组中比较差异均有统计学意义(其P值分别为0.044、0.001、0.001);上述指标在SB431542组与空白对照组中比较差异均有统计学意义(其P值分别为0.001、0.000、0.000),其在SB525334组与空白对照组中比较差异均有统计学意义(其P值分别为0.001、0.000、0.000).结论 (1)TGF-β1可诱导RBE细胞的形态由上皮样向间质样转变.(2)TGF-β1可以促进REB细胞的迁移和侵袭作用,而TGFβRI可以阻断REB细胞的迁移和侵袭作用.(3)TGF-β1及TGFβRI能够影响N-cadherin、E-cadherin及Slug蛋白表达的变化:TGF-β1可促进N-cadherin、Slug蛋白表达的增加,促进E-cadherin蛋白表达的降低;TGFβRI可降低N-cadherin、Slug蛋白的表达,促进E-cadherin蛋白表达.
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阿帕替尼通过抑制上皮-间充质转化阻遏肝癌细胞侵袭和转移的研究
目的 观察抗血管生成靶向药物阿帕替尼对肝癌细胞侵袭转移的影响,探讨其机制.方法 将肝细胞癌细胞株SMMC-7721分为对照组和阿帕替尼处理组,观察细胞形态学变化;通过细胞计数试剂盒(CCK-8)试验观察阿帕替尼对SMMC-7721细胞增殖的影响;划痕实验观察阿帕替尼对SMMC-7721细胞侵袭能力的影响;Transwell试验观察阿帕替尼对SMMC-7721细胞转移能力的影响;实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot检测上皮-间充质转化(EMT)相关基因CDH1、CDH2、TJP1、VIM、E盒结合锌指蛋白1(ZEB1)、CLDN1、SNAI2、SNAI1、CTNNB1的表达变化.结果 阿帕替尼处理后SMMC-7721细胞发生上皮表型的改变,增殖、侵袭和转移能力均降低.Real-time PCR和Western blot结果显示经阿帕替尼处理后,SMMC-7721细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)和ZO-1蛋白表达升高,N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)、ZEB1、Slug表达降低,差异有统计学意义(CDH1,P=0.000;TJP1,P=0.002;CDH2,P=0.017;VIM,P=0.006;ZEB1,P=0.045;SNAI2,P=0.000).结论 阿帕替尼可抑制SMMC-7721细胞由上皮表型向间质表型转化(EMT),进而抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力.
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应激诱导磷酸化蛋白1调控分化抑制因子3表达在胃癌细胞上皮-间充质转化及侵袭迁移过程中的作用及其机制
目的 观察应激诱导磷酸化蛋白1(STIP1)通过调控分化抑制因子3(ID3)的表达在胃癌细胞上皮-间充质转化及侵袭迁移过程中的作用并探讨其机制.方法 Western blot和实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测胃癌细胞(BGC803)和正常胃黏膜细胞(GES-1)2株细胞中STIP1、ID3的mRNA及蛋白的表达.转染STIP1过表达载体和小干扰RNA (siRNA)感染序列至胃癌细胞,检测STIP1和ID3的表达.细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖活力,Transwell检测细胞迁移及侵袭,Western blot检测上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表达,并与阴性转染细胞比较.结果 STIPl mRNA和蛋白在BGC803的相对表达量分别为1.851±0.058,2.033±0.107,明显高于GES-1中的1.000±0.034,1.000±0.031(t=21.924,P=0.000;t=16.061,P=0.004).ID3 mRNA和蛋白在BGC803的相对表达量分别为1.629±0.063,2.374±0.096,明显高于GES-1中的1.000±0.025,1.000±0.029(t=16.074,P=0.004;t=23.731,P=0.002).转染STIP1过表达载体后ID3 mRNA的相对表达量为2.018±0.124,较对照组1.331±0.036(t =9.216,P=0.012)明显升高;转染48 h和72 h后细胞增殖水平明显高于对照组(t=10.594,P=0.002;t=8.269,P=0.004);侵袭细胞数、迁移细胞数较对照组明显增加(t=5.669,P=0.011;t =5.265,P=0.013);Vimentin的表达明显升高(t=7.410,P=0.005),E-cadherin明显降低(t=-5.821,P=0.010).转染STIP1 siRNA感染序列后ID3 mRNA的相对表达量为0.732±0.037,较对照组的1.252±0.051明显降低(t=-14.295,P=0.001);转染48 h、72 h后细胞增殖水平明显低于对照组(t=-19.851,P=0.000;t=-19.222,P=0.008);侵袭细胞数、迁移细胞数较对照组明显减少(t=-5.822,P=0.010;t=-4.859,P=0.017);Vimentin的表达明显降低(t=-6.244,P=0.008),E-cadherin明显升高(t=7.697,P=0.005).结论 STIP1调控ID3表达促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移和上皮-间充质转化.
关键词： 胃癌 应激诱导磷酸化蛋白1 分化抑制因子3 上皮-间充质转化
