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复方鳖甲软肝方对LPS刺激肾小管上皮细胞MMP9/TIMP1表达的影响
目的:研究复方鳖甲软肝方对肾小管上皮细胞LPS刺激不同时段表达MMP9、TIMP1的影响.方法:制备含药血清,将5%含药血清培养基加入体外培养的肾小管上皮细胞,分别于LPS刺激24 h及48 h采用免疫组化及Western blot方法检测各组MMP9、TIMP1的表达.结果:LPS刺激肾小管上皮细胞12 h后,细胞胞浆内MMP9活性逐渐增强;24h达到高峰;TIMP1于LPS刺激24 h逐渐增强,48 h达到高峰上.复方鳖甲软肝方降低24h时MMP9的表达,同时也降低48h时TIMP1的表达.结论:复方鳖甲软肝方含药血清能抑制细胞早期MMP9的表达,可降低MMP9早期对基膜的破坏引起的上皮细胞转化,同时又降低后期TIMP1的表达,从而促进细胞外基质的降解,其双向调节作用可能是其防治肾间质纤维化的机制之一.
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复方鳖甲软肝方对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞增殖的影响
目的:探讨复方鳖甲软肝方对LPS诱导的人近端肾小管上皮细胞增殖的影响.方法:由UUO大鼠制备含药血清作为药源加入离体反应系统,MTT比色法检测各组血清对LPS诱导的肾小管上皮细胞增殖的影响.结果:于24h、48h及60h,阳性药物组及复方鳖甲软肝方各组OD值均低于模型组,而阳性药物组OD值与复方鳖甲软肝方各组相比无显著差异.结论:复方鳖甲软肝方可抑制LPS诱导的肾小管上皮细胞增殖,从而延缓肾间质纤维化进程.
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复方鳖甲软肝方防治大鼠肾间质纤维化作用机理的实验研究
目的:采用单侧输尿管结扎(UUO)肾间质纤维化模型,探讨复方鳖甲软肝方对肾间质纤维化大鼠血生化及肾组织病理形态学的影响.方法:将大鼠随机分为7组,正常组、假手术组、模型组、苯那普利组和复方鳖甲软肝方低、中、高剂量组.UUO术后4周处死大鼠,并应用HE、六胺银染色及Mallory染色,观察肾组织病理学改变.结果:模型组肾小管结构严重破坏,管腔塌陷,上皮细胞大量坏死;有些部位肾小管和间质的结构基本消失,间质中出现弥漫性细胞增殖,并广泛间质纤维化.复片鳖甲软肝方组和苯那普利组纤维化病理改变明显减轻,其中以复片鳖甲软肝方中剂量组作用明显.结论:复方鳖甲软肝方可减少炎细胞的浸润、减轻肾小管的损伤,进而延缓肾间质纤维化的病程进展.
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复方鳖甲软肝方对肺纤维化大鼠细胞外基质的影响
目的:研究复方鳖甲软肝方对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化细胞外基质的影响.方法:SD雄性大鼠54只,分为假手术对照组、模型对照组、复方鳖甲软肝方高剂量组、中、低剂量组、强的松组,每组9只.除假手术对照组外其余各组大鼠气管内一次性滴注盐酸博莱霉素,假手术对照组大鼠气管内一次性滴注等体积的生理盐水.28d后给药,复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组,强的松组分别灌服复方鳖甲软肝方1.4,0.7,0.35 g·kg-1及强的松0.56mg·kg-1,假手术对照组、模型对照组分别灌服等体积的生理盐水.观察80d时大鼠肺组织羟脯氨酸和血清中Ⅲ(Ⅲ-C),Ⅳ(Ⅳ-C)胶原及层粘连蛋白(LN)和透明质酸(HA)的含量,同时取肺组织行HE,Masson染色.结果:复方鳖甲软肝方可降低肺纤维化大鼠Ⅰ,Ⅲ胶原,层粘连蛋白及透明质酸含量,减轻肺组织纤维性增生.结论:复方鳖甲软肝方可能是通过降低肺纤维化大鼠细胞外基质含量而发挥治疗肺纤维化作用.
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复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠肝星形细胞内TβRⅠ和Smad3蛋白表达的影响实验研究
目的 观察复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠肝星形细胞(HSCs)内TβR Ⅰ和Smad3蛋白表达的影响,从信号转导上游受体水平和受体后信号转导水平探讨药物血清抗肝纤维化的作用机制.方法 运用免疫细胞化学和图像分析技术,在离体对不同时相,不同浓度复方鳖甲软肝方药物血清干预状态下,HSC内TβR Ⅰ和Smad3蛋白的表达进行半定量分析. 结果复方鳖甲软肝方药物血清可明显下调HSC表达TβR Ⅰ及抑制HSC表达Smad3蛋白. 结论复方鳖甲软肝方药物血清通过下调TβR Ⅰ的表达,进而干预Smad3介导的TGF-β1在HSC内的信号转导,终抑制胶原蛋白、纤黏连蛋白的合成,从而达到抑制HSC活化的抗肝纤维化作用,这可能是复方鳖甲软肝方药物血清抗肝纤维化作用机制之一.
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复方鳖甲软肝方对LPS刺激肾小管上皮细胞NF-κB、IκBα表达的影响
目的研究复方鳖甲软肝方对肾小管上皮细胞不同时段表达核转录因子(NF-κB)、抑制蛋白家族(IκB)的影响.方法由UUO大鼠制备含药血清,将5%含药血清培养基加入体外培养的肾小管上皮细胞,在不同时间,采用免疫印迹法(Western blot)检测各组NF-κB、IκB的表达.结果 LPS刺激肾小管上皮细胞,6 h后,细胞胞浆内NF-κB活性逐渐增强;12 h NF-κB发生了核转移;细胞核内NF-κB的活化持续到24 h后.LPS刺激2 h后,细胞浆中IκBα的表达为低点,4 h后逐渐回升,8 h后基本回复正常水平.结论复方鳖甲软肝方含药血清能抑制NF-κB的活化,并阻止IκBα的降解,使NF-κB无法从NF-κB IκBα复合物上解离下来,阻止了NF-κB的核转移,可能是其防治肾间质纤维化的机制之一.
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复方鳖甲软肝方对MMPs表达在特发性肺纤维化的调控
1 材料和方法1.1 药物 复方鳖甲软肝方干粉,每瓶600g(批号20020501).1.2 动物分组 SD大鼠180只,雄性,体重200～220g,购于北京维通利华实验动物公司,动物级别SPF/VAF,许可证SCXK2002-0003.动物随机分为6组,各30只.
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复方鳖甲软肝方对肺纤维化大鼠肺组织转化生长因子-β1的影响
研究表明转化生长因子-β1(TGF-β1)在肺纤维化的发生和发展过程中起重要的作用[1～3].肺纤维化在发病过程中,炎症和损伤可以诱导TGF-β1的活化和高表达[4].活化的TGF-β1通过其受体和Smad途径增加细胞外基质的形成,从而进一步诱发肺纤维化.本实验室研究表明复方鳖甲软肝方具有抗博莱霉素诱发的肺纤维化作用[5,6].为了深入探讨其作用机制,本实验利用Western blotting和免疫组化方法,观察复方鳖甲软肝方对肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1表达的影响,以进一步揭示其抗肺纤维化作用机制.
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复方鳖甲软肝方对阿霉素肾病大鼠肾组织内皮素-1蛋白及其mRNA表达的影响
目的:探讨复方鳖甲软肝方对阿霉素肾病大鼠肾组织的保护作用机制.方法:将45只大鼠随机分为3组,正常对照组(9只)、假手术组(9只)及手术组(27只).切除大鼠右侧肾脏并腹腔注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型.于术后1周,手术组按体重再次随机均分为模型组、苯那普利组和复方鳖甲软肝方组.从开始注射阿霉素后,苯那普利组(25 mg/kg)和复方鳖甲软肝方组(14 g/kg)开始灌胃治疗,假手术组给予等量生理盐水灌胃.观察并记录实验2、4、6、8和10周大鼠体重、24 h尿蛋白;于10周末处死大鼠,取大鼠颈动脉血检测尿素氮、血肌酐、胆固醇、甘油三酯、总蛋白和白蛋白;观察肾组织病理形态学改变,采用免疫组化及原位杂交方法分析肾组织ET-1蛋白及其Mrna表达.结果:除正常对照组和假手术组外,其余3组大鼠均有不同程度的摄食减少、精神不振、活动迟缓、尿量减少、体重减轻、24 h尿蛋白定量增高、血生化指标异常等,而苯那普利组和复方鳖甲软肝方组均有不同程度改善,且复方鳖甲软肝方组优于苯那普利组,但两者差异无显著性.模型组大鼠肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞以及肾小球脏层上皮细胞胞浆中ET-1蛋白及Mrna表达呈强阳性;复方鳖甲软肝方组与苯那普利组大鼠肾组织ET-1蛋白及Mrna表达均较模型组显著减少,但两者比较差异无显著性.结论:复方鳖甲软肝方能够减少阿霉素肾病大鼠肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞以及肾小球脏层上皮细胞胞浆中ET-1蛋白及其Mrna表达,降低肾组织ET-1含量,从而起到保护肾功能,延缓肾功能衰竭的作用.
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复方鳖甲软肝方对家兔心室肌细胞钙通道的影响
目的:研究复方鳖甲软肝方对家兔单个心室肌细胞L-型钙通道(ICa-L)的电生理作用.方法:采用改良的中药血清药理学方法及全细胞膜片钳技术观察不同浓度的复方鳖甲软肝方药物血清干预心肌细胞后对心肌细胞ICa-L电流的影响.结果:含0.7 g/L和1.4 g/L的复方鳖甲软肝方药物血清使兔心室肌细胞ICa-L峰值电流密度(ICa-L max)由(6.90±0.52)pA/pF分别下降至(3.40±0.28)pA/pF和(2.30±0.18)pA/pF(P＜0.01).复方鳖甲软肝方使ICa-L的电流-电压曲线上移,但不改变其激活电位、电位峰值和反转电位,同时还抑制ICa-L的激活过程.结论:复方鳖甲软肝方对ICa-L具有浓度依赖性阻滞作用,这可能是其抗心肌纤维化的部分机制.
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复方鳖甲软肝方对单侧输尿管结扎大鼠肾组织MMP-9/TIMP-1表达的影响
目的探讨基质金属蛋白酶9/基质金属蛋白酶组织抑制剂1(MMP-9/TIMP-1)在肾间质纤维化中的表达情况及其复方鳖甲软肝方的调节作用.方法采用单侧输尿管结扎(UU0)动物模型.将大鼠随机分为7组,正常组、假手术组、模型组、苯那普利组和复方鳖甲软肝方低、中、高剂量组.术后4周处死大鼠,观察肾组织病理改变,并应用免疫组织化学方法检测肾组织MMP-9/TIMP-1的表达.结果模型组肾组织表现为纤维化病理改变,正常组及假手术组肾小管上皮细胞、肾间质细胞胞浆有轻度MMP-/TIMP-1表达;模型组MMP-9表达明显减少而TIMP-1则呈强阳性表达.复方鳖甲软肝方小、中、大剂量组与模型组比MMP-9强阳性表达(P＜0.05),TIMP-1的表达较模型组明显减少(P＜0.05).结论复方鳖甲软肝方可通过对肾组织MMP-9/TIMP-1平衡的调节而发挥抗纤维化的作用.
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复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠肝星形细胞增殖细胞核抗原表达的影响
目的:探讨复方鳖甲软肝方药物血清对大鼠肝星形细胞(HSC)增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响.方法:运用免疫细胞化学和图像分析技术方法,从离体的角度对不同时相、小同浓度复方鳖甲软肝方药物血清干预状态下,HSC内PC-NA的表达进行半定量分析,观察复方鳖甲软肝方药物血清对离体大鼠HSC增殖的影响.结果:复方鳖甲软肝方药物血清可明显抑制HSC中PCNA的表达.结论:本研究提示复方鳖甲软肝方具有抑制HSC增殖的功能,进而起到抑制肝纤维化发生、发展的作用.
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复方鳖甲软肝方血清防治肝纤维化作用机制的实验研究
目的 探讨复方鳖甲软肝方血清防治肝纤维化的作用机制.方法 将45只雄性SD大鼠按照1∶1∶1的比例随机均分为正常组、模型组及复方鳖甲软肝片组(FFBJRGP组),正常组皮下注射橄榄油3 mL/(kg.d),并以1g/(kg.d)的剂量灌服蒸馏水,连续6周;模型组皮下注射以橄榄油配制的40％的CCl4构建大鼠肝纤维化模型,并以1g/(kg·d)的剂量灌服蒸馏水,连续6周;FFBJRGP组皮下注射以橄榄油配制的40％ CCl4,3 mL/(kg·d),并以1g/(kg·d)的剂量灌服复方鳖甲软肝片,连续6周.比较3组血清相关指标、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)mRNA、COX-2蛋白、鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、血栓烷B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)及TXB2/6-K-PGF1α水平.结果 模型组与FFBJRGP组总蛋白、AST及ALT水平均显著高于正常组(P＜0.05),白蛋白水平均显著低于正常组(P＜0.05);FFBJRGP组总蛋白、AST及ALT水平均显著低于模型组(P＜0.05),白蛋白水平显著高于模型组(P＜0.05).模型组与FFBJRGP组COX-2mRNA、COX-2蛋白、α-SMA评分均显著高于正常组(P＜0.05),FFBJRGP组上述指标评分均显著低于模型组(P＜0.05).正常组与FFBJRGP组TXB2、TXB2/6-K-PGF1α水平均显著小于模型组(P＜0.05),3组6-K-PGF1α水平差异无统计学意义.结论 复方鳖甲软肝方可有效改善肝纤维化大鼠肝功能,其通过降低肝纤维化大鼠COX-2水平可能是其防治肝纤维化的作用机制之一.
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复方鳖甲软肝方防治阿霉素肾病模型大鼠作用机制的实验研究
目的:探讨复方鳖甲软肝方防治阿霉素肾病模型大鼠肾小球硬化的作用机制.方法:将45只Wistar雄性大鼠,适应性喂养1周,测尿蛋白阴性后,随机分为正常组、假手术组、模型组、苯钠普利组、复方鳖甲软肝方组,每周测大鼠体重,每2周1次收集大鼠24h尿量,测24h尿蛋白定量,10周后处死大鼠,分离血清观察血尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、胆固醇(Cho)、三酰甘油(TG)、总蛋白(TP)和清蛋白(Alb),应用HE、六胺银染色及Mallory染色,观察肾组织病理学改变,数据用SPSS11.0进行统计学处理.结果:复方鳖甲软肝方能够减轻阿霉素肾病模型大鼠肾组织病理损害,增加阿霉素肾病模型大鼠体重,减少尿蛋白排泄,提高血TP和Alb水平,降低BUN和SCr,改善肾功能.结论:复方鳖甲软肝方能减轻阿霉素肾病模型大鼠的肾脏病理损害,对阿霉素肾病模型大鼠肾小球硬化有一定的保护作用.
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中医药防治多脏器纤维化研究正式启动
2001年国家自然科学基金重点项目--复方鳖甲软肝方防治多脏器纤维化的作用机制研究,日前在北京中医药大学启动.该项目的合作单位还有第四军医大学、解放军302医院和解放军301医院.据项目主持人、博士生导师牛建昭教授介绍,脏器纤维化是世界医学的难题之一,多脏器纤维化进而发展导致相应脏器硬化,引起器官功能衰竭,是导致死亡的主要原因.目前在临床治疗上尚无理想药物,只有采用支持疗法或进行费用昂贵的器官移植.而中医药在治疗纤维化方面具有独特的优势和良好的前景.有关研究发现多脏器纤维化显示出相同的证候,从而给中医药"异病同治"提供了可能.研究将紧密结合中医药理论对脏器纤维化的病机认识,从整体、细胞及基因调控水平多层次、多环节开展中医药防治(干预)肝、肾、心、肺等脏器纤维化作用机制的研究,以切断脏器纤维化的发生发展途径,逆转脏器纤维化过程,寻求中医药防治脏器纤维化的共同性与特异性规律.北京中医药大学早在20世纪60年代即开始从事防治肝脏纤维化基础研究工作,从20世纪80年代至今,开展了大量的中医药抗器官纤维化的实验研究,先后创建或建立了猪血清诱导的肝纤维化模型、酒精性肝纤维化模型、睾丸纤维化模型,科研人员应用肝细胞(HC)、肝星型细胞(HSC)、kupf-fer细胞的分离培养技术,采用组织化学、免疫组(细胞)化学、免疫荧光、原位杂交、RT-PCR、激光共聚焦显微镜、电镜技术等分别对活血化瘀、清热利湿、益气活血、益气养阴等中药复方抗肝、肾、睾丸纤维化的疗效、机制进行了大量深入系统的研究,取得了良好的效果.已发表相关研究论文100余篇,培养硕士41人、博士25人、博士后1人,项目所在的细胞与生化实验室是国家中医药管理局首批确认的三级实验室.(摘自<健康报>2001年11月21日第1版)
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复方鳖甲软肝方防治特发性肺间质纤维化的MMPs表达
目的 研究复方鳖甲软肝方对特发性肺间质纤维化防治的MMPs表达,探讨其机理和疗效.方法 选sD雄性大鼠180只.随机分为假手术组、模型组、阳性药物时照组及复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组,共6组,每组30只.各组分别于7,14,28 d随机抽取10只大鼠,麻醉后取肺组织,MMP-2采用原位杂交及RT-PCR的方法测定.MMP-1和MMP-9采用免疫组化的方法.结果 复方鳖甲软肝方组在早期抑制MMP-9在细胞内表达上调,在中晚期抑制MMP-1在细胞内表达上调,说明两者均有抑制纤维合成的作用.MMP-2的原位杂交和RT-PCR结果一致,在模型组过度表达,在药物组表达被抑制,表明药物对IPF的形成有抑制作用,以中、小剂量组为好.结论 复方鳖甲软肝方在早期抑制MMP-9在细胞内表达上调,在中晚期抑制MMP-1在细胞内表达上调,达到抗纤维化作用;复方鳖甲软肝方通过抑制MMP-2表达发挥抗纤维化的作用.
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复方鳖甲软肝方防治肺纤维化细胞凋亡的实验研究
目的 通过观察细胞凋亡,探讨复方鳖甲软肝方防治肺纤维化的机理和疗效.方法 选SD雄性大鼠180只,随机分为假手术组,模型组,阳性药物对照组,复方鳖甲软肝方高、中、低剂量组,共6组,每组30只.博莱霉素常规造模的同时给药.假手术组和模型组每天灌胃生理盐水,其余4组灌药进行防治.各组分别于7,14,28 d随机抽取10只大鼠,8只制成光镜标本,2只麻醉后快速开胸取肺组织,进行电镜标本的制作.免疫组化载玻片用DEPC处理后备用.结果 Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞以及成纤维细胞均有凋亡.bax在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞,肺泡巨嗜细胞胞质和胞膜均表达.假手术组和高、中剂量组呈弱阳性表达,模型组强阳性表达.Bcl-2在核膜和线粒体表达,模型组强阳性表达,药物组弱表达.结论 复方鳖甲软肝方通过调节细胞凋亡,上调Bax活性,抑制Bcl-的活性,抑制Ⅱ型上皮细胞凋亡,减少纤维积聚和纤维化形成,对肺纤维化起到防治作用.
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复方鳖甲软肝方对自发性高血压大鼠心室重构及左室功能的影响
目的:观察复方鳖甲软肝方对自发性高血压大鼠(SHR)心室重构及左室功能各项指标的影响.方法:12周龄SHR 50只随机分为5组,即空白对照组(SHR-C组)、依那普利组(SHR-Y组)及复方鳖甲小剂量组(SHR-B1组)、中剂量组(SHR-B2组)、大剂量组(SHR-B3组),每组10只.并以正常SD大鼠10只作对照,称为SD组.治疗10周后测定各组大鼠收缩压(SBP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室压力微分值大(±dp/dtmax)、心脏质量指数(HMI)、左室质量指数(LVMI)以及胶原蛋白含量等指标.结果:治疗10周后,SHR-Y组的SBP、HMI、 LVMI较对照组显著降低(P<0.01),而SHR-B各组无显著改变 ;SHR-Y组,SHR-B2组及SHR-B3组的LVEDP较对照组显著降低(P<0.01或P<0.05).SHR-Y组的+dp/dtmax较对照组显著增大(P<0.05),SHR-B各组无显著改变.SHR-Y组及SHR-B各组的-dp/dtmax较对照组显著增大(P<0.01或P<0.05).SHR-Y组、SHR-B2组及SHR-B3组胶原蛋白含量较对照组均显著降低(P<0.01或P<0.05).结论:复方鳖甲软肝方无明显降压功能,但可通过抑制心肌纤维化,有效影响SHR的心室重构,改善左室功能.
