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青藤碱对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞NF-κB的抑制作用
目的 观察青藤碱(sinomenine,SN)对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)大鼠滑膜细胞核因子-κB(NF-κB)的DNA结合活性及核转位的影响,以阐明该药抗炎的可能机制.方法 以CIA大鼠为模型,收集膝关节滑膜细胞体外培养,设正常对照组、CIA组、CIA+甲氨喋呤10 μmol/L(阳性对照组)、CIA+SN 50 μmol/L组、CIA+SN 500 μmol/L组.应用荧光标记与激光共聚焦扫描显微镜检测滑膜细胞NF-κB p65亚基核转位,电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测NF-κB与DNA序列的结合活性.结果 与正常对照组相比,CIA大鼠滑膜细胞可见明显的p65亚基核移位,NF-κB的DNA结合活性显著升高(P＜0.01),SN在50 μmol/L及500 μmol/L时可呈浓度依赖性地抑制CIA大鼠滑膜细胞p65亚基核转位及NF-κB的DNA结合活性,甲氨喋呤在10 μmol/L时可下调NF-κB的DNA结合活性但未抑制p65亚基的核转位.结论 SN抑制滑膜细胞内NF-κB p65 核转位和NF-κB的DNA结合活性为其抗炎机制之一.
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骨髓间充质干细胞对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠的治疗作用
目的 探讨骨髓间充质干细胞对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠的治疗作用.方法 将造模成功的大鼠分为模型组、干细胞组、泼尼松组,每组10只,正常组10只.观察大鼠的关节肿胀程度,进行大鼠关节炎指数评分,检测大鼠白细胞介素17(IL-17)、IL-6水平.结果 与正常组相比,模型组大鼠关节肿胀程度加重,关节炎指数评分增加,IL-17、IL-6水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,干细胞组、泼尼松组大鼠关节肿胀程度减轻,关节炎指数评分降低,IL-17、IL-6水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与干细胞组相比,泼尼松组大鼠关节肿胀程度减轻明显,关节炎指数评分和IL-17、IL-6水平降低显著,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 骨髓间充质干细胞可以减轻CIA大鼠关节肿胀程度,降低关节炎指数评分,降低IL-17、IL-6水平,对CIA大鼠具有一定的治疗作用.
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青蒿琥酯对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜细胞周期及细胞形态的影响
目的:观察青蒿琥酯对类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 的动物模型--胶原诱导性关节炎(colla-gen-induced arthritis,CIA)大鼠滑膜细胞的影响,探讨其对RA的作用机制.方法:雄性Wistar大鼠皮内注射Ⅱ型胶原,建立CIA大鼠模型,然后取其滑膜组织用胶原酶消化法进行原代培养.取3～5代的传代细胞,进行后续实验.流式细胞仪检测青蒿琥酯和甲氨喋呤对滑膜细胞生长周期的影响,电镜观察青蒿琥酯作用下滑膜细胞的形态.结果:青蒿琥酯和甲氨喋呤作用下细胞停留在G<,1>期的比例比模型对照组明显增加(P<0.05),电镜下可以观察到青蒿琥酯引起滑膜细胞凋亡.结论:青蒿琥酯对RA的作用与抑制滑膜细胞的增殖,与诱导滑膜细胞凋亡有关.
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秦艽分离有效部位对胶原诱导性关节炎的作用研究
目的:分离并筛选秦艽有效部位,研究其对胶原诱导性关节炎大鼠的治疗作用及作用的分子机制.方法:通过D-101大孔树脂对秦艽醇提物进行分离纯化;采用二甲苯致小鼠耳肿胀急性炎症模型观察秦艽各分离片段的抗炎活性;进一步通过胶原诱导性关节炎大鼠模型,研究秦艽10％乙醇分离片段对大鼠足肿胀度、外周血中Ⅱ型胶原抗体、TNF-α、IFN-γ和IL-4水平的影响;并利用UPLC法测定各分离片段中4种环烯醚萜类化合物的富集情况.结果:秦艽10％乙醇分离片段(生药5g/kg)显著抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀;在胶原诱导性关节炎大鼠模型实验中,秦艽10％乙醇分离片段(生药3.5g/kg)能显著减轻关节肿胀,降低Ⅱ型胶原抗体、TNF-α和IFN-γ水平,升高IL-4水平.通过UPLC法检测发现10％乙醇分离片段中的主要成分为4种环烯醚萜类化合物,总含量为69.98％.结论:D-101大孔树脂可用于秦艽醇提物的分离纯化,10％乙醇分离片段为秦艽抗类风湿性关节炎的有效部位,通过UPLC法测定该有效部位的主要成分为环烯醚萜类化合物.
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雷公藤多甙对关节炎大鼠胸腺及血液TCRBV基因mRNA的表达影响
目的:研究雷公藤多甙对类风湿关节炎大鼠胸腺及血液中T细胞受体的作用影响,探讨雷公藤多甙的作用机制,为临床应用提供理论基础.方法:用鸡Ⅱ型胶原蛋白建立胶原诱导性关节炎大鼠模型,对大鼠小肠派氏集合淋巴结进行计数及胸腺、脾系数的测定;并采用实时定量PCR方法,检测大鼠胸腺及外周血单个核细胞T细胞受体BV基因mRNA的表达情况,统计分析各组实验数据的差异显著性.结果:雷公藤多甙的有效剂量为8mg/kg,可以减少类风湿关节炎模型大鼠肠道派氏集合淋巴结的数量,引起黏膜免疫系统功能低下,不易接受抗原刺激,降低免疫应答反应;还可以抑制脾脏免疫功能的亢进;并且发现模型对照组大鼠TCR BV15和BV19表达增高,而在药物治疗组大鼠TCR BV15和BV19表达有所下降.结论:雷公藤多甙可减少小肠派氏集合淋巴结的数量,抑制脾脏免疫功能亢进,降低T细胞功能,通过改变TCR BV基因mRNA表达量,从而达到改善类风湿关节炎症状及治疗的目的.
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益气活血解毒方对胶原诱导性关节炎大鼠T淋巴细胞增殖和分化的影响
目的:应用益气活血解毒方治疗胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠,探讨该方治疗类风湿关节炎(RA)对外周血T淋巴细胞增殖和分化的影响.方法:以牛Ⅱ型胶原尾根及背部多点注射制作CIA大鼠模型,以免疫抑制剂来氟米特(2mg/kg)为阳性对照药物,益气活血解毒方(5.9g/kg、11.8g/kg、17.7g/kg)干预,流式细胞仪检测大鼠外周血淋巴细胞中T辅助细胞各亚型的比率.结果:大鼠足关节肿胀度观察显示,益气活血解毒方(11.8g/kg、17.7g/kg)可以显著降低CIA大鼠足关节肿胀程度,流式细胞仪检测结果显示,益气活血解毒方可以显著降低CIA大鼠外周血中T辅助(Th)1和Th2的数量和比率,提高Th17细胞比率,效果优于来氟米特组;调节性T细胞(T reg)比率显著升高,益气活血解毒方5.9g/kg、11.8g/kg剂量组与模型对照组相比有显著性差异.结论:益气活血解毒方能够通过调控RA外周血T淋巴细胞的增殖和分化,维持体内自身免疫应答的稳态,抑制炎症反应的发生,缓解因免疫炎症反应造成的关节损伤,这可能是该方治疗RA的关键作用机制.
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牛Ⅱ型胶原蛋白诱导VSIG4-/-鼠的关节炎模型
目的 以Ⅱ型胶原蛋白诱导的VSIG4-/-(C57BL-6背景)小鼠关节炎模型为研究对象,探讨VSIG4在RA疾病进程中的作用.方法 取SPF级DBM1、VSIG4-/-(C57BL-6背景)以及Ncf1-/-(C57BL-6背景)小鼠,以牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)与完全佛氏佐剂完全乳化,尾根部皮下注射,在第21天以牛Ⅱ型胶原蛋白与不完全弗氏佐剂加强免疫获得CIA模型.定期观察小鼠关节改变,并进行关节评分.用H&E染色法观察小鼠关节组织病理学改变并采用流式细胞术检测脾淋巴细胞以及腹腔巨噬细胞中TNF-α的变化.结果 与Ncf1-/-及DBA/1小鼠相似,VSIG4-/-小鼠在牛Ⅱ型胶原蛋白免疫后开始出现明显的多关节肿胀,即小鼠踝关节病理检测显示明显的滑膜增生,炎症细胞浸润以及关节坏死.进一步研究发现来源于VSIG4-/-关节炎模型小鼠与同系正常小鼠相比,虽然脾淋CD4+T巴细胞分泌的TNF-α没有显著性差异(P＞0.05),但是腹腔巨噬细胞分泌的TNF-α具有显著性差异(P＜0.05).结论 牛Ⅱ型胶原蛋白可诱导VSIG4-/-小鼠的关节炎,而腹腔巨噬细胞分泌的TN F-α在其发病过程中可能起关键作用.
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pTARGET-TCR Vβ5.2真核表达质粒的构建及表达
目的 构建含大鼠TCR Vβ5.2基因的重组真核表达质粒.方法 以RT-PCR法扩增Lewis大鼠脾脏淋巴细胞的TCR Vβ5.2基因片段,将目的基因直接克隆到真核表达载体pTARGET中,构建重组质粒pTARGET-TCR Vβ5.2.连接产物转化E.coli JM109细胞后进行蓝白斑筛选,并经菌落PCR和DNA测序进行鉴定.将重组质粒以肌注法免疫Balb/c小鼠,用RT-PCR和免疫组化方法分别检测重组质粒在注射部位的转录和表达.通过脂质体介导,将重组质粒转染COS-7细胞进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测目的基因在真核细胞内的表达.结果 测序鉴定证实,TCR Vβ5.2基因已被正确插入到pTARGET载体中,并检测到肌肉组织和COS-7细胞内目的蛋白的表达.结论 成功构建了重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ5.2,为进行TCR VβDNA疫苗对胶原诱导性关节炎大鼠保护作用的研究提供了基础.
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牛Ⅱ型胶原诱导恒河猴关节炎的实验研究
目的 观察牛Ⅱ型胶原诱导川西恒河猴关节炎后,相关炎症指标与关节X光影像学的变化.方法 将6只恒河猴分别sc 1.5 mg牛Ⅱ型胶原诱导关节炎,检测恒河猴的体重、体温、血液学及血生化指标,观察恒河猴的症状并每天进行临床相关性评分.免疫后第4周与第8周分别进行四肢关节的X光影像学分析.结果 6只恒河猴中有1只属于急性活动期反应(免疫后第1周CRP＞ 50 mg· L-),3只属于慢性活动期反应(免疫后第4周开始CRP＞ 50 mg· L-);注射胶原后猴的体重增长率＜14％或呈负增长,全身临床评分持续增长;与免疫前比较,中性粒细胞(NEUT)、单核细胞(MONO)计数升高,白蛋白(ALB)与血红蛋白(HGB)降低(P＜0.05);X光平片显示第8周与第4周相比有进展,与关节病理学检查结果相符.结论 早期急性活动期反应者与慢性活动期反应者的共同特点是NEUT、MONO计数升高,体重、ALB与HGB降低或增长缓慢;CRP可以作为早期关节炎发病的指标,X线影像学显示关节病变程度加重,与临床类风湿关节炎的症状类似并有其特殊表现.
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超声空化效应破坏兔胶原诱导性关节炎滑膜血管翳的实验研究
目的 探讨超声空化效应破坏兔胶原诱导关节炎滑膜血管翳的适超声辐照及微泡条件.方法 建立双侧兔膝关节胶原诱导关节炎模型(AIA模型),将85只造模成功兔随机分入不同超声峰值负压、不同脉冲宽度、不同脉冲重复频率、不同超声辐照时间、不同微泡浓度、不同辐照次数组,经兔耳缘静脉推注微泡Sonovue,同时超声辐照右侧膝关节,在超声辐照1d后处死,根据MRI及病理结果选出适合的超声空化条件.结果超声空化效应破坏滑膜血管翳适合的条件为间歇式超声辐照,间歇时间6 s,超声峰值负压4.6 MPa,脉冲宽度100cycles,脉冲重复频率50 Hz,超声辐照时间5 min,微泡浓度0.6 mL/kg,多次超声辐照.辐照后右侧膝关节MRI显示滑膜厚度较左侧变薄,病理可见滑膜坏死.结论 在适合的超声辐照及微泡浓度条件下,超声空化效应可破坏兔胶原诱导性关节炎滑膜血管翳.
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青藤碱对胶原诱导性关节炎小鼠TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表达的影响
目的:探讨青藤碱(SIN)对胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠滑膜Toll样受体(TLR)4、髓样分化因子88(MyD88)、核因子(NF)-κB mRNA表达的影响.方法:30只DBA/1小鼠均分为正常组、CIA组和SIN组;CIA组与SIN组小鼠尾根部给予皮内注射胶原乳剂诱导建立CIA模型,CIA造模第28天时SIN组小鼠给予SIN干预治疗,其余两组予生理盐水作对照,治疗20 d;于造模第27、34、41及48天时对各组小鼠进行关节炎指数(AI)评分,并于第48天时处死3组小鼠取小鼠膝关节滑膜,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)测定小鼠滑膜TLR4、MyD88及NF-κB mRNA的表达.结果:与正常组比较,CIA组及SIN组小鼠AI评分明显升高(P＜0.01);造模第41和48天时,SIN组小鼠AI评分较CIA组有明显下降(P＜0.05);CIA组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA的相对表达较正常组明显上调,与CIA组相比,SIN组TLR4、MyD88及NF-κB mRNA的相对表达明显降低(P＜0.01).结论:SIN可改善CIA小鼠的关节炎症,这可能与其抑制了滑膜TLR4/NF-κB信号通路有关.
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壮药龙钻通痹方对类风湿关节炎大鼠模型MMP-13的影响
目的:观察壮药龙钻通痹方对关节炎大鼠模型致炎因子MMP-13的影响.方法:采用牛Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎大鼠模型,以甲氨喋呤作对照,用酶联免疫分析法检测大鼠模型各组血清MMP-13的表达.结果:壮药龙钻通痹方能显著降低大鼠血清MMP-13水平(P＜0.05).结论:壮药龙钻通痹方能下调关节炎大鼠血清MMP-13水平,提示这可能是其治疗类风湿关节炎的作用机理之一.
关键词： 胶原诱导性关节炎 壮药龙钻通痹方 基质金属蛋白酶MMP-13 -
药用爬山虎对CIA大鼠血清IL-17和关节滑膜细胞NF-κB表达的影响
目的:探讨药用爬山虎对牛Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠(CIA)关节滑膜细胞核周因子-κB(NF-κB)表达及血清IL-17水平的影响.方法:将40只6周龄雌性wistar大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、雷公藤多苷对照组和爬山虎治疗组各10只.除空白对照组外,其余各组建立CIA模型,造模第7天开始予爬山虎汤剂和雷公藤水溶液灌胃治疗,连续用药4周,空白对照组和模型对照组灌服等量生理盐水,于末次给药2h后采集血清,处死大鼠,摘取双后肢膝关节分离滑膜,采用ELISA检测血清IL-17的表达,Western-blot检测关节滑膜NF-κB/P65的蛋白表达.结果:与空白对照组比较,模型组大鼠血清IL-17表达增加,爬山虎和雷公藤能够明显降低IL-17的表达(P＜0.05);模型对照组大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P65蛋白水平明显高于空白对照组(P＜0.05),爬山虎与雷公藤多苷治疗组均能降低CIA大鼠关节滑膜细胞NF-κB/P65的表达,两组无显著性差异(P＞0.05).结论:药用爬山虎能够降低CIA模型大鼠血清IL-17的表达,下调关节滑膜细胞NF-κB的蛋白水平.
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苗药金乌健骨汤对胶原性关节炎模型大鼠血清IL-1、IL-1β及TNF-α的影响
目的:探讨苗药金乌健骨汤对胶原诱导性关节炎(CIA)模型大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-1β的影响.方法:将60只Wistar大鼠随机分为6组,每组各10只,除空白对照组外,其余各组制备CIA模型.从建模第8天开始分别灌服雷公藤多苷混悬液、金乌健骨汤低、中、高剂量水煎浓缩液,空白对照组和模型对照组灌服等量生理盐水.给药第28天断头取血并处死大鼠留取关节滑膜,ELISA法检测血清TNF-α、IL-1、IL-1β表达水平,病理切片观察关节滑膜.结果:模型对照组大鼠血清IL-1、IL-1β、TNF-a表达高于空白对照组(P＞0.05),金乌健骨汤及雷公藤多苷对照组大鼠血清IL-1、IL-1β、TNF-a表达较模型对照组有不同程度下降(P＜0.01或P＜0.05).结论:金乌健骨汤能下调CIA模型大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-1β表达水平.
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胶原诱导性关节炎大鼠在中药作用下对其关节炎指数、IL-1β、TNF-α、PGE2、 RANKL及OPG的影响探讨
目的 探讨胶原诱导性关节炎大鼠在中药作用下对其关节炎指数、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、前列腺素E2 (PGE2)、核因子-kB受体活化因子配体(RANKL)及护骨素(OPG)的影响.方法 取Wistar大鼠48只随机分为空白组、模型组、阳性组、A、B、C组.复制胶原诱导性关节炎大鼠模型,连续干预4周后,各组大鼠眼眶静脉取血,观察关节炎指数、IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL及OPG.结果 与空白组相比,其余各组大鼠关节炎指数均明显增加(P＜0.05).与模型组相比,阳性组、A、B、C组关节炎指数均明显降低(P＜0.05).与空白组相比,模型组血清IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平均明显升高(P＜0.05).与模型组相比,阳性组、A、B、C组血清IL-1β、TNF-α、PGE2、RANKL、OPG及RANKL/OPG水平明显降低(P＜0.05),且A、B、C组大鼠血清IL-1β、TNF-α、PGE2水平抑制作用及对RANKL、OPG及RANKL/OPG的改善情况均优于阳性组(P＜0.05).组织病理学结果显示,A、B、C组可抑制CIA大鼠关节组织病理学改变.结论 自拟除痹汤可明显降低CIA模型大鼠的关节炎指数及关节组织病理学改变,下调IL-1β、TNF-α、PGE2水平,抑制RANKL、OPG,从而可以有效防治CIA.
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海风藤提取物对胶原诱导性关节炎大鼠的影响
目的：研究海风藤正丁醇提取物对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织中NF－κB、IκB和IκK的影响，探讨其治疗作用机制。方法：通过建立胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠模型，观察大鼠足趾肿胀度的变化，蛋白印迹法检测大鼠踝关节滑膜组织中NF－κB、IκB和IκK的表达水平。结果：海风藤正丁醇提取物能改善大鼠活动减少、精神不佳等一般状态，下调滑膜组织中 NF－κB、IκK的表达及上调滑膜组织中IκB的表达。结论：海风藤正丁醇提取物对类风湿性关节炎有一定的治疗作用，其机理与调节滑膜组织中NF－κB、IκB和IκK的表达水平有关。
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甘草次酸对胶原诱导性关节炎滑膜成纤维样细胞炎症细胞因子表达和分泌的影响
目的:观察甘草次酸(GA)对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜成纤维样细胞(CIA-FLS) TNF-α、IL-1β表达分泌的影响,并观测与传统治疗药物MTX联合应用后的效果.方法:组织块培养法体外分离纯化CIA大鼠膝关节滑膜组织中CIA-FLS细胞.实验分为空白组、MTX组、GA组和GA+ MTX组4组,分别对CIA-FLS细胞进行体外药物干预实验.每组分别干预1、3、5d.Real time qPCR法检测各组CIA-FLS细胞TNF-α、IL-1βmRNA表达水平,ELISA法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β水平.结果:药物干预1d,CIA-FLS TNF-α、IL-1β表达均降低,但与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).药物干预3d,CIA-FLS TNF-α、IL-1β表达均降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),3组组间差异无统计学意义(P＞0.05).药物干预5d,CIA-FLS MTX、GA、GA+ MTX均可明显抑制TNF-α、IL-1β表达(P＜0.05),处理组间差异有统计学意义,按照强弱依次是GA+ MTX＞MTX ＞GA( P＜0.05).MTX、GA、GA+ MTX抑制TNF-α、IL-1β表达均呈时效依赖性,作用时间延长,抑制作用越明显(P＜0.05).结论:GA、MTX、GA+ MTX对CIA-FLS炎症因子TNF-α、IL-1β表达和分泌的抑制作用依次递增,并呈时间依赖性.
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THH对HIF-1α在CIA动物模型中表达的影响及意义
目的:探讨昆明山海棠(THH)对低氧诱导因子(HIF-1α)在胶原关节炎(CIA)大鼠模型中表达的影响及其作用机制的研究.方法:建立CIA大鼠模型,然后用药治疗30d,30d后HE染色观察关节的病理改变,RT-PCR以及免疫组化法检测HIF-1α的表达.结果:给药30 d后,HE染色显示治疗组明显减轻滑膜增殖以及炎症反应,免疫组化以及PT-PCR显示治疗组HIF-1α明显表达降低.结论:THH治疗CIA大鼠模型具有显著疗效的作用机制与调节外周血清以及滑膜组织内的HIF-1α的表达有关.
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昆明山海棠对CIA大鼠模型中HIF-1α表达的影响
目的:研究昆明山海棠(THH)对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型中低氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响及其作用机制.方法:建立CIA大鼠模型,随机分组,治疗组分别采用高、中、低剂量THH每天灌胃1次,连续用药30d.动态观察关节炎指数(AI)及关节的病理改变,用RT-PCR及免疫组化染色法分别检测HIF-1 αmRNA及其蛋白的表达.结果:THH可明显抑制CIA大鼠的足爪肿胀,明显减轻滑膜增殖及炎症反应,HIF-1α表达明显降低.结论:THH通过降低HIF-1α的表达,减轻CIA模型大鼠关节的炎症反应.
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大鼠TCR Vβ8.2基因真核表达质粒的构建及表达
目的:构建含大鼠TCR Vβ 8.2基因的重组真核表达质粒,并检测其在体内外的表达.方法:以RT-PCR法分离Lewis大鼠脾淋巴细胞中的TCR Vβ 8.2基因片段,插入到真核表达载体pTARGET中,构建重组表达载体pTARGET-TCR Vβ 8.2,并转化E.coli JM109,经蓝白斑筛选阳性菌落,进行菌落PCR和测序鉴定.将重组质粒以肌注法免疫BALB/c小鼠,采集注射部位股四头肌处的肌肉,用RT-PCR及免疫组化染色法检测TCR Vβ 8.2基因在注射部位的转录和表达.通过脂质体介导,将重组质粒导入COS-7细胞中进行瞬时表达,用免疫细胞化学染色法检测靶基因在真核细胞内的表达.结果:测序鉴定证实,TCR Vβ 8.2基因已被正确插入到pTARGET载体中,并检测到在肌肉组织和COS-7细胞内重组蛋白的表达.结论:成功地构建重组真核表达质粒pTARGET-TCR Vβ 8.2,并在体内体外均可检测到其转录和表达,为进一步进行TCR VβDNA疫苗的研究奠定了基础.
