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急性感染期内恒河猴外周血中人/猴嵌合免疫缺陷病毒包膜蛋白的N糖基化位点分析
目的：分析人/猴嵌合免疫缺陷病毒（SHIVSF162P3）包膜蛋白N糖基化位点的数量和分布及病毒传播能力。方法两只雌性成年（4周岁）中国恒河猴，编号Rh1和Rh2，体重分别为4和5 kg。通过静脉攻毒的方式向Rh1和Rh2接种SHIVSF162P3，每只剂量为300半数组织培养感染剂量，在攻毒后第3、7、10、14、17、21、24、28、35、42、49、56、63、70和77天采集血液样本。对样本进行病毒RNA抽提和cDNA合成，采用实时荧光定量PCR测定病毒RNA水平。对攻毒后第7、14、28和77天的血浆样本进行单基因组扩增，使用Bio-edit中的Clustal W软件进行包膜蛋白全长多序列比对，用MEGA6.06软件计算配对差异距离，采用HIV Databases中的软件计算包膜蛋白N糖基化位点和可变区氨基酸数目，比较序列多样性、N糖基化位点数量的差异。结果从接种的病毒中共扩增得到55条包膜蛋白全长序列，其核苷酸序列平均配对差异距离为（0.1666±0.0963）%。病毒载量在攻毒后第10天达到峰值，lg转换值分别为7.68和7.49拷贝/ml；在攻毒后第42天，病毒载量达到调定点，lg转换值分别为4.27和4.81拷贝/ml。攻毒后第7天，Rh1和Rh2血样中包含25个N糖基化位点的病毒包膜蛋白序列的比例分别达到83%（20/24）和94%（29/31），高于接种病毒中的比例[49%（27/55）]。随着感染时间的延长，Rh1和Rh2血浆中SHIVSF162P3病毒包膜序列的多样性逐渐增大，包含25个N糖基化位点的包膜蛋白序列比例逐渐降低，包含27个N糖基化位点病毒所占比例逐渐升高；在第28天Rh1体内包含27个N糖基化位点的序列比例达到29%（6/21），Rh2在第77天达到35%（13/37）。V1~V5区糖基化位点分析发现，N糖基化位点数目的变化主要来自于V4区。与包含27个糖基化位点的包膜蛋白序列相比，包含25个糖基化位点的病毒包膜蛋白序列在V4区缺失7个氨基酸（TWNNTIG），导致V4区在392位和396位缺少2个N糖基化位点。结论 V4区低糖基化的SHIVSF162P3在传播过程中占优势地位；而随着感染时间的延长，V4区高糖基化的SHIVSF162P3逐渐在猴体内获得复制优势。
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中研Ⅰ、Ⅱ号方对猴SIV感染模型免疫功能研究
目的:中研Ⅰ、Ⅱ号复方对恒河猴感染SIVmac、SⅣmac251实验观察T、B淋巴细胞增殖,血清β2-MG含量,T细胞亚群变化的实验研究.方法:以猴免疫缺陷病毒SIVmac及SⅣmac251感染猴,检测猴T、B细胞增殖变化,对感染猴血清β2-MG含量测定及对外周血CD+4T细胞百分数检测,观察中研Ⅰ、Ⅱ号对感染动物免疫调节作用和对免疫功能的影响.结果:中研Ⅰ号能提高感染动物T、B细胞增殖.中研Ⅱ号提高模型动物CD4+T细胞百分比,并降低动物血清β2-MG含量.结论:中研Ⅰ、Ⅱ号复方均能提高感染动物免疫功能,并对动物免疫细胞有保护作用.
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灵芝体外抑制猴免疫缺陷病毒作用的研究
目的:对灵芝孢子水提物(AEGLS)进行体外抗猴免疫缺陷病毒(SIV)活性分析并对其作用机制进行初步研究.方法:300 TCID50的SIV病毒稀释液和AEGLS稀释液同时加入到CEM × 174细胞(CEM T淋巴细胞和174 B淋巴细胞杂交细胞)中培养4d后计数合胞体数量并进行统计,研究AEGLS抗SIV活性.利用不同加药时间点实验、作用阶段分析实验、Western blot对其作用机制进行初步分析.结果:AEGLS具有良好的抗SIV活性,其半数抑制浓度IC50为(466.62 ±20.21) mg·L-1,并且其细胞毒性较低,半数细胞毒性浓度CC50为(3.13±0.11) g·L-1,选择指数为6.71.抗SIV机制研究显示AEGLS主要作用在SIV病毒感染的早期阶段,与抑制SIV病毒的吸附或者穿透细胞有关,Western blot实验显示AEGLS能降低SIV衣壳蛋白P27( SIV P27)的表达水平.结论:AEGLS具有良好的抗SIV作用,其主要作用在SIV病毒感染的早期阶段,与抑制SIV病毒的吸附或者穿透细胞有关,并且能降低SlY P27农壳蛋白的表达水平.
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中药注射液“喘可治”通过TGF-β通路改善慢性猴艾滋病的淋巴组织纤维化
目的:探讨中药注射液“喘可治”改善猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的淋巴组织纤维化的作用机制及治疗价值.方法:将12只SIV感染的中国恒河猴随机分为2组,分别给予喘可治和生理盐水,持续给药2个月,定期采集血样和淋巴结,通过免疫组化、流式等技术检测相关指标变化.结果:喘可治可保护和重建感染SIV猴的淋巴结滤泡和T细胞区,使胶原沉积减少,网状组织结构增加并趋于有序,且此变化与TGF-β通路相关.结论:“喘可治”可重建淋巴组织网状结构,据此有望研发出靶向于免疫重建的新治疗方案.
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中药复方提取物HNA-1对SIV慢性感染恒河猴单核细胞各亚群的影响
目的:探讨中药复方提取物湘A-1 (HNA-1)对猴免疫缺陷病毒(SIV)慢性感染恒河猴单核细胞亚群的影响,以进一步了解HNA-1促进胸腺输出、提升初始型CD4的机制.方法:采用SIVmac239病毒液对8只中国恒河猴慢性感染16-21个月,随机分为对照组和治疗组,每组4只.治疗组给予HNA-1灌胃治疗,每日1次;对照组给予等体积0.9％氯化钠溶液灌胃.两组给药2个月.在治疗第0、28、56天采集血液检测血常规,并采用流式细胞法检测外周血单核细胞CD14++CD16-(经典型)、CD14++CD16+(中间型)和CD14dimCD16+(非经典型)亚群的比例、各亚群表达HLA-DR、趋化因子CCR5和CCR7的情况,以及外周血单个核细胞(PBMC)表达白细胞介素(IL)-17、IL-10及转化生长因子(TGF-β)的比例.并采用酶消化法从胸腺分离所有细胞,检测胸腺内CD;、CD68+细胞的比例.结果:治疗组外周血单核细胞比例及数量无明显改变;但CD14++CD16+亚群的比例明显增高(P＜0.05).该亚群高表达HLA-DR、CCR5和CCR7.同时,治疗组胸腺内巨噬细胞标记CD68+细胞的比例显著高于对照组(P＜0.05).治疗后PBMC表达IL-10显著降低(P＜0.05).结论:治疗后CD14++CD16+单核细胞增加、归巢进入胸腺并分化为巨噬细胞,可能是HNA-1提高外周初始型CD4、促进胸腺输出的疗效基础;其临床价值尚有待进一步研究评估.
关键词： 猴免疫缺陷病毒 中间型单核细胞 人CC趋化因子受体7 中药提取物 湘A-1 -
艾可清复方对艾滋病模型猴不同组织病毒载量及T细胞亚群的影响
目的 评价艾可清复方对艾滋病模型猴的干预效果.方法 8只同期猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的恒河猴随机分为中药组和抗病毒药组,每组4只.中药组给予艾可清复方浸膏1g/(kg·d)灌胃,抗病毒药组给予替诺福韦30 mg/(kg·d)背部皮下注射.各组均每天1次,共给药8周.给药前后留取外周血、浅袁淋巴结以及实验结束时胃、胸腺、脾脏等不同组织,检测各样本中CD3、CD4、CD8水平,病毒载量和趋化因子受体CCR5水平,并进行病理观察.结果 中药组外周血CD4水平及胃、肠系膜淋巴结、直肠中趋化因子受体CCR5表达高于抗病毒药组(P＜0.05),且对胸腺、脾脏、浅表淋巴结组织病理结构保存更完整.抗病毒药组肠系膜淋巴结中病毒载量低于中药组(P＜0.05). 结论 艾可清复方对艾滋病模型猴有一定免疫调节作用.
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马传染性贫血发病过程中细胞毒性T细胞的作用及其表位研究进展
马传染性贫血(Equine infectious anemia, EIA)是马属动物感染的一种主要经由虫媒传播的传染性疾病.该病的临床表征为反复发热、贫血、出血、水肿以及消瘦等,病理生理变化以血小板减少为主[1].EIA的致病原为马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV),该病毒与人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV),猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)等同属反转录病毒科,慢病毒属[2].EIA与HIV引起的人艾滋病和SIV引起的猴艾滋病在疾病特征上具有一定的相似性.然而,感染EIAV的多数马往往在经过一年左右的反复发热和与之相关联的病毒血症之后,终能够控制住病毒在体内的复制(而非清除),转归为无明显临床症状的EIAV隐性携带马[3],这与人在感染HIV 8～10年后几乎100%转归死亡是有明显差别的.也正是由于这一差别,研究马与EIAV之间相互作用的机理,可作为研究HIV等慢病毒致病机理和防治策略的良好动物模型.因此,人们对EIA发病及控制机理有了更多的关注和研究.其中,细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)在病毒感染控制过程中起主要作用这一观点,随着相关研究的逐步深入,越来越得到人们的认同.
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从中国恒河猴感染猴免疫缺陷病毒后的不同进展情况看艾滋病的发病机制
目的 中国恒河猴感染猴免疫缺陷病毒(SIV)后,根据其病毒载量水平、疾病进程速度等,可分为普通进展型(NP)、快速进展型(RP)以及长期不进展型(LTNP)/精英控制者(EC)等3类.对属于不同进展类型的动物的各项参数进行比较,有助于进一步理解AIDS的发病机制.方法 使用SIVmac239毒株静脉感染中国恒河猴后,定期采血进行血液学、免疫学、病毒学及病理学检查；并对各参数进行比较.结果 16只感染动物中,有1例动物(RM449猴)快速进展并死亡于感染后4.5个月(RP型)；2例(RM450和RM453)的血浆病毒载量被控制至低于检测水平(EC型)；其余13例属于NP型.与13只NP型的猴相比较,RM449( RP型)病毒载量高,SIV特异IgG低,效应记忆型CD4+T亚群细胞数低,且流式图出现类似“分化阻滞”的现象；外周血B细胞数的降幅大,以组织样B细胞和活化的记忆B细胞为主；淋巴组织耗竭,胸腺消失；具更高的抗淋巴组织的自身抗体的水平.而RM450和RM453猴(EC型)大致与之相反.结论 AIDS的形成可能与T、B淋巴细胞亚群的分化和功能不足有关；而胸腺、淋巴组织等的结构破坏,可能是其病理学基础.
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实时荧光定量PCR技术快速评价恒河猴外周血SIV病毒储存库的方法学建立
目的：实时荧光定量PCR( real-time fluorescent quantitative PCR)技术快速评估恒河猴外周血细胞中的猴免疫缺陷病毒( SIV)病毒储存库的方法学及初步应用。方法以SIVmac239毒株序列为标准,在gag保守区设计1对引物和TaqMan探针,用于实时定量PCR扩增。 EcoRⅠ和SpeⅠ酶切含有SIVmac239毒株5′端长片段(含SIV-gag区)的质粒p239SpSp5,得到长度为2090 bp的SIV-gag区保守片段,纯化后定量系列标准品以绘制标准曲线。测定SIVmac239毒株感染恒河猴急性期和慢性期的外周血单个核细胞中SIV DNA拷贝数以反映病毒储存库水平,并分析该水平在不同感染状态中的病毒学特征。结果标准品浓度在10~1010拷贝/μl之间与Ct值呈线性正相关。 SIV急性期感染14~22 d可测出高水平的SIV病毒DNA,急性期病毒DNA水平高于慢性期1~2个log水平。相同动物样本的每106个细胞中的病毒DNA水平较其血清中病毒载量低将近1个log左右。 SIV病毒DNA水平与病毒载量比值( DNA/RNA)在慢性感染期显著高于急性期。结论本研究制备的SIV病毒DNA荧光探针定量RT-PCR方法特异性、敏感性高,线性范围广,可用于评估猴免疫缺陷病毒潜伏的病毒储存库水平。higher than those in the acute phase. Conclusion The established TaqMan probe-based real-time fluores-cent quantitative PCR was a highly sensitive and specific assay for the detection of SIV DNA with an advan-tage of wide linear range. It could be used for the quantitative evaluation of latent reservoirs of SIV.
关键词： 猴免疫缺陷病毒 病毒储存库 实时荧光定量RT-PCR -
中国恒河猴SIV急性感染期模型CD4细胞和MBL的变化
目的 研究中国恒河猴猴免疫缺陷病毒(SIV)mac239急性期感染模型外,周血CD4+T淋巴细胞(简称CD4细胞)、淋巴结CD4细胞和血清甘露糖结合凝集素(MBL)的变化情况,探索感染早期固有免疫与适应性免疫的病理变化.方法 选用5只健康中国恒河猴,静脉接种SIVmac239病毒株,分别于感染前、感染后2周、4周和10周检测血常规、血浆病毒载量,流式细胞仪分析外周血淋巴细胞亚群,免疫组织化学染色法观察淋巴结CD4细胞,酶联免疫吸附试验法检测血清MBL.结果 感染后CD4细胞比值较感染前降低27.3％ (P＜0.05),CD8细胞比值较感染前升高44.3％ (P＜0.05),外周血CD4细胞绝对数下降23.6％,淋巴结CD4细胞上升14.9％,但是差异无统计学意义.血清MBL在感染后10周内持续下降至感染前水平的24.5％ (P＜0.01).结论 SIV急性感染期固有免疫破坏显著,适应性免疫主要表现为体液免疫与细胞免疫的失衡.
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淫羊藿苷及其代谢产物脱水淫羊藿素体外抑制猴免疫缺陷病毒复制作用
目的 观察淫羊藿苷及其代谢产物脱水淫羊藿素体外对猴免疫缺陷病毒的抑制作用.方法 用CCK-8检测不同浓度的淫羊藿苷与代谢产物脱水淫羊藿素对CEMx174细胞的毒性;以SWmac251感染CEMx174细胞为模型,观察细胞病变效应(CPE);实时套式反转录荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞内猴免疫缺陷病毒(SIV)核糖核酸(RNA)相对量和上清中病毒载量三个指标,来评估淫羊藿苷与代谢产物脱水淫羊藿素对SIV复制的抑制作用.结果 淫羊藿苷和脱水淫羊藿素的大无毒浓度分别是50μg·mL-1,16 μg·mL-1.在细胞内,淫羊藿苷(50,25,12.5 μg·mL-1)和脱水淫羊藿素(16,8,4 μg·mL-1)组SIV RNA相对量都明显比病毒对照组低(P＜0.01,P＜0.05),且具有一定的量效关系.同时在上清中,淫羊藿苷(50,25 μg·mL-1)和脱水淫羊藿素(16,8,4μg·mL-1)组病毒载量明显比病毒对照组低(P＜0.01,P＜0.05),也存在一定的量效关系.以上药物浓度与病毒对照组比较均具有统计学差异.结论 淫羊藿苷及其代谢产物脱水淫羊藿素均对SIV的复制起到抑制作用,具有深入研究和开发的前景.
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高效抗逆转录病毒治疗后HIV感染者CTL应答研究现状
高效抗逆转录病毒治疗(Highly active antiretroviral therapy,HAART)明显降低了艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)感染者的发病率和死亡率,随着HIV-1被抑制于不可检测水平,CD4T细胞数明显增加,部分免疫功能重建,肺孢子虫、弓型虫、分支杆菌、真菌等并发感染明显得到控制.虽已在猴免疫缺陷病毒(SIV)感染猿猴的模型以及人体实验中证实,HIV特异性细胞毒性T细胞(CTL)在控制HIV感染中起着关键作用,然而HAART治疗后CTL功能不能完全恢复,以至不能彻底清除HIV.所以HAART治疗后CTL功能重建目前是HIV治疗的研究热点.HAART治疗后CTL应答的研究,对于了解HIV感染与宿主免疫功能之间的关系,以及免疫功能重建、开发疫苗等方面均有十分重要的意义.现就近几年对HAART治疗后CTL应答规律、影响CTL应答的机制、如何提高CTL应答效应等方面做一综述.
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HIV-1感染急性期细胞因子动力学特点及其作用
细胞因子在艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)感染的发病机制中发挥着重要作用.许多研究表明,在HIV/猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的急性期,细胞因子可以影响几个月后的病毒调定点,而后者将影响慢性期病情进展和病毒传播.在感染急性期,早期细胞因子环境可能是疫苗研发和感染治疗的一个新靶标.文章重点对急性HIV-1/SIV感染期的细胞因子动力学和功能及其对病毒调定点的影响进行综述,这将有利于理解急性HIV-1感染期细胞因子的作用,并为防治策略的制定提供新的思路.
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灵长类动物模型在抗艾滋病毒药物研究中的应用
艾滋病(AIDS)灵长类动物模型广泛用于艾滋病毒(HIV)研究.较为常用的有猴免疫缺陷病毒(SIV)/猕猴模型和猴/人免疫缺陷嵌合病毒(SHIV)/猕猴模型,除了在发病机制和抗HIV疫苗研究中的重要作用外,这2种模型在抗HIV药物研究中同样显示出优越性和实用性,体现在药物疗效的研究、新药的开发、耐药性研究、机体免疫反应在药物治疗作用的研究中.通过这些体内抗病毒活性及机制的研究,可进一步揭示药物的抗HIV疗效,对AIDS的临床用药具有重要的指导作用,将使人们重新考虑抗HIV药物的用药原则和药效评价标准.
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中研Ⅱ号抗SIVmac感染机理的初步研究
通过体外和体内实验研究中研Ⅱ号抗猴免疫缺陷病毒(SIV)感染作用和免疫调节作用,结果表明:中研Ⅱ号在体外缺乏直接的抗SIV感染作用;而体内实验显示中研Ⅱ号对SIV感染所致的猴艾滋病模型免疫系统的功能状态具有一定的调节作用,表现为抑制感染早期异常的免疫细胞活化,促进晚期抑制状态的免疫细胞活化,对不同感染时期的免疫功能呈双相调节作用.中研Ⅱ号通过对细胞功能紊乱的调节实现其免疫保护作用,这可能是其治疗艾滋病的药理基础.
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猴免疫缺陷病毒(SIV)双抗原夹心ELISA诊断试剂盒的研制及应用
目的 研制灵敏、特异的检测血清中猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus,SIV)的双抗原夹心ELISA(dsELISA)诊断试剂盒并进行初步应用.方法 采用原核表达系统表达并纯化的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)包膜蛋白(gp41)作为包被用抗原,建立dsELISA诊断方法.通过优化反应条件和筛选试剂,研制ELISA诊断试剂盒,经敏感性、特异性和重复性试验考核试剂盒的质量,并与美国BIORELIANCE公司试剂盒进行比较,将结果经美国VRL验证,判断本试剂盒与美国BIORELIANCE公司试剂盒两者之间的符合率.结果 该试剂盒具有良好的灵敏度、稳定性和准确性.4℃条件下能保存8个月,与其他血清无交叉反应,与美国BIORELIANCE公司试剂盒检测结果的符合率为96%.结论 研制成功的实验猴SIV ELISA检测试剂盒可用于临床检测.
关键词： 猴免疫缺陷病毒 双抗原夹心ELISA法 试剂盒 -
SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立
目的 建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA.方法 巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEM T载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒.该质粒经大量扩增纯化后定量,10倍系列稀释后,做出标准曲线,作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品.结果 应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit,该标准品可精确定量到10 copies/μL.结论 制备的pGEM-SIVgag477质粒外标准品纯度高,SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA载量.
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SIV 感染猴外周血CD14+ 单核细胞CD169分子表达的变化
目的 研究正常恒河猴感染SIVmac239前后外周血单核细胞以及各亚群单核细胞表面CD169分子表达量的变化及可能的原因.方法 正常恒河猴在静脉攻毒后,流式细胞术检测感染前后外周血单核细胞比例及其表面分子CD169表达量的变化;SIVmac239直接感染和不同细胞因子刺激流式分选出的正常恒河猴外周血CD14 +单核细胞,流式细胞术检测细胞表面CD169和细胞因子IFN-α表达量的变化.结果 SIVmac239感染正常恒河猴后,CD14 +单核细胞的比例下降,CD14 +单核细胞表面分子CD169表达量升高;外周血中不同单核细胞亚群CD169的表达量均显著增加,CD14 +CD16 + +单核细胞中 CD169表达量的升高更为明显.正常恒河猴外周血CD14 +单核细胞经细胞因子M-CSF、IL-4和IL-13刺激后,细胞表面不表达CD169;经细胞因子IFN-α刺激后,高表达CD169;SIVmac239病毒直接感染CD14 +单核细胞,细胞表面CD169与胞内细胞因子IFN-α的表达均无变化.结论 SIVmac239病毒感染恒河猴后,可引起外周血单核细胞CD169分子表达量的升高,其表达与病毒直接感染单核细胞无关,与体内其它细胞分泌的细胞因子IFN-α相关.
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SIVmac239病毒感染CEMx174细胞过程分析
目的 运用不同的技术方法 ,观察SIVmac239感染CEMx174细胞的全过程.方法SIVmac239病毒感染CEMx174细胞后,分别在不同的时间点收集培养上清和细胞,应用实时荧光定量PCR方法检测培养上清中的病毒载量;IFA检测并用激光扫描共聚焦显微镜观察病毒定位及复制情况;胞内流式、Western blot检测细胞内病毒蛋白p27的表达量.结果 SIVmac239吸附并感染CEMx174后,第0.5 h时,细胞胞膜上检测到病毒颗粒;第12 h时,培养上清中的病毒RNA水平出现下降;此后至第96 h,病毒持续复制,细胞胞浆内病毒蛋白p27表达量逐渐增加,培养上清中病毒RNA水平持续升高.结论 病毒感染细胞时,首先吸附在细胞膜上,然后进入细胞持续复制和表达.
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融合蛋白XE-TNFαm2对SIV的抑制作用
目的 检测XE-TNFαm2靶向融合蛋白作为新型生物性药物抑制SIV病毒感染CEMx-174细胞的作用.方法 XE-TNFαm2、SIV和CEMx-174细胞共同培养,在培养的第5天,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清中P27抗原水平,间接免疫荧光法(IFA)和流式细胞仪测试SIV阳性细胞,应用PE-annexin V凋亡检测试剂盒测试细胞存活率和凋亡率.结果 XE-TNFαm2在细胞安全大药物浓度50μg/mL时,对SIV病毒抑制率为40％.细胞早期凋亡率在XE-TNFαm2浓度6.25 μg/mL时为37.1％.结论 融合蛋白XE-TNFαm2对SIV病毒有一定的抑制作用,其中部分作用推测是因通过诱导感染细胞产生凋亡导致病毒死亡.
