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对SARS诊断产品审评的思考
自SARS流行以来,在世界范围内展开了针对新型冠状病毒的预防、诊断及治疗等多方面的研究工作,国内诊断试剂的研发单位积极的投入到针对新型冠状病毒诊断技术的研发之中.药审中心在这种特殊时期,先后对抗体测定试剂盒和病毒核酸测定试剂盒进行了审评,现将对SARS诊断产品审评过程中的一些思考进行总结,一方面积累对应急产品的审评经验,以提高对应急产品的审评能力.另一方面让使用者了解该类产品的审评情况,以便对其临床使用价值有恰当的认识,以利于临床医生准确的理解和合理使用其实验结果,同时希望通过对审评思路的梳理,有助于应急产品的研发.
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国产乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)定量检测试剂盒技术现状介绍
利用核酸扩增技术(PCR)定量检测样本中HBVDNA是乙型肝炎治疗过程中疗效监测的重要手段之一.继乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)定性检测试剂盒批准临床使用之后,定量检测试剂盒也已陆续批准临床使用.本文对乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)定量检测试剂盒的技术现状,国家定量检测标准品的组成、定值方法、合格标准及国产试剂存在的问题等方面作一粗浅的介绍,以供使用者、临床医生及诊断试剂的研发者参考.
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重组SARS病毒N蛋白的制备及其初步应用
目的 在大肠杆菌中表达重组SARS-CoV N蛋白,并进行纯化,为进一步研制SARS早期诊断试剂奠定基础.方法 通过RT-PCR获得SARS-CoV N蛋白基因片段,并克隆至大肠杆菌表达载体pQE30中,构建重组质粒.转化E.coli M15,IPIG诱导表达.经SDS-PAGE和Western blot鉴定,采用Chelating-Sepharose Fast Flow纯化融合蛋白,并免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清抗体水平.结果 所构建的重组表达载体pQE30-N经诱导可表达重组SARS病毒N蛋白.该蛋白纯化后,纯度可达90%左右.Western blot检测表明,重组SARS病毒N蛋白可与SARS患者恢复期血清呈现特异的免疫反应.免疫BALB/c小鼠可获得高效价抗血清.结论 重组SARS-CoV N蛋白具有良好的抗原性,可用于SARS-CoV感染的早期诊断.
关键词： 严重急性呼吸综合征冠状病毒 N蛋白 诊断试剂 多克隆抗体 -
趋势分析法评价乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂的质量
目的 应用趋势分析法评价我国乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂质量.方法 采用同一批次国家参考品进行批批检验,且检验均合格的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂A、B、C、D的数据,对不同血清型、不同浓度样品的检测结果进行趋势分析,以理论平均值±2 SD为警戒限,平均值±3 SD为行动限,将检测结果超出行动限、连续3批检验结果超出警戒限或检验结果趋势有严重漂移(连续6批结果上升或下降或连续8批结果在均值同一侧)暂定为偏离数据,观察诊断试剂的各检测指标的变化趋势.结果 在2011年3月～ 2013年5月的观察时间内,A、B、C试剂均出现8～ 10批次数据在均值同侧的情况,判定为存在偏离数据;D试剂质量稳定,未出现试验数据严重漂移的批次.结论 趋势分析可反映乙型肝炎病毒诊断试剂质量的变化,为保证试剂质量的稳定提供了方法.
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HIV抗体快速诊断试剂与酶联免疫诊断试剂灵敏度比较
目的比较HIV抗体快速诊断试剂与抗体酶联免疫诊断试剂检测不同样品灵敏度的差异.方法用HIV抗体诊断试剂和HIV抗体酶联免疫诊断试剂分别检测HIV抗体酶联免疫试剂国家参考品、HIV不同亚型样品以及HIV高危人群样品.结果检测HIV抗体酶联免疫试剂国家参考品中,20份阳性样品只检出10份阳生,5份低检出限样品只检出1份阳性.与酶联免疫试剂相比,对B亚型样品的检测,其灵敏度低2～8倍;对AE重组样品,其灵敏度低100倍;对BC重组样品,其灵敏度低2～10倍.在HIV高危人群样品中,与酶联免疫诊断试剂阳性符合率为88.2%,阴性符合率为97.3%.结论快速诊断试剂的灵敏度明显低于酶联免疫诊断试剂,因此,其应用范围不能等同于酶联免疫诊断试剂.
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乙型肝炎病毒表面抗原变异对免疫诊断试剂检测结果的影响
乙型肝炎疫苗和抗病毒药物在全球的广泛应用有效地防止了乙肝病毒(HBV)的感染.但随之而来的问题是在疫苗免疫后的人群、进行抗病毒治疗的患者以及慢性HBV感染的人群中,出现了HBV表面抗原的变异,而大量文献报道了免疫诊断试剂对变异表面抗原的漏检.本文对乙肝病毒表面抗原变异对免疫诊断试剂检测结果的影响作一综述.
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趋势分析法评价我国用于血液筛查中丙型肝炎病毒抗体诊断试剂的质量
目的 趋势分析法评价我国用于血液筛查中丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体诊断试剂的质量.方法 选取2014年1月～2015年12月期间,经同批国家参考品进行批批检定的国内3个厂家HCV抗体诊断试剂(编码A、B、C,分别为53、55和64个连续批次)作为研究对象,对3种试剂检测第5套HCV抗体诊断试剂国家参考品中的弱阳性参考品(P9、P27)和低检出限L3(界值参考品)的结果进行趋势分析.同时将中检院和企业C自检的37℃加速稳定性试验结果进行比较.结果试剂A的趋势分析发现,L3样品出现了第4～ 14批检测数据在均值同侧的情况,被界定为偏离数据,第4～ 14批与15批以后的检测S/CO值差异有统计学意义(P＜0.001);试剂B趋势分析发现,P27样品出现了第26 ～ 34批检测数据在均值同侧的情况,被界定为偏离数据,第26 ～ 34批与35批以后的检测S/CO值差异有统计学意义(P＜0.05);试剂C的趋势分析发现,L3样品出现了第42～50、57～64批检测数据在均值同侧的情况,被界定为偏离数据,第57 ～ 64批与56批之前的检测S/CO值差异有统计学意义(P＜0.01).中检院与企业C自检P9、P27和L3样品37℃加速稳定性结果差异均有统计学意义(P均＜0.01).结论 趋势分析可反映HCV抗体诊断试剂质量变化,该方法可用于试剂质量稳定性的评价.
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趋势分析方法在HIV血液筛查诊断试剂评价中的应用
目的 评价趋势分析方法用于HIV血液筛查诊断试剂的质量稳定性.方法 以国产3个厂家(A、B、C)的HIV血液筛查诊断试剂作为研究对象,采用各试剂连续批次检测灵敏度界值参考品S4、HIV-1型中等反应性样品(P18)、HIV-2型低反应性样品(P19)、阴性参考品的阴性符合比例,绘制Levey-Jennings趋势分析质控图,计算每个样品的检测平均值(mean)和标准差(SD),以mean±2SD作为警戒限,mean±3SD作为行动限,观察各厂家诊断试剂的检测指标变化趋势.结果 试剂A质量稳定,S4、P18和P19样品的检测结果均未见超过行动限的批次;试剂B和C的阴性参考品阴性符合比例的变化均呈现在趋势分析中,试剂B检测P18样品出现2个批次检测结果超过行动限,试剂C连续8批S4、P18和P19样品的检测结果在均值同侧.在37℃加速稳定性试验中,32批试剂C分别检测P18、P19和S4样品的变化趋势一致;S4样品37℃加速稳定性及4℃稳定性检测结果差异有统计学意义(P＜0.01);企业和中检院S4、P18和P19样品37℃加速稳定性结果差异均有统计学意义(P均＜0.01).结论 我国血液筛查试剂质量稳定,趋势分析可发现试剂质量变化,可尝试用于HIV体外诊断试剂的稳定性评价.
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第6套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制
目的 研制第6套丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体诊断试剂国家参考品.方法 从我国10省市血站及生物制品企业的供血员中筛选候选参考品血浆样本304份,采用国内外27种检测试剂进行HCV Ag、HCV Ab及HCV RNA检测后,应用CHIRON公司的RIBA HCV 3.0 SIA及MP公司HCV BLOT 3.0试剂进行确证检测;利用Abbott RealTime HCV GenotypeⅡ试剂,对HCV RNA阳性样本进行HCV基因型别检测,并以核苷酸序列测定方法对分型样本进行确认.通过分析上述检测数据,从中拟选出协作标定样本,邀请国内外生产或市场使用占较大份额的11个实验室参加该套参考品标定.取低检出限参考品4份,分别于4、25和-20℃放置1、3、5、7、9和11d,或置-70℃反复冻融1～6次,进行稳定性试验.结果 选出65份样品组成第6套HCV抗体诊断试剂国家参考品,其中包括阴性参考品30份,阳性参考品30份,低检出限参考品4份,精密性参考品1份.应用11家的16种HCV抗体试剂分别平行3次标定检测,阴、阳性参考品符合率均≥29/30;低检出限参考品检测L1 ～ L3均为阳性,L4为阴性;精密性参考品检测CV在1％ ～11％之间.不同温度保存11d及-70℃保存反复冻融6次的检测结果均符合要求(P＞0.05).结论 建立了应用于血液筛查丙型肝炎病毒抗体试剂质量控制的第6套HCV抗体国家参考品.
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B.abortus 544A和B.melitensis 16M多克隆抗体的制备及鉴定
目的 制备高效价、高纯度的布鲁菌多克隆抗体,作为检测布鲁菌的诊断试剂.方法 采用弗氏佐剂乳化抗原家兔背部皮下多点免疫,制备抗体,纯化后用SDS-PAGE进行鉴定,ELISA法检测抗体水平,紫外分光光度仪检测蛋白质含量,AlphaScreen Rabbit IgG Detection Kit检测IgG含量,并计算纯度.结果 SDS-PAGE结果显示多抗片段大小与预期相符,B.melitensis 16M和B.aborius 544A抗体效价分别为1∶25 600和1∶51 200,纯化后抗体蛋白含量分别为11.32和14.03 mg/ml,IgG含量分别为10.45和13.12 mg/ml,且纯度分别达到92.3%和93.5%.结论 已获得高效价、高纯度的多克隆抗体IgG,为建立布鲁菌免疫检测方法奠定了基础.
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第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品的研制
目的研制第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品.方法从国内13省市几十万名供血员中筛选样品,用多种试剂对收集到的2 000多份血样进行复检,从中选出317份样品,用国外3种抗-HCV EIA试剂及国内4种抗-HCVEIA试剂进行检测,对可能被选入参考品的样品,再用CHIRON公司抗-HCV RIBA确证试剂,HCV RNA PCR试剂和CHIRON公司HCV RNA TMA试剂进行了确证.利用HCV基因分型试剂对部分样品进行HCV基因型别检测,并对部分分型结果用核苷酸序列测定的方法确证.21个实验室会同标定.结果建立了第5套丙型肝炎病毒抗体诊断试剂国家参考品及相应的质量标准.结论自2004年10月1日起,第5套抗-HCV国家参考品已被国家有关部门批准正式使用.
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人巨细胞病毒pp65 IgG-AI快速诊断试剂的临床应用
目的 评价人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)pp65 IgC-亲和力指数(Aviaity index,AI)快速诊断试剂的临床应用价值.方法 以自制的截短pp65重组蛋白作为诊断试剂,对本室血清库中保存的标本,采用ELISA间接法检测其特异性IgG抗体,分析该试剂的灵敏度、特异性和准确度.检测临床收集的89份患者血清标本(其中5例被明确诊断为HCMV活动性感染)的pp65 IgG抗体,并与意大利DIESSE公司IgG检测试剂盒结果进行比较.同时,对pp65 IgG阳性标本,运用尿素变性ELISA间接法检测其AI值,与意大利DIESSE公司IgM检测试剂盒结果进行比较,评价AI检测在HCMV感染诊断中的价值.结果 用pp65快速诊断试剂检测阳性、阴性血清特异性IgG抗体,均与原确认结果相同,灵敏度、准确度和特异性均达100%.两种诊断试剂IgG抗体检测结果,差异无显著意义.pp65诊断试剂对pp65 IgG阳性标本的AI值进行检测,AI＜60%标本共41份,阳性率为46.07%,较参比试剂IgM检测阳性率(23.59%)高;5份明确诊断HCMV活动性感染的患者血清标本中,pp65诊断试剂与参比试剂检测IgG抗体,各有4份阳性,一致率为100%,pp65诊断试剂检测AI值为阳性的标本有3份,其中,参比试剂检测ISM为阳性的仅有1份.临床明确诊断为HCMV肺炎的患者血清标本,诊断试剂检测AI值为可疑阳性,但参比试剂检测HCMV IgM抗体为阴性.结论 pp65 IgG-AI快速诊断试剂可初步诊断HCMV感染,简单快速,重复性好,具有良好的临床应用前景.
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HpaA蛋白在幽门螺杆菌感染诊断中的应用
目的 建立检测血清HpaA抗体的ELISA间接法,探讨以重组蛋白作为抗原在诊断H.pylori感染中的价值.方法 将从临床分离菌株中获得的HpaA基因在大肠杆菌中表达,用Ni2+ -NTA柱纯化表达的HpaA作为抗原,建立检测血清HpaA抗体的ELISA间接法,与诊断标准比较评价其应用的可行性.结果 经超声破碎后,用SDS-PAGE分析显示,HpaA蛋白主要存在于上清中,纯化抗原检测临床标本中HpaA抗体的敏感性和特异性分别为100.0%和90.1%.结论 以重组蛋白为抗原初步建立检测血清HpaA抗体的ELISA间接法敏感性、特异性高,为制备商品化的试剂盒奠定了基础.
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人类免疫缺陷病毒抗体快速检测试剂的临床评价
目的 评价人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体快速检测试剂检测全血、血清或血浆样品中HIV抗体的敏感性及特异性.方法 从不同地区及不同人群中收集全血样品493份,并分离血清,用考核试剂分别检测同一人的全血及血清样品;同时从不同地区及不同人群中收集HIV抗体阳性和阴性血清/血浆样品共1175份,用考核试剂和参比试剂同时检测.结果 考核试剂检测493份全血和血清样品的结果一致,HIV抗体阳性为99份;与参比试剂相比,考核试剂检测血清/血浆样品的敏感性为100%,特异性为99.92%.结论 该考核试剂与参比试剂的质量相当.
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冻干血吸虫病诊断试剂IgG免疫血清国家参考品的制备及标定
目的建立血吸虫病诊断试剂IgG免疫血清国家参考品.方法收集血吸虫病疫区粪检筛查阳性病人血清和非疫区正常人血清,经标定和验证合格,制成冻干参考品.结果冻干参考品血清效价符合要求,2家协作单位用3种免疫学方法标定,结果一致.结论所制备的冻干参考品可以用于血吸虫病抗体诊断试剂的检定.
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发光试剂与酶联免疫试剂检测丙型肝炎抗体的临床评价
目的对丙型肝炎抗体的酶联免疫试剂和化学发光试剂进行临床考核和比较.方法用国外进口注册的抗HCV酶联免疫试剂和化学发光试剂检测丙型肝炎试剂国家参考品和283份可疑丙肝感染者血样,对不一致样品再用HCV RI-BA和HCV RNA PCR试剂进行确证.结果两种试剂均可达到国家标准,酶联免疫试剂特异性较好,化学发光试剂灵敏度较高.结论两种试剂均可用于丙型肝炎抗体检测.
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VIDAS HIV Duo Assay试剂的特异性及敏感性
目的 评价HIV抗原/抗体联合检测快速法(VIDAS HIV Duo Quick)和超敏法(VIDAS HIV Duo Ultra)试剂的特异性及敏感性.方法 用这2种试剂和HIV抗体参比试剂,分别检测287份HIV感染或疑似感染者样品、1 240份非HIV感染者血清/血浆样品,对与参比试剂检测结果不一致样品,进行抗体的确认及HIV p24抗原和RNA的检测,并比较其特异性和敏感性.用这2种试剂和HIV-1 p24抗原参比试剂,分别检测3株病毒培养上清的系列稀释样品,并比较其检测 p24抗原敏感性的差异.结果 共检测1 277份HIV抗体阴性样品和250份HIV抗体阳性样品,与参比试剂相比,快速法试剂的特异性为99.45%,敏感性为100%,而超敏法试剂的特异性为99.14%,敏感性为99.20%.两种试剂检测病毒株培养上清的敏感性均不低于HIV-1 p24抗原参比试剂,且能检出HIV感染窗口期样品.结论 这2种试剂在增加HIV p24抗原检测的情况下,对HIV抗体检测的特异性和敏感性均没有明显降低,并且能检测出HIV感染窗口期样品.
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抗环瓜氨酸肽抗体定量检测ELISA试剂盒的制备及其诊断类风湿性关节炎的意义
目的 制备抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体定量检测ELISA试剂盒,并探讨其诊断类风湿性关节炎(RA)的意义.方法 应用作者合成的CCP制备抗CCP抗体定量检测试剂盒,并进行鉴定.应用该试剂盒检测178份RA患者和712份非RA患者及健康人血清,评价其在RA诊断中的价值.结果 所制备的定量检测试剂盒cutoff值为25 RU/ml;线性良好,R2值大于0.99;试验内变异系数为5.15%～8.25%,试验间变异系数为6.82%～11.23%;平均回收率为99.7%.该试剂盒在4℃保存6个月,稳定性良好.与国外同类试剂盒同时测定80份样本,阳性符合率为95.7%,阴性符合率为97.1%,总体符合率为96.3%.该试剂盒对RA诊断的敏感性为73.O%,特异性为98.2%.结论 所制备的试剂盒各项指标均达到相关要求,能够满足临床检测的需要.
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抗霍乱弧菌O1群单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的 制备抗霍乱弧菌O1群特异性单克隆抗体(McAb),并进行鉴定.方法 以福尔马林灭活的O1群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立分泌抗O1群霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株.对配对较好的6个细胞株分泌的McAb进行腹水效价、免疫球蛋白类及亚类、抗体亲和常数测定及凝集试验和稳定性试验.与细菌培养法对比检测208份临床标本.结果 6个细胞株分泌的McAb腹水效价均为105,均为IgM;抗体亲和常数为1.84×105～5.38 × 107;且均与O1群霍乱弧菌菌株发生凝集反应,与霍乱弧菌O139群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌O157:H7、副溶血弧菌、麦弧菌、河弧菌、结肠炎耶尔森菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及各型副伤寒杆菌均不发生凝集反应.6个分泌McAb的细胞株连续培养15周,经液氮冻存12个月后复苏,仍能稳定分泌抗体;与细菌培养法对比检测208份临床标本,特异性和灵敏度均达100%.结论 制备的McAb具有较高的特异性,有可能用于开发霍乱弧菌O1群的检测试剂.
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第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品的研制
目的研制第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品.方法从国内11省市几十万名供血员中筛选出871份样品,以多种试剂对其进行复核,对备选参比品样品再进行免疫荧光吸收法检测,并对人类免疫缺陷病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、类风湿因子及非特异性抗体进行检测.根据样品复检及确证结果,选定30份样品,分装并分发至11个实验室,进行会同标定.结果已制备出第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品,并建立了相应的质量标准.结论第二套梅毒螺旋体抗体诊断试剂国家参考品已被国家有关部门批准正式使用.
