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噬菌体展示技术筛选人隐孢子虫P23抗原表位
目的 本研究利用噬菌体展示技术筛选人隐孢子虫P23抗原表位,为研制其抗原表位疫苗奠定基础.方法 首先用人隐孢子虫重组P23抗原免疫动物以制备抗体,将该抗体与噬菌体展示随机肽库结合,通过ELISA和Western-blot方法鉴定阳性克隆,并对阳性克隆进行增殖,然后对其序列测定和抗原表位预测.结果 噬菌体肽库结合抗体后,经ELISA方法可鉴定10株为阳性克隆,Western-blot检测可发现有67 kD目的 条带出现;序列分析结果可发现它们中具有3个不同结构表位序列,命名为ep1,ep2,ep3,且预测出具有良好的亲水性.结论 所得序列是具有B细胞抗原表位.
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人源抗EV71病毒中和表位SP70的Fab抗体研制
目的 构建人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库,筛选具有中和活性的人源单克隆抗体,为EV71感染引起的手足口病临床诊断及治疗奠定基础.方法 从成人志愿者抗凝血中分离外周淋巴细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA.以cDNA为模板,用人源IgG Fab段基因引物扩增轻链及重链Fd区基因,分步克隆至pComb3载体,构建Fab噬菌体抗体库.以SP70为抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,将获得的重组噬菌体感染XL1-Blue菌并诱导表达,用SP70对诱导表达的菌上清进行筛选.结果 共获得3株轻、重链基因组合序列不同的克隆,且这3株Fab抗体可特异性结合SP70多肽.结论 成功构建人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库,并从中筛选出3株针对EV71病毒结构蛋白VP1上中和线性表位SP70的特异性人源Fab抗体,为研发新的手足口病诊断和治疗工具奠定基础.
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利用噬菌体载体展示抗体文库技术研究进展
1985年,美国Missouri大学的Smith GP将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage, fd)的基因组,使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示,从而创建了噬菌体展示技术(1).
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噬菌体展示技术在幽门螺杆菌研究中的作用
1985年,噬菌体展示(Phage display)由Smith[1]早提出,1994年McCaffery等[2]先构建了噬菌体多肽和抗体展示文库,开始了噬菌体展示技术广泛应用的新时代.10多年来,噬菌体展示技术被用于抗体的制备,多肽及蛋白质和酶的制备,随着噬菌体展示技术的进一步发展,优越性被广泛认识,使用范围不断扩展.根据其基本原理一系列不同的噬菌体文库的构建使本技术的应用得到不断扩展.
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噬菌体展示技术在肿瘤研究中的应用
噬菌体展示技术是将外源性基因通过基因工程手段与噬菌体基因融合，使外源基因编码的多肽呈现在噬菌体表面，并保持外源性多肽相对独立的空间结构和生物活性。近期研究表明，利用噬菌体展示技术可进行肿瘤靶向肽的筛选、抗癌物质的靶向输送、肿瘤疫苗的研制、肿瘤抗体的制备、肿瘤诊断试剂的研发、肿瘤血管的光学成像等，进而为攻克肿瘤这一医学难题提供帮助。
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转化生长因子-β1噬菌体模拟肽促进成纤维细胞增殖的效果
目的：从噬菌体随机12肽库中筛选获得转化生长因子β1（TGF-β1）噬菌体模拟肽，评估其促进人正常皮肤成纤维细胞增殖的效果。方法以人TGF-β1单克隆抗体为靶，生物淘选噬菌体模拟肽。选择其中一组与TGF-β1基因序列相似度高的噬菌体模拟肽，设定4组，阴性对照组、噬菌体M13对照组、TGF-β1对照组和噬菌体模拟肽组。噻唑蓝（MTT）比色法定量测定活细胞数量以检测细胞的增殖。免疫荧光方法检测噬菌体模拟肽与成纤维细胞的亲和力。实时定量PCR分析方法检测成纤维细胞I型胶原蛋白（COL1）、Ⅲ型胶原蛋白（COL3）和结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA表达水平。结果共获得10种噬菌体模拟肽，选择与TGF-β1基因序列相似度高的第一组噬菌体模拟肽进行实验。MTT结果显示，噬菌体模拟肽组能够促进成纤维细胞增殖（P＜0．05）。免疫荧光结果显示，噬菌体上的模拟肽，而非噬菌体本身，能够与成纤维细胞结合；实时定量PCR的结果显示，48 h噬菌体模拟肽组COL1和COL3 mRNA的表达水平较阴性对照组和噬菌体M13对照组均明显增高（P＜0．05），而CTGF的mRNA表达水平较阴性对照组和噬菌体M13对照组2 d时明显增高（P＜0．05），3 d时表达有所降低（P＜0．05）。结论噬菌体模拟肽可能是通过调节CTGF的表达，调节成纤维细胞的增殖。
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全人源抗前列腺癌ScFv抗体的筛选及生物学特性研究
目的 从已成功建立的前列腺癌噬菌体抗体库中筛选抗人前列腺癌单链抗体(ScFv),并分析其生物学特性.方法 以良性前列腺增生(BPH)细胞与噬菌体抗体库共孵育,去除抗体库中能够与BPH细胞结合的噬菌体抗体,再以前列腺癌细胞系DU145与去除非特异性结合后的噬菌体抗体库共孵育,通过“吸附-洗脱-扩增”对前列腺癌的噬菌体抗体库进行3轮的富集.采用流式细胞术筛选出对人前列腺癌细胞系DU145高亲合力的阳性克隆.阳性噬菌体克隆经亚克隆并转染大肠杆菌TG1,表达出可溶性ScFv抗体.采用流式细胞术、免疫荧光法分析其生物学特性.结果 以前列腺癌细胞系DU145为抗原,筛选出19个噬菌体抗体,经测定C11与DU145细胞亲合力高,亚克隆至原核表达载体表达纯化为C11 ScFv抗体.流式细胞术和免疫荧光法检测结果均显示,C11ScFv抗体与前列腺癌细胞DU145和PC3结合,与BPH细胞不结合.结论 通过噬菌体展示技术筛选到前列腺癌细胞系高亲合力的可溶性ScFv抗体,为进一步研究抗体的靶向性治疗奠定了基础.
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噬菌体展示技术及其在医药上的主要应用
噬菌体展示技术(phage display)是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术,编码多肽的DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后,以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面,不影响噬菌体的生活周期,同时可保持目的蛋白的天然构象,且能被相应的抗体或受体所识别[1].随着此项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术已在许多领域得到广泛的运用:抗原表位筛选及疫苗研制、多肽药物的筛选、疾病检测等,并显示了良好的发展前景.本文对近几年来噬菌体展示技术的研究及应用进展作以综述.
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噬菌体展示技术筛选胃癌高表达CD44分子特异性多肽序列的可行性分析
目的 探讨噬菌体展示技术筛选胃癌高表达CD44分子特异性多肽序列的可行性.方法 使用噬菌体展示随机十二肽文库,以CD44纯化蛋白为筛选靶点,进行4轮亲和力筛选.从第四轮的洗脱物中随机挑选30个噬菌体克隆,对这些克隆进行测序并对序列进行生物信息学分析.通过ELISA法检测噬菌体克隆对CD44分子的亲和力,挑选阳性克隆,再通过细胞免疫荧光法进一步鉴定阳性克隆.结果 从第4轮的洗脱物中随机挑选的30个噬菌体克隆中共有7种多肽序列,重复20次六肽基序WHXXXX.该基序与CD44透明质酸结合域能很好地结合,ELSIA法挑选出 S1、S2、 S5、 S7 四个阳性克隆.细胞免疫荧光法鉴定出对 CD44 亲和力好的克隆为S1-WHXXXXXXQQA.结论 通过噬菌体展示技术筛选S1-WHXXXXXXQQA多肽序列对CD44的亲和力和特异性好;该序列有望成为特异性探针用于胃癌的分子影像学诊断.
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噬菌体展示肽库在乳腺癌血清肿瘤标志物筛选中的应用
目的 用噬菌体随机12肽库对乳腺癌患者的血清进行差异性筛选,以获得乳腺癌特异性的新的肿瘤标志物. 方法 对噬菌体随机12肽库进行三轮差异性筛选,用ELISA法测定噬菌体克隆对乳腺癌患者血清结合的特异性.结果 经过三轮筛选,噬菌体富集率逐轮递增,经47例乳腺癌患者和正常人血清的ELISA法检测验证,获得一株与乳腺癌患者血清特异较好的噬菌体,经DNA测序和推导,其短肽序列为短肽(QVSAEHKVQGFW).结论 成功筛选到能与乳腺癌患者血清高亲和力特异结合的12肽序列,为今后研究乳腺癌肿瘤标志物奠定了基础.
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抗人结缔组织因子人源单链抗体的筛选、表达及活性鉴定
目的 从人源噬菌体抗体文库中筛选抗人结缔组织生长因子(CTGF)单链抗体(ScFv),原核表达并鉴定其活性.方法 以重组人源CTGF(rhCTGF)为靶标,对人源噬菌体抗体文库进行筛选；用Phage-ELISA筛选阳性克隆并进行原核表达、纯化,获得了高纯度的ScFv蛋白,通过ELISA和Millicell迁移实验鉴定其活性.结果 经过3轮筛选,获得1株特异性抗人CTGF ScFv 1C5,ELISA显示1C5能与rhCTGF特异性结合；在Millicell迁移实验中,1C5能抑制CTGF的生物学功能,具有中和活性.结论 成功筛选到1株抗人CTGF的ScFv,有望在CTGF相关疾病的治疗上发挥作用.
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大规模噬菌体DNA测序样品制备方法的改进与应用
目的 优化大规模噬菌体DNA测序样品制备的方法,提高筛选效率.方法 通过PCR扩增噬菌体环七肽库第一轮、第二轮和第三轮淘选产物中含插入目的片段噬菌体DNA,经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序鉴定,并与经典的噬菌体DNA提取方法进行比较.结果 PCR扩增法和经典法制备的噬菌体DNA的测序成功率分别为92.73%、93.75%,差异无统计学意义(P>0.05);两种方法制备的同一个噬菌体克隆的DNA经测序鉴定显示测序结果一致;第一轮、第二轮和第三轮淘选产物的噬菌体克隆经PCR扩增和电泳鉴定,发现无插入目的片段的噬菌体克隆检出率逐轮增加分别为1.04%、4.17%和22.69%(P<0.01).结论 PCR扩增含插入目的片段噬菌体DNA的方法可使大规模噬菌体筛选和DNA测序更加方便、快捷、实用,值得推广.
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广谱趋化作用抑制剂的体内筛选及其活性鉴定
目的 为抗炎药物的研发提供先导肽.方法 利用脂多糖(LPS)刺激SD大鼠建立炎症模型,应用噬菌体展示技术经大鼠体内筛选得到阳性噬菌体克隆,经体内回输实验、趋化抑制实验和竞争结合实验鉴定噬菌体克隆的活性,提取生物活性较好的10个阳性噬菌体克隆的DNA进行测序,据此推导插入的氨基酸序列.结果 经过三轮体内筛选,目的 噬菌体得到了有效富集.对10个趋化抑制效果较好的阳性噬菌体进行测序,共得到5个序列,其中有2个序列出现的频率均为30%.结论 利用噬菌体展示技术体内筛选方法得到了抑制趋化作用的相关肽;该相关肽可作为抗炎药物的先导肽.
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噬菌体抗体库技术研究进展
噬菌体展示技术(PDT)在模拟表位的筛选、筛选特定靶分子的配体、蛋白与蛋白间相互作用、细胞信号转导等基础研究,疾病的治疗和致病机理研究以及疫苗的制备、基因工程抗体的研发等领域均有广泛应用.
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噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒增强子Ⅰ结合蛋白的研究
目的通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)增强子Ⅰ(Enhl)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径.方法应用噬菌体展示技术,以HBV的增强子Ⅰ的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果噬菌体经富集后,从随机筛选的12个克隆中得到6个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV增强子Ⅰ结合的肝细胞蛋白,共编码3种蛋白.分别为3-磷脂酰肌醇激酶相关蛋白激酶、人类血清白蛋白、核膜孔复合体相互作用蛋白.结论用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV增强子Ⅰ结合的蛋白,分析了该蛋白的编码基因,可能是作用于增强子Ⅰ的反式作用因子,但它们对HBV增强子Ⅰ是否有转录调控作用还需进行进一步的研究证实.
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噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎表面抗原单链抗体库
[目的]应用噬菌体展示技术构建人源性抗乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)单链抗体(ScFv)库.[方法]提取经免疫具有乙肝表面抗体的正常人淋巴细胞总RNA,采用反转录、触减PCR扩增人免疫球蛋白G(IgG)重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),用Linker连接肽经重叠PCR将VH和VL基因连接成VH-Linker-VL形式的ScFv基因.将ScFv与pCANTAB-5E载体通过相同的酶切位点连接后,转化大肠杆菌TG1,经M13K07辅助噬菌体拯救,构建成全套人源性抗HBsAg ScFv库.[结果]成功构建了人源性抗HBsAg噬菌体ScFv库.[结论]人源性HBsAg噬菌体ScFv库的构建,为进一步筛选特异性高,具有治疗作用的乙肝抗体奠定基础.
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噬菌体展示技术筛选重组干扰素-β蛋白结合蛋白
目的:利用噬菌体展示技术筛选重组干扰素-β(IFN-β)肝细胞结合蛋白,探讨IFN-β抗病毒的分子生物学机制.方法:应用噬菌体展示技术,以重组的IFN-β蛋白包被酶联免疫板,作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程.经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列测定和生物信息学分析.结果:对肝细胞cDNA文库经过5轮的生物淘洗,从后一轮筛选的顶层琼脂中随机挑选40个克隆,构建克隆载体,序列测定后经过同源性搜索和生物信息学分析,确定了和IFN-β蛋白具有结合作用的肝细胞蛋白.结论:筛选到与IFN-β蛋白具有结合作用的多种具有不同生理、生化功能的肝细胞蛋白.
关键词： 噬菌体展示技术 干扰素-β(IFN-β) 结合蛋白 -
噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白的研究
目的:通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(oore promoter,CP)结合蛋白,为HBV复制机制和调控机制的研究探索新的途径.方法:应用噬菌体展示技术,以HBV的核心启动子的聚合酶链反应(PCR)产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果:噬菌体经富集后,随机筛选得到7个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV启动子结合的肝细胞蛋白基因序列,分别编码β2微球蛋白和3种未知功能蛋白.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了与HBV核心启动子结合的蛋白,分析了该蛋白的编码基因,为进一步研究HBV与肝细胞相互作用的分子生物学机制开辟了新的途径.
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应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白,探索NS5A-TP9的表达调节机制.方法:应用噬菌体展示技术,以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,回收产物构建克隆载体,对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索.结果:噬菌体经富集后,筛选出10个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有:补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和αl微球蛋白.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制,进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础.
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应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA的结合蛋白
目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白,探索HCTP4基因的表达调控机制.方法:应用噬菌体表面展示技术,以多聚酶链反应(PCR)技术扩增的HCTP4启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,回收产物并进行克隆化,对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果:噬菌体经富集后,筛选出12个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了与HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合的蛋白有:核糖体蛋白L15、视网膜母细胞瘤结合蛋白8.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究HCTP4的生物学调节机制,进一步阐明HCV核心蛋白的致病机制奠定了基础.
