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人天然Fab段噬菌体抗体库的构建及初步鉴定
目的构建人天然Fab段噬菌体抗体库,建立人源抗体制备技术平台,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法.方法从一个健康献血员取200ml新鲜血液,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA,依次将PCR产物插入载体pComb3相应位点,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13产生噬菌体抗体库,酶切和PCR鉴定有无插入片段,用白蛋白和IL2作为抗原进行筛选富集.结果部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增.Fab表达库容达约1.2×106,酶切和PCR显示有插入片段.用不同蛋白进行几轮筛选,抗体库得到了不同程度的富集.结论本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体,用于免疫治疗打下基础.
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人天然噬菌体抗体库的构建及抗gp96抗体的初步筛选
目的 构建人天然Fab段抗体库,并用从膀胱尿路上皮癌组织中提取纯化的gp96筛选抗gp96特异性抗体,为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法 .方法 取4个健康献血员新鲜血液各200 ml,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA.轻链PCR产物和噬粒载体pComb3经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ酶切,由T4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取噬粒,构建轻链库.轻链库和重链Fd段PCR产物经Xho Ⅰ和Spe Ⅰ酶切,以同样方法 连接后转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13,产生噬菌体抗体全库.提取噬粒酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段.分别以噬菌体全库和提取的噬粒为模板,以轻、重链不同引物组合进行PCR扩增.应用亲和层析和离子交换层析从膀胱癌组织中提取纯化gp96,并以此为抗原对构建的抗体库进行3轮筛选.结果 提取的淋巴细胞总RNA及逆转录合成的cDNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增.Fab全库库容达6.6×106,酶切和PCR显示有插入片段.用从膀胱尿路上皮癌组织中提取出的gp96进行3轮筛选,抗体库得到68倍的富集.结论 本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体、肿瘤免疫治疗打下基础.
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大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定
目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定.方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库.并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达.结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断.经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确.结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础.
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人源日本血吸虫Fab抗体库的构建及抗独特型抗体的筛选、鉴定
目的:构建人源日本血吸虫Fab抗体库,筛选出日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定.方法:以3名晚期血吸虫患者切除的脾脏为源,构建人源日本血吸虫Fab抗体库.并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达.结果:构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,库容为4.3 × 106,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断.经过5轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取60个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(A3、B6、C4、C17),其中B6经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确.结论:成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础.
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人源抗EV71病毒中和表位SP70的Fab抗体研制
目的 构建人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库,筛选具有中和活性的人源单克隆抗体,为EV71感染引起的手足口病临床诊断及治疗奠定基础.方法 从成人志愿者抗凝血中分离外周淋巴细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA.以cDNA为模板,用人源IgG Fab段基因引物扩增轻链及重链Fd区基因,分步克隆至pComb3载体,构建Fab噬菌体抗体库.以SP70为抗原对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,将获得的重组噬菌体感染XL1-Blue菌并诱导表达,用SP70对诱导表达的菌上清进行筛选.结果 共获得3株轻、重链基因组合序列不同的克隆,且这3株Fab抗体可特异性结合SP70多肽.结论 成功构建人源抗EV71病毒Fab噬菌体抗体库,并从中筛选出3株针对EV71病毒结构蛋白VP1上中和线性表位SP70的特异性人源Fab抗体,为研发新的手足口病诊断和治疗工具奠定基础.
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人天然Fab段噬菌体抗体库的构建
目的通过构建人天然Fab段噬菌体抗体库为恶性肿瘤的免疫治疗提供新方法.方法取4个健康献血员新鲜血液各200ml,分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,设计多对引物,以PCR扩增抗体轻链和重链Fd段cDNA.轻链PCR产物和质粒载体pComb3经SacⅠ和XbaⅠ酶切,由T4 DNA连接酶连接,电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1-Blue,扩增后提取质粒,构建轻链库.轻链库和重链Fd段PCR产物经XhoⅠ和SpeⅠ酶切,同样方法连接转化XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM13产生噬菌体抗体全库.酶切鉴定轻链库和全库有无插入片段.结果提取的淋巴细胞总RNA质量好,部分重链Fd片段、部分κ轻链和λ轻链cDNA得到扩增.Fab全库库容达5.4×106,酶切证实有插入片段.结论本研究构建的人天然Fab段噬菌体抗体库可为进一步筛选特异性抗体及从肿瘤组织中提取肿瘤抗原用于免疫治疗奠定基础.
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人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的筛选与鉴定
目的通过大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞抗原对人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体原始库的反复筛选,鉴定抗体库的特性并检测其与人大肠癌相关抗原的结合活性.方法 PCR鉴定阳性重组菌xL1-B1ue中人大肠癌相关抗体Fab段的插入率, 构建人大肠癌Fab段原始库,提取3例用于构建原始抗体库的致敏大肠癌组织抗原,13例非致敏大肠癌组织抗原及3种体外培养的大肠癌细胞株Lovo、HT-29、LS-174T的抗原各自等体积混合,利用3组混合抗原分别对原始抗体库进行3轮筛选,将筛选后的三个三级库等体积混和后通过ELISA法鉴定其与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的结合活性,取胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究.结果 N片段及κ链的插入率分别为40%和70%,Fd片段及κ链均插入质粒Pcomb3的重组率为28%,Fab段基因库库容为2.1×106,3组大肠癌混合抗原分别对原始抗体库进行3轮筛选后,抗体库均得到了不同程度的富集,ELISA显示富集后的Fab段抗体库对大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞均有较特异性的结合活性.结论利用噬菌体抗体库技术筛选出了相关抗大肠癌Fab段抗体,且筛选后的抗体片段与人大肠癌相关抗原有较特异性的结合活性.
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人源性大肠癌Fab段噬菌体抗体库的免疫组化鉴定
目的鉴定基因工程抗体库技术构建的人源性大肠癌自然致敏噬菌体Fab段抗体库与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞的特异性结合活性.方法通过免疫组化的方法检测抗体库对人大肠癌标本及体外培养的大肠癌lovo细胞的结合活性,并取绒毛状腺瘤、胃癌、食管癌及正常肠粘膜组织和体外培养的胃癌、肝癌细胞进行对照研究.结果30例大肠癌有22例发生了阳性反应;肠息肉、胃癌、食管癌、正常肠粘膜各取20例,发生阳性反应的分别为13例、5例、4例和1例,体外培养的胃癌、肝癌细胞未发生阳性反应.结论大肠癌噬菌体抗体库能较特异性地与人大肠癌组织及体外培养的大肠癌细胞结合.
