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大鼠星形胶质细胞在突触形成中的作用及机制
目的观察星形胶质细胞(AST)分泌雌激素的规律,研究AST对大脑皮层神经元突触形成的影响及可能的分子机制.方法取新生大鼠大脑皮层进行AST原代及传代培养,分别于传代培养的第0 d、7 d、14 d、21 d进行细胞计数,同时用ELISA方法测定AST条件培养液(ACM)中雌二醇(E2)的浓度.以新生大鼠皮层神经元纯培养为模型,实验分成6组:神经元纯培养组;ACM培养组;AST和神经元混合培养组;雌激素培养组;ACM+Tamoxifen(雌激素受体阻断剂)培养组;Tamoxifen培养组.应用免疫荧光技术和突触计数方法观察各组突触形成数量的差别.结果AST数量分别为1×104/ml、1.1×106/ml、1.4×106/ml、1.5×106/mi;ACM中雌二醇浓度分别为(ng/L):0、117±22、266±22、252±27.第0 d培养液中未检测出雌二醇,随着培养时间的延长雌激素浓度迅速增加,14 d左右达高峰,以后逐渐降低,但21 d时培养液中雌二醇仍保持较高浓度.各实验组突触荧光颗粒数分别为(个/细胞,培养第9 d):14±3;79±5;83±8;80±6;32±3;29±3.显示ACM能增加培养神经元突触形成的数目近6倍,外源性雌激素可基本模拟ACM的效应.Tamoxifen能阻断ACM促突触形成效应的75%左右.结论体外培养新生大鼠大脑皮层AST能合成并分泌雌激素,分泌的雌激素可能参与了胶质细胞调节神经元突触形成的过程,而胶质源性的雌激素可能通过雌激素受体发挥促突触形成的作用.
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胚胎干细胞向视网膜样结构分化的体内和体外研究
目的 研究鼠胚胎干细胞在裸鼠眼内发育分化成视网膜样细胞的体外生长特性。 方法 将体外培养的未分化胚胎干细胞移植到Balb／c裸鼠眼球内。第14 d处死动物，摘出眼球，在解剖显微镜下由眼球矢状面剖开眼球，一半制冰冻切片、HE染色。镜下见玻璃体腔中ES细胞已发育、分化成视网膜样结构后；从另一半眼球相应位置取这部分已开始向视网膜样结构分化的细胞进行培养，并做形态学观察和免疫组织化学鉴定。 结果从裸鼠眼球冰冻切片和HE染色观察定位后取出的已分化成视网膜样结构的细胞，在体外生长旺盛，呈梭形、星形，具有两个或多个突起。这些细胞聚积成排列整齐而规则的条带状，一侧伸出一些突起，类似视网膜的外颗粒层排列。免疫组织化学染色显示，这些细胞呈NSE强阳性反应。 结论 在裸鼠眼球内已分化成视网膜样结构的细胞经体外培养，仍保持神经元和视网膜样细胞的生长特性。
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生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征
目的 观察生后不同时间乳鼠心肌细胞的形态结构和功能特征,建立理想的分离和纯化乳鼠心肌细胞技术. 方法 采用胰蛋白酶消化和机械分离,结合两次差速贴壁法以及使用溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),从生后1～7d乳鼠心脏分离和纯化心肌细胞.观察细胞的形态和自发性搏动,并用心肌特异性肌钙蛋白丁(cTnT)免疫细胞化学染色进行鉴定.利用原位透射电镜术观察细胞超微结构,并观察其对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应. 结果 从乳鼠心脏分离的细胞95%以上为心肌细胞,存活率为95%以上.乳鼠心肌细胞包括短柱状或杆状细胞和不规则形细胞.生后1～3d鼠大部分杆状细胞呈现幼稚心肌细胞的超微结构特征.6～7d鼠的杆状细胞具有类似于成熟心肌细胞的超微结构特征,cTnT呈高表达,横纹明显.不规则形细胞含有少量肌丝束,排列不规则.少数体积较小的细胞呈现未分化细胞的超微结构特征.培养72h后80%以上的细胞出现自发性搏动.肾上腺素和异丙肾上腺素刺激后,搏动细胞数目增多,搏动增强.生后6～7d鼠杆状细胞的药物反应较强. 结论 两类心肌细胞的超微结构特征、自发性搏动和对肾上腺素和异丙肾上腺素的反应不同.生后6～7d鼠心肌细胞较适合于成熟心肌细胞的体外实验研究.本实验建立的方法 是一种较理想的乳鼠心肌细胞培养方法 .
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小鼠垂体巢蛋白阳性细胞在体外具有集落生长能力
目的 研究小鼠垂体前叶中巢蛋白(Nestin)阳性细胞在体外培养环境中的自我增殖能力. 方法建立小鼠垂体Nestin阳性细胞克隆生长培养条件,观察次代细胞在其中的生长情况.应用野生型细胞和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)细胞混合培养,以及BrdU渗核实验鉴定次代Nestin阳性细胞培养过程中新生细胞群的来源.结果次代Nestin阳性细胞在克隆生长培养基中能够自我增殖.野生型细胞和EGFP细胞混合培养实验表明,新生细胞群由纯野生型细胞或纯EGFP细胞构成.BrdU渗核实验显示,24h内新生细胞群中有13%的细胞由分裂产生(n=20). 结论 部分小鼠垂体前叶Nestin阳性细胞在体外培养环境中具有克隆生长能力.
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低剂量米非司酮对人卵巢颗粒细胞的影响
目的 观察低剂量米非司酮对体外培养的人卵巢颗粒细胞的影响,探讨其抑制或延迟排卵的分子机制. 方法 应用细胞培养,通过倒置显微镜、电子显微镜观察米非司酮对体外培养的人卵巢颗粒细胞形态及超微结构的影响;用免疫细胞化学和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测不同浓度米非司酮处理24h后对颗粒细胞Bcl-2和Bax蛋白及其mRNA表达水平的影响. 结果 米非司酮可以诱导人卵巢颗粒细胞发生凋亡;不同浓度米非司酮(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)处理24h后,颗粒细胞Bcl-2蛋白表达水平进行组织化学评分(HSCORE),分别为2.15±0.16、1.88±0.13和1.64±0.16,与对照组的2.51±0.16比较,差异有显著性(P<0.001);Bax蛋白表达则出现相反的变化,3组的HSCORE分别为1.85±0.10、2.00±0.18和2.29±0.20,与对照组的1.50±0.16比较,差异有显著性(P<0.001);而bcl-2和bax基因mRNA表达与对照组相比无明显改变(P>0.05). 结论 米非司酮能诱导人卵巢颗粒细胞凋亡;Bcl-2和Bax蛋白表达可能参与米非司酮诱导的颗粒细胞凋亡.
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免疫球蛋白超家族黏附分子在淋巴管和不同血管内皮细胞的表达
目的比较免疫球蛋白超家族黏附分子在淋巴管、大血管和微血管内皮细胞的表达特点,探讨免疫球蛋白超家族黏附分子在淋巴管内皮细胞表达的意义.方法从狗的胸导管、颈总动脉、颈内静脉、肺微血管分离内皮细胞,利用免疫荧光标记法检测PECAM-1、ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1和CD44在各种内皮细胞的表达,在荧光显微镜和激光共聚焦扫描显微镜下观察,并用图像分析仪分析表达强度.结果动脉、静脉和肺微血管内皮细胞表达PECAM-1、ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1和CD44.其中,ICAM-1和ICAM-3的表达较弱.VCAM-1在动脉和肺微血管内皮细胞的表达比静脉强.淋巴管内皮细胞表达PECAM-1、ICAM-1、ICAM-3和CD44,未观察到VCAM-1的表达.ICAM-3和CD44的表达比血管内皮细胞强.结论与动脉、静脉和微血管内皮细胞比较,淋巴管内皮细胞不表达VCAM-1,而ICAM-3和CD44表达较强,这有助于解释淋巴细胞和肿瘤细胞与淋巴管内皮的黏附以及淋巴管新生的机制.
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脊髓混合性胶质细胞机械损伤后的形态变化
目的建立体外培养的脊髓胶质细胞机械损伤模型,观察机械性损伤刺激后,混合性胶质细胞内不同细胞的形态变化及其特性. 方法 14～15d胎龄的小鼠脊髓制成细胞悬液后,在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养4周,形成富含星形胶质细胞的平铺混合胶质细胞,用塑料滴头刮损后,在刮损缘的反应性胶质细胞增生,肥大,向刮损裸区内生长并发生细胞分裂. 结果增长的细胞沿刮损方向呈极性排列,可伸出纤长的突起,突起上有串珠样结构自胞体向突起末端移动,并可相互间发生融合. 结论免疫细胞化学染色表明损伤边缘的胶质细胞GFAP染色加深,但进入损伤区的细胞并非GFAP阳性,也不为识别纤维细胞抗原的抗体所标记,其可能的来源和特性还有待进一步确定.
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催产素诱导P19细胞分化为心肌细胞的作用
目的 研究催产素(OT)在体外诱导P19细胞分化为心肌细胞中的作用.方法 将P19细胞用含crr的诱导培养基悬浮培养4d,取其形成的拟胚体(EBs)用不含OT的生长培养基贴壁培养10～12d.用免疫细胞化学、透射电镜等方法对分化的细胞进行鉴定.结果 EBs周边生长晕中部分细胞变形、伸长,呈放射状排列.免疫细胞化学染色显示,变形分化的细胞表达á-横纹肌肌动蛋白(á-SCA)和心肌肌钙蛋白T(cTnT),并以OT终浓度l×10-7mol/L的实验组阳性率高(P＜0.01).透射电镜观察分化细胞具有心肌细胞发育早期的超微结构特征.结论 在体外OT能够诱导P19细胞分化为早期的心肌细胞.
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逆转录病毒介导的人CNTF在嗅神经鞘细胞中的表达及其对神经细胞存活和突起生长的影响
目的研究含有睫状神经营养因子(CNTF)表达调控系统修饰的嗅神经鞘细胞(OECs)对神经细胞存活和突起生长的影响. 方法通过基因克隆,用KpnⅠ+XbaⅠ将pcDNA\-3-S(NGF信号肽)-hCNTF质粒中含有NGF信号肽的CNTF切下,插入逆转录病毒表达载体pRev-TRE中.酶切鉴定后,将其与本系统的调控质粒pRev-Tet-On转入Ecopack-293细胞进行病毒包装,制备重组缺陷型hCNTF和Tet-On逆转录病毒感染原代培养的大鼠OECs,用不同浓度的强力霉素诱导,以Western-blot法对hCNTF的表达培养上清进行检测.将转染hCNTF的OECs与新生2d大鼠DRG联合培养,用其上清培养视网膜节细胞(RGCs).经β-tubulin免疫组织化学染色后,分别测量DRG神经突起的长度并统计阳性RGCs数目. 结果 1.经HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定,pRev-TRE-S-hCNTF重组体分别被切下630bp和400bp片段,插入子的方向和完整性经确认与预期相符.2.以不同浓度强力霉素诱导hCNTF修饰的OECs,其培养上清均有分子量约24 kD的hCNTF蛋白质的显著特异表达,此表达与强力霉素的浓度呈正相关.未诱导组和对照组未见明显蛋白带.3.同单纯OECs(23.15±4.7)、空载(24.55±5.8)、空白(16.8±6.5)等对照组相比,经hCNTF转染的OECs上清组的存活RGC数显著增高(41.34±5.4).4.与单纯OECs(418±45μm)和空载(400±65μm)对照组相比,与hCNTF修饰的OECs联合培养的DRG神经突起显著增长(660±67μm),且更为密集,而空白对照组未见向外延伸的突起. 结论 hCNTF可经逆转录病毒载体转染OECs,其表达依赖于强力霉素浓度,并对神经细胞存活和突起生长具有显著的促进作用.
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子宫内膜基质细胞作为饲养层培养人胚原始生殖细胞
目的探讨子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养人胚原始生殖细胞的可能.方法从5～9周人胚胎生殖嵴、中肾嵴、肠系膜中消化分离原始生殖细胞(PGCs),种植于经丝裂霉素C处理的人子宫内膜基质细胞饲养层上培养.结果PGCs可以在体外培养3个多月,传14代.这样培养的PGCs表达胚胎干细胞的多种标志,如碱性磷酸酶染色、SSEA和TRA抗原等.另外细胞保持正常的染色体核型.结论人子宫内膜基质细胞可以作为饲养细胞在体外培养人胚原始生殖细胞,保持未分化状态.
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大鼠肝星状细胞系的建立及其生物学特性的研究
目的建立并鉴定肝星状细胞(HSC)细胞系.方法采用肝脏离体胶原酶灌注消化及密度梯度离心的方法分离培养大鼠的HSC;通过体外长期传代培养后建立1株细胞系,应用细胞形态学观察、细胞倍增时间测定、细胞生长曲线绘制、染色体分析、双层软琼脂培养、免疫细胞化学检测、RT-PCR检测、聚硅酮膜培养法观测HSC的收缩等方法对其生物学特性进行研究. 结果 HSC细胞系已传了 78代,保持着肌成纤维样细胞的形态学特点.细胞倍增时间为36.5 h;细胞的染色体众数42条,为正常大鼠体细胞的染色体表型;双层软琼脂培养未见细胞克隆形成;免疫细胞化学检测表明,细胞系表达Desmin、GFAP、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA、iNOS、ICAM-1、TGF-α;RT-PCR检测表明,该细胞系表达TGF-8、ICAM-1;聚硅酮膜培养法显示,HSC细胞系能在ET-1作用下产生收缩反应.结论HSC细胞系符合建系标准,是1株新建立的大鼠肝星状细胞系,命名为rHSC-99,可作为肝硬化、门静脉高压症实验研究的模型.
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睫状神经营养因子对体外培养的星形胶质细胞细胞周期及Fos蛋白表达的影响
目的研究睫状神经营养因子(CNTF)对体外培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞(Ast)细胞周期及Fos蛋白表达的影响.方法通过体外纯化培养获取大鼠大脑皮质Ast,将CNTF加入培养液,作用相应的时刻点后,应用流式细胞仪测定细胞周期的变化,采用免疫细胞化学方法研究Fos蛋白的表达.结果CNTF作用Ast 6h后,可显著促进细胞周期进程,表现为G0/G1期细胞百分比降低;S期+G2/M期细胞百分比(增殖指数,poliferation index,PI值)升高.12h促增殖作用达高峰,24 h、48 h有所恢复,但PI仍明显高于对照组.CNTF作用于Ast 2 h后即可引起Fos蛋白的显著表达,并持续至24 h,而糖皮质激素预处理可明显抑制Fos蛋白表达.结论CNTF可促进Ast增殖及Fos蛋白表达.
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神经干细胞与脑源性神经营养因子联合治疗对老年性痴呆鼠基底前脑一氧化氮合酶阳性神经元的影响
目的探讨神经干细胞(NSCs)与脑源性神经营养因子(BDNF)联合应用对老年性痴呆鼠基底前脑一氧化氮合酶(NOS)阳性神经元的影响.方法切断成年SD大鼠左侧穹窿海马伞(FF),基底前脑行神经干细胞移植,同时持续侧脑室注射BDNF,4周后行组织化学染色结合图像分析技术观察各组大鼠基底前脑NOS阳性神经元数量和形态学参数的变化.结果损伤后1个月,损伤侧基底前脑内侧隔核(MS)和斜角带垂直支(VDB)内可观察到NOS阳性神经元明显减少,分别为正常组的35.5%和55.8%,(与正常组相比P＜0.01);移植组NOS阳性神经元数恢复到正常组的74.7%和95.7%,(与损伤组相比P＜0.01);联合组NOS阳性神经元数达到正常组的115.2%和151.3%,(与移植组相比P＜0.05及P＜0.01).细胞形态学参数提示,移植组NOS阳性神经元中含部分中等大小的未成熟细胞;联合组中该中等大小的细胞更多.结论神经干细胞移植与BDNF联合治疗,对AD模型鼠基底前脑MS、VDB的NOS阳性神经元有明显的补充和保护作用,并且联合治疗效果比单纯神经干细胞移植效果更佳.
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体外培养的不同亚型上皮性卵巢癌细胞系差异蛋白的分析
目的分析体外培养的不同亚型上皮性卵巢癌细胞系蛋白质表达差异,筛选卵巢癌的肿瘤标志物.方法提取体外培养的不同亚型上皮性卵巢癌细胞系(OVCAR-3、SKOV-3、3AO和TOV-112D)与原代培养的正常卵巢生发上皮细胞(OGE)的总蛋白,采用表面增强激光解吸离子化(SELDI)蛋白质芯片技术的H4和SAX2两种蛋白芯片检测其蛋白质谱,后利用蛋白芯片阅读机(PBS-Ⅱ型)读取数据,获得的数据采用Ciphergen Proteinchip 3.0.2版本的软件分析.结果4种亚型的上皮性卵巢癌细胞系与正常卵巢生发上皮细胞比较,有16个蛋白发生明显改变,其中7个蛋白表达降低,9个蛋白表达升高.此外,不同亚型的上皮性卵巢癌细胞之间也有很多差异蛋白,尤其是OVCAR-3、SKOV-3和3AO三者与TOV-112D之间有18个蛋白仅在前3种癌细胞中表达,16个蛋白仅在后者表达.结论不同亚型上皮性卵巢癌细胞与正常卵巢生发上皮细胞的蛋白质谱相比较有共同的差异蛋白,同时不同亚型的上皮性卵巢癌细胞之间的蛋白质谱表达也有差别.
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不同时期视网膜前体细胞的培养
目的 研究不同时期视网膜前体细胞的培养.方法 分离E14和E18 SD大鼠的视网膜前体细胞,用改进DMEM/F12无血清培养基悬浮培养并利用体外诱导分化、免疫细胞化学、扫描电镜和透射电镜等方法对细胞进行鉴定.结果 视网膜前体细胞在DMEM/F12无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化.扫描电镜可见细胞球和分化细胞的形态,透射电镜可见细胞球和分化细胞的超微结构.免疫细胞化学显示,悬浮培养的细胞球中大部分细胞表达神经外胚层源性干细胞标志物nestin和细胞分裂增殖标志物BrdU.贴壁后,视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括Thy1.1阳性的视网膜神经节细胞.E14和E18视网膜神经节细胞的百分比分别为16.91%±4.05%和4.65%±1.88%,两组比较,差异有统计学意义(t=15.04,P＜0.001).结论 改进DMEM/F12无血清培养基可成功培养视网膜前体细胞,培养的细胞具有无限增殖和多向分化潜能.早期视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较高.
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中药露蜂房蛋白对人红白血病K562细胞增殖的影响
目的研究中药露蜂房蛋白(NVP)抗白血病的作用,为中药露蜂房治疗白血病和开发新的抗白血病药物提供实验和理论依据.方法采用细胞培养和透射电子显微镜技术,观察NVP对人红白血病细胞(K562细胞)的生长抑制作用和形态结构的影响;运用免疫组织化学方法和图像分析系统,研究NVP对K562细胞凋亡相关信号转导蛋白NF-κ Bp65、β-catenin及iNOS表达的影响.结果1.NVP处理组K562细胞生长饱和密度降低,表示细胞增殖减弱.2.透射电镜下发现,NVP处理组K562细胞呈典型的凋亡形态学改变.3.免疫组织化学和图像分析系统测定光密度值(A值)显示,NVP处理组K562细胞中NF-κ Bp65、β-catenin细胞核内转导减少,iNOS表达减弱.结论NVP有明显抑制K562细胞增殖的作用,其作用机制可能通过调节凋亡相关信号传导因子NF-κBp65、β-catenin及iNOS的表达,从而诱导白血病细胞凋亡.
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渗透压变化对缝隙连接蛋白在培养的大鼠下丘脑星形胶质细胞和神经元表达的影响
目的观察渗透压改变对培养的下丘脑星形胶质细胞的缝隙连接蛋白Connexin43(Cx43)和神经元的缝隙连接蛋白Cx32表达的影响.方法体外培养孕14 d或新生1d SD大鼠下丘脑的神经元和星形胶质细胞并进行纯化和鉴定.实验各分两组,第1组:细胞由等渗培养液移至高渗培养液(含9% NaCl)分别放置1min、3min、5min、10min和15min后将液体吸出常规固定;第2组:细胞先置于高渗培养液中15min后换成等渗培养液,分别在1min、3min、5min和10min后将等渗培养液吸出常规固定.两者均进行抗Cx43或抗Cx32的免疫荧光染色,Confocal显微镜观察.结果第1组,Cx43在刺激1min后在星形胶质细胞表达比对照组有所增加,3 min达到高峰,以后逐渐降低,15 min恢复正常;而Cx32在刺激后1min的神经元中表达比对照组增加,5 min达到高峰,以后降低,15min恢复正常.第2组同样为Cx43在星形胶质细胞刺激1min后表达增加,3 min达到高峰,以后降低,10 min恢复正常;神经元的Cx32表达在刺激后5 min达到高峰,以后降低,10 min恢复正常.两组Cx43表达的高峰期均早于Cx32.结论Cx43和Cx32可能参与星形胶质细胞与神经元渗透压的调节.
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原代培养大鼠嗅球成鞘细胞Nogo(N-18)的共聚焦激光扫描显微镜观察
目的观察原代培养的成年大鼠嗅球成鞘细胞(OECs)Nogo(N-18)蛋白的表达,探讨Nogo与成鞘细胞促进神经再生作用的关系. 方法原代培养嗅球OECs,采用免疫组织化学和双标免疫荧光细胞化学技术,结合激光共聚焦扫描显微镜观察. 结果原代培养的嗅球OECs的Nogo(N-18)免疫细胞化学反应呈阳性,Nogo(N-18)蛋白主要分布于胞浆,而在胞膜及突起分布较少. 结论嗅球(OECs)含有Nogo-A蛋白,提示Nogo-18蛋白在嗅神经系统可能没有决定抑制轴突再生的作用.
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马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液及CNQX对正常大鼠脑内及培养的神经元内NSF的影响
目的 揭示星形胶质细胞对神经元内N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感性的融合蛋白(NSF)和AMPA受体的影响及其在癫痫发病中的作用.方法 将马桑内酯激活的星形胶质细胞条件培养液(ACM)注入正常SD大鼠侧脑室,观察其行为变化;运用免疫组织化学方法观察其大脑皮质、海马内NSF免疫反应的变化;将培养的神经元随机分为对照组、ACM组及CNQX+ACM组,免疫细胞化学方法观察NSF表达的变化,Western blotting法检测NSF含量的变化.结果 ACM组大鼠在注射后30min出现癫痫行为.免疫组织化学染色结果显示:1.ACM作用后2h及4h,大鼠大脑皮质及海马内NSF免疫反应阳性神经元数和平均吸光度明显降低(P<0.05);2.培养的神经元的免疫细胞化学染色结果显示,ACM组在作用4h及8h时,NSF免疫阳性反应产物与对照组比较明显减少(P<0.05).Western blotting法检测NSF含量,在ACM作用4h及8h时较对照组及CNQX+ACM组明显减少(P<0.05).结论 ACM可下调神经元内NSF的表达,并导致动物痫性发作,而运用AMPA受体拮抗剂CNQX则能阻断其下调作用,提示ACM对NSF的下调作用可能与AMPA受体有关.
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内抑制素和血小板因子-4对淋巴管内皮细胞生成的影响
目的寻找安全有效的淋巴管生成抑制剂.方法取猪的胸导管内皮细胞进行培养,进行光镜和电镜观察.设立对照组、内抑制素实验组和血小板因子-4(PF-4)实验组.应用刮线法和MTT法来判定这两种抑制因子对细胞有无抑制作用.结果应用刮线法对Endostatin、PF-4对照组与实验各组的细胞数及细胞游走距离进行比较,均P＜0.05.采用MTT法将内抑制素、PF-4对照组与实验各组吸光光度值相比较,均P＜0.05.结论内抑制素和PF-4对淋巴管内皮细胞的增殖和游走有明显的抑制作用,且有剂量依赖性.
