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人视网膜前体细胞的体外培养、纯化和诱导分化
目的 体外培养和纯化人视网膜前体细胞,研究其分化的诱导因素.方法 培养3～5个月人胚胎视网膜前体细胞,鉴定其神经干细胞特性.流式细胞术比较其传代前后的含量.观察不同培养条件对其分化的诱导.结果 人视网膜前体细胞能分裂增殖,形成原代和子代神经球,表达Nestin,分化后表达神经烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、蛋白激酶C和神经突触素.传代后Nestin表达量[(39.3±18.9)%]显著高于原代[(28.7±17.7)%](P＜0.05).视网膜组织片上清液诱导后神经烯醇化酶表达量[(69.3±6.5)%]高于自发分化者[(59.5±7.6)%](P＜0.05).视紫红质表达量[(7.5±2.9)%]则低于自发分化者[(13.2±3.2)%](P＜0.05).组织共培养后,同一区域内细胞集中向特定细胞分化.结论 体外培养的人视网膜前体细胞能自我纯化,不同诱导形式使其分化发生偏差.
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不同时期视网膜前体细胞的培养
目的 研究不同时期视网膜前体细胞的培养.方法 分离E14和E18 SD大鼠的视网膜前体细胞,用改进DMEM/F12无血清培养基悬浮培养并利用体外诱导分化、免疫细胞化学、扫描电镜和透射电镜等方法对细胞进行鉴定.结果 视网膜前体细胞在DMEM/F12无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化.扫描电镜可见细胞球和分化细胞的形态,透射电镜可见细胞球和分化细胞的超微结构.免疫细胞化学显示,悬浮培养的细胞球中大部分细胞表达神经外胚层源性干细胞标志物nestin和细胞分裂增殖标志物BrdU.贴壁后,视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括Thy1.1阳性的视网膜神经节细胞.E14和E18视网膜神经节细胞的百分比分别为16.91%±4.05%和4.65%±1.88%,两组比较,差异有统计学意义(t=15.04,P＜0.001).结论 改进DMEM/F12无血清培养基可成功培养视网膜前体细胞,培养的细胞具有无限增殖和多向分化潜能.早期视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较高.
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可溶性因子在视网膜移植中的作用
视网膜移植是治疗视网膜疾病的一种新方法,通过细胞与局部微环境中的可溶性因子的相互作用,视网膜前体细胞可以发育成特定的细胞类型.本文主要对可溶性因子在视网膜前体细胞诱导分化为感光细胞中的作用作一综述.
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人胚胎视网膜前体细胞的体外培养条件及分化特性
背景:视网膜干细胞已在多种脊椎动物眼内发现,但目前对人类视网膜干细胞或前体细胞的生物学特性尚知之甚少.目的:探讨人胚胎视网膜前体细胞的体外培养条件及分化潜能.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-03/2006-02在中山大学中山眼科中心完成.材料:人胚胎神经视网膜来源于4例流产胎儿.方法:分离胚胎眼球神经视网膜,经胰酶消化法制备单细胞悬液,加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、左旋谷氨酰胺的无血清高糖DMEM/F12培养基进行原代及传代培养.收集培养第1～3代的细胞克隆球体,接种到右旋多聚赖氨酸及层粘连蛋白预包被的6孔细胞培养板内,培养7 d后行免疫细胞化学染色.主要观察指标:倒置显微镜下观察视网膜前体细胞分化前后的形态变化,免疫细胞化学法鉴定分化细胞特性.结果:部分人胚胎神经视网膜细胞呈神经球体样悬浮生长,细胞球体边界清楚,折光性强,表达视网膜前体细胞标签巢蛋白;将其接种到分化条件下培养7 d后,细胞体积增大,变扁平,呈梭形、多角形,伸出大小不等的细胞突起,大部分细胞表达视网膜神经元细胞分子标签βⅢtubulin和胶质细胞标签胶质纤维酸性蛋白,少量细胞表达光感受器标签视紫红质.结论:人胚胎视网膜前体细胞可在体外扩增培养,在胎牛血清联合右旋多聚赖氨酸、层粘连蚩白特定诱导条件下,可以向视网膜神经元、胶质细胞及光感受器细胞分化.
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Muller细胞诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化
目的 研究Muller细胞在视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化中的作用.方法 分离培养Muller细胞和不同时期的胚胎视网膜前体细胞,将其与Muller细胞共同培养,并进一步用Muller细胞条件培养液来诱导视网膜前体细胞的分化.倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况,Thy1.1标记视网膜神经节细胞并计数.结果 视网膜前体细胞能分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞.不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比不同.单独培养组、共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比,E14分别为(16.91±4.05)%,(47.25±9.67)%和(42.36±10.52)%,E18则分别为(4.65±1.88)%,(9.90±3.19)%和(8.69±3.01)%.相同时期的视网膜前体细胞,共同培养组和Muller细胞条件培养液组视网膜神经节细胞的百分比较单独培养组高,差异有统计学意义.相同培养条件下,E14视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化的百分比较E18高,差异有统计学意义.结论 Muller细胞能诱导视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化,可能通过Muller细胞释放某些可溶性因子发挥作用.
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兔胚胎视网膜前体细胞体外培养纯化方法探究
目的 探讨新西兰白兔的胚胎视网膜前体细胞的培养、增殖与纯化方法,并对其性质及体外分化进行鉴定.方法 来源于19d、20d及26 d不同孕龄的兔胚胎.用内路法取出含视网膜前体细胞的组织,采用胰酶/EDTA消化,利用组织中不同类型细胞对消化液不同的反应,去除混入的间质细胞等成分,达到逐步分离纯化胚胎视网膜前体细胞的目的.分离所得的细胞,利用倒置相差显微镜观察其生长情况,同时对相关类型细胞行免疫细胞化学染色,以鉴定视网膜前体细胞.结果 从兔胚胎视网膜神经部分离出的原代视网膜前体细胞具有明显的生物学特性:所培养细胞可形成悬浮生长的细胞团.刚贴壁的细胞成簇状生长,这些细胞用免疫细胞化学染色神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达呈阳性.经传代几代后细胞生长趋同,细胞生长呈长梭形,逐渐有细胞分化为多种视网膜细胞类型,包括视网膜神经节细胞等,同时Nestin表达下调.结论 不同时期、不同培养条件下的视网膜前体细胞均具有相同的形态,这种利用酶消化时间的不同能够分离纯化视网膜前体细胞,为将来研究此类细胞的性质及干细胞的相关研究打下良好的细胞生物学基础.
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胚胎干细胞源性视网膜前体细胞在rd鼠视网膜下腔移植后的分化
目的 研究绿色荧光蛋白标记的胚胎干细胞(green fluorescent protein-embryonic stem cells,GFP-ESC)源性视网膜前体细胞在rd小鼠视网膜下腔移植后的存活分化情况.方法 将GFP-ESC 源性视网膜前体细胞移植到伴有视网膜感光细胞变性和继发性视网膜神经节细胞变性的rd 小鼠视网膜下腔,移植后1周、4周、8周取材行免疫荧光细胞化学检测,观察移植细胞存活、分化情况.对移植细胞进行核型分析,并接种裸鼠眼内观察是否成瘤,评价其安全性.结果 GFP-ESC 源性视网膜前体细胞移植眼内可存活、整合到宿主变性视网膜层间.1周时 GFP 阳性细胞移行于外层视网膜并呈视杆细胞标志抗原rhodop-sin阳性:4周时整合于内层视网膜,共表达成熟神经元标志抗原神经丝蛋白-200、微管相关蛋白-2,突触标志抗原synaptophysin检测阳性;8周时移至邻近玻璃体腔形成节细胞样结构,表达节细胞标志抗原Thy1.1;移植细胞维持正常二倍体核型,术后8周未见排斥反应及瘤性增殖.结论 GFP-ESC源性视网膜前体细胞在变性视网膜中可存活、整合,并有优先向变性的感光细胞及.神经节细胞类型分化的倾向,有望为青光眼等视神经视网膜病变的细胞移植治疗提供安全有效的种子细胞.
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氮酮对碱性成纤维细胞生长因子眼内通透性的影响
背景 研究证实,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在视网膜前体细胞的增生分化过程中发挥重要作用,但因其眼内通透性低而限制了其在临床上的应用.探寻增加bFGF眼内通透性的有效途径无疑对视网膜疾病的治疗有重要意义. 目的 观察氮酮对bFGF滴眼液眼内通透性的影响,探索眼部无创给药途径,为bFGF滴眼液用于眼内疾病的治疗提供依据.方法 以随机数字表法将18只新西兰白兔随机分成4个组,其中体积分数0.4％氮酮+体积分数5％ bFGF组9只兔并按照取材时间的不同亚分为3个组(30、60、120 min),其他3个组各3只兔.不同组兔眼分别局部点用蒸馏水(空白对照组)、5％ bFGF滴眼液(5％bFGF组)、0.4％氮酮+5％ bFGF滴眼液(0.4％氮酮+5％ bFGF组)和0.4％氮酮+10％ bFGF滴眼液(0.4％氮酮+10％ bFGF组),每5分钟1次,共3次,于点眼后30 min抽取房水和玻璃体,其中0.4％氮酮+5％ bFGF组于点眼后30、60和120 min抽取房水和玻璃体,用ELISA法测定房水和玻璃体中bFGF的吸光度(A450)值. 结果 5％ bFGF组兔眼房水和玻璃体中bFGF的A值分别为0.1007±0.0100和0.1340±0.0100,与空白对照组(分别为0.1363±0.0100和0.1130±0.0100)比较影响并不确切.0.4％氮酮+5％ bFGF组及0.4％氮酮+10％ bFGF组兔眼房水和玻璃体中bFGF的A450值均明显高于5％bFGF组,差异均有统计学意义(均P=0.000),但0.4％氮酮+5％ bFGF组与0.4％氮酮+10％ bFGF组房水及玻璃体中bFGF含量的差异均无统计学意义(P=0.985、0.098).0.4％氮酮+5％ bFGF组点眼后30、60和120 min房水中bFGF的A450值以30 min时高,为0.9413±0.0300,60 min时为0.3865±0.0300,120 min时为0.2550±0.0300,房水中bFGF的A450值随着时间的延长逐渐降低( R2=0.736,P=0.003),而玻璃体中bFGF的A450值与时间之间无明显线性关系(R2=0.196,P=0.233). 结论 氮酮可以改善bFGF滴眼液的眼内通透性,bFGF的体积分数从5％增加到10％时不能有效提高bFGF点眼后的利用度.0.4％氮酮+5％ bFGF滴眼液点眼后30 min房水中bFGF含量高,随时间延长bFGF的含量逐渐降低.
关键词： 氮酮 碱性成纤维细胞生长因子/滴眼液 通透性 视网膜前体细胞 -
大鼠视网膜前体细胞的传代培养及体外分化诱导
目的 了解表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及睫状神经营养因子(CNTF)对其分化的影响.方法 取孕18 d的SD大鼠胚胎眼的视网膜,分别用悬浮法及贴壁法培养.传至第一代后转入分别含10 ng/ml CNTF、20 ng/ml EGF、10 ng/ml bFGF、10%胎牛血清的DMEM:F12中进行诱导分化,贴壁后2、3、4、6 d分别行nestin、Vimentin、Opsin及GFAP的二步法免疫组织化学染色.结果 大鼠的RPCs在悬浮时呈球状生长,nestin及Vimentin染色阳性,悬浮培养传至一代,贴壁培养传至五代,传代后细胞数量不断减少并可在体外分化为含视网膜光感受器细胞及胶质细胞的混合神经元.CNTF、bFGF及EGF不同程度地增加了光感受器细胞的比例.结论 RPCs可在体外培养并传代.CNTF、bFGF及EGF参与视网膜发育的调节.
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人视网膜前体细胞的体外视网膜组织片下移植
目的研究人视网膜前体细胞移植到体外培养的人视网膜组织片下的细胞分化.方法取无眼部发育异常的4～5个月胚胎眼球,进行视网膜前体细胞分离培养.将传代的细胞移植到体外培养的视网膜神经上皮组织片下,通过光学显微镜和免疫组织化学观察细胞分化和组织整合情况.结果人视网膜前体细胞在体外培养时形成神经球样细胞团,传代后形成子代细胞团,表达神经干细胞标志Nestin.体外培养的视网膜组织片在5 d、10 d均能基本维持视网膜结构.移植到视网膜组织片下的视网膜前体细胞能够与其建立细胞连接.这些视网膜前体细胞分化后能够表达胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白-2和视紫红质,分别为神经胶质细胞、神经元和光感受器细胞的特异蛋白.结论人视网膜前体细胞具有神经干细胞特征,在体外移植到培养的人视网膜组织片下,能够分化成相应的终末分化细胞.
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条件培养液对人视网膜前体细胞分化的诱导
目的:研究各种培养液对人视网膜前体细胞(RPC)的诱导分化作用.方法:分离培养3～5个月人胚胎RPC,分别用胎牛血清(FBS组)、视网膜组织培养上清(RE组)、视网膜色素上皮培养上清(RPE组)诱导分化.采用免疫组化SP法检测细胞诱导前后Nestin、微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、视紫红质(Rho-dopsin)及蛋白激酶C(PKC)和钙结合蛋白(Calbindin)的表达情况,流式细胞术检测诱导后MAP-2、GFAP及Rhodopsin阳性细胞数.结果:原代及传代培养的RPC表达Nestin,能分裂增殖,形成子代细胞团.RE组和FBS组细胞诱导分化后形态多样,连接广泛;RPE组细胞呈圆形,不贴壁.诱导分化后RE组细胞MAP-2的表达高于RPE组和FBS组(P＜0.01),而Rhodopsin的表达低于RPE组(P＜0.01);GFAP的表达在RPE组低,RE组较高,FBS组高(P＜0.05).结论:不同培养基诱导可使人RPC的分化产生差异.
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全神经球贴壁培养法体外长期扩增视网膜前体细胞
目的:探寻一种既高效又能连续体外扩增视网膜前体细胞(Retinal Progenitor Cell,RPC)的培养方法.方法:小鼠胚胎视网膜细胞采取神经球贴壁培养或直接贴壁培养法.神经球贴壁培养时,先经悬浮培养生成富含前体细胞的神经球,然后将低速离心分离出的神经球接种到Poly-D-Lysine包被的培养瓶,在前体细胞培养液中(含FGF-2、EGF和LIF)贴壁培养,头24 h在培养液中添加10%的胎牛血清.直接贴壁培养法是将细胞悬液直接接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶.免疫组化和FACS分析神经球贴壁培养细胞的干细胞特性和分化能力,并与直接贴壁培养法得到的细胞进行比较.结果:神经球接种到预先包被Poly-D-Lysine的培养瓶后贴附到培养瓶底,逐渐形成贴壁生长的单层细胞.该法能够在体外长期扩增视网膜前体细胞,3个月内细胞能够传代10次以上.在RA诱导分化时,能够生成成熟视网膜细胞,表达视网膜细胞特异性标记.FACS分析和免疫组化染色显示神经球贴壁培养所得细胞在未分化时Nestin阳性率(92%)细胞率以及分化为成熟视网膜细胞的比率(53.7%),均高于直接贴壁培养法获得的细胞.结论:神经球贴壁培养法能够在体外长期大量扩增视网膜前体细胞,能较好地保持干细胞特性,并容易分化为成熟的视网膜细胞,较直接贴壁培养具有较大的优越性.眼科学报2006;22:92-97.
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增强型绿色荧光蛋白基因在人胚胎视网膜前体细胞中的表达
目的:研究增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染人胚胎视网膜前体细胞的转染效率及瞬时表达情况,建立人胚胎视网膜前体细胞的示踪方法,为视网膜前体细胞移植提供示踪依据.方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过磷酸钙介导法转染人胚胎视网膜前体细胞,应用流式细胞仪检测其转染效率,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其瞬时表达情况.结果:pEGFP-N1在基因转染24 h细胞转染率为28.98%,48 h为32.45%,72 h为30.40%,对照未转染细胞24 h、48 h分别为2.50%和2.04%;体外观察培养细胞转染24 h已有绿荧光表达,48～72 h细胞荧光强度强,96 h荧光强度减弱.结论:pEGFP-N1质粒能有效转染人胚胎视网膜前体细胞,其转染效率可达到30%,是人胚胎视网膜前体细胞较为理想的瞬时表达载体和细胞示踪报告分子.
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成人视网膜前体细胞的体外分离培养和鉴定
[目的]对成人视网膜前体细胞进行体外分离、培养和鉴定.[方法]成人眼球12只,"机械分离联合酶消化法"分离出睫状上皮层的色素性细胞,10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+10 ng/mL表皮生长因子(EGF)的无血清DMEM/F12培养液中培养,并从三方面鉴定其神经干细胞特性:A.免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白Nestin的表达;B.自我更新能力:原代神经球消化传代后,继续培养观察新神经球的形成;C.多向分化潜能:原代细胞培养4～5 d,改用含10 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液,继续培养7～10 d,分别用抗神经丝蛋白(NF)抗体、抗微管相关蛋白-2(MAP2)抗体、抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、抗视紫质蛋白抗体、抗β-微管蛋白抗体以及抗无长突细胞特异性抗体作免疫荧光细胞染色.[结果]0.48%±0.08%(1:208)原代细胞在含bFGF+EGF无血清培养条件下能保持增殖未分化状态,形成神经球样结构,消化传代后90.1%±8.3%的第二代细胞能重新形成新的神经球样结构,具有自我更新能力;原代及传代后的神经球均表达神经干细胞特异性抗原nestin;在含10 mL/L胎牛血清的促分化培养液中,细胞分别分化为可表达神经细胞、星形神经胶质细胞和感光细胞等特异性抗原的细胞,表明具有多向分化潜能.[结论]在成人眼睫状体扁平部分离得到具有干细胞特性的视网膜前体细胞,并在体外成功进行培养鉴定.
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Notch-1调控视网膜前体细胞向视网膜神经节细胞分化
目的 研究Notch-1对视网膜前体细胞(RPC)向视网膜神经节细胞(RGC)分化的调控作用.方法 分离培养胚胎14 d龄Sprague-Dawley大鼠的RPC,实验组和对照组分别用含有Notch-1反义寡核苷酸链和无关序列寡核苷酸链的培养液进行诱导分化14 d,倒置相差显微镜每天观察细胞的生长和分化情况,Thy1.1标记RGC并进行计数.结果 实验组和对照组的RPC都能分化为多种视网膜细胞类型,包括Thy1.1阳性的RGC,但两组RPC向RGC分化的百分比不同.实验组和对照组RGC的百分比分别为(16.57±4.31)%和(31.19±6.90)%,两组比较差异有统计学意义(t=9.84,P＜0.001).结论 Notch-1对RPC的分化具有负向调控作用,阻断Notch-1能促进RPC向RGC分化.
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CoCl2诱导大鼠视网膜前体细胞表达VEGF的研究
目的:探讨氯化钴(CoCl2) 模拟缺氧环境下对大鼠视网膜前体细胞(RPCs)中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 基因表达及蛋白分泌的影响.方法:全神经球贴壁法分离、培养、鉴定RPCs.应用RT-PCR及ELISA,检测不同浓度 CoCl2(0,50,100,150,200μmol/L)干预24h后RPCs中VEGF表达的变化,检测150μmol/L CoCl2作用不同时间(0,12,24,36,48,72h)RPCs中VEGF表达的变化.结果:全神经球贴壁法培养的RPCs高表达神经干细胞特异性标记(Nestin),自然分化后表达视网膜细胞标志性抗原Rhodopsine,MAP-2和GFAP,在缺氧培养时间相同的情况下,VEGF 基因的表达随着 CoCl2浓度的增加而逐渐增加而后降低,CoCl2为150μmol/L时达到峰值(P≤0.05).当 CoCl2浓度为150μmol/L培养不同时间时,随着缺氧干预时间的延长,VEGF基因的表达亦是逐渐增加而后降低,于36h时达到峰值(P≤0.05),蛋白与基因表达的变化基本一致.结论:全神经球贴壁法培养RPCs能较好地表达其干细胞特性.CoCl2模拟缺氧环境下,缺氧使 RPCs中VEGF 的分泌增强并具有时间和剂量依赖性.
