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TGF-β1与IGF-Ⅰ对体外培养兔软骨细胞增殖的影响
目的:探讨转化生长因子-β 1(TGF-β 1)与胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)联合作用对关节软骨细胞增殖行为的影响.方法:采用兔关节软骨细胞体外单层培养方法,将TGF-β 1与IGF-Ⅰ作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨多因子对关节软骨细胞增殖行为的影响.结果:(1)TGF-β 1组的佳效应浓度为5 μg/L,IGF-Ⅰ组的佳效应浓度为50 μg/L.(2)TGF-β 1组(5 μg/L)、IGF-Ⅰ组(50 μg/L)以及两因子联合使用组软骨细胞增殖均较对照组高(P＜0.01),联合使用组促增殖作用强,优于单一的TGF-β 1佳效应浓度组和IGF-Ⅰ佳效应浓度组(P＜0.05).结论:TGF-β 1与IGF-Ⅰ联合运用早期促软骨细胞增殖作用优于单一的TGF-β 1或IGF-Ⅰ,在软骨细胞增殖过程中TGF-β 1和IGF-Ⅰ有良好的协同作用.
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顺铂处理癌细胞后CDC25mRNA剪接异构体的变化
目的：探讨顺铂（ CDDP）对肺癌、宫颈癌细胞和人胚肾细胞CDC25磷酸酶mRNA的选择性剪接的影响。方法：将培养的肺癌A549和H1299细胞，宫颈癌C33A、SiHa、CaSki细胞及人胚肾293FT细胞分为实验组和对照组，实验组细胞用CDDP处理，对照组细胞用DMSO处理，设计CDC25A、CDC25B、CDC25C引物，利用RT-PCR检测CDC25 mRNA 剪接异构体的表达变化。结果：与对照组细胞比较，随着CDDP浓度的增加，肺癌A549和H1299细胞，宫颈癌C33A、SiHa和CaSki细胞以及人胚肾293FT细胞中CDC25B、CDC25C mRNA剪接异构体比例有明显变化，而CDC25A mRNA剪接异构体变化不明显。结论：CDDP引起细胞DNA损伤时，可发生CDC25 mRNA选择性剪接异构体的比例发生变化，这可能与肿瘤药物治疗时的抗性有关。
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顺铂处理后几种hTERT mRNA剪接异构体的变化
目的：利用顺铂处理肺癌、宫颈癌细胞和人胚肾细胞，检测人类端粒酶逆转录酶催化亚单位（hTERT）mRNA的选择性剪接是否发生变化。方法：将培养的肺癌A549和H1299细胞，宫颈癌C33A、SiHa和CaSki细胞及人胚肾293FT细胞分为实验组和对照组，用顺铂处理实验组细胞，DMSO处理对照组细胞；设计hTERT α+β+、α+β-、α-β+、INS3及DEL[e2]引物，提取两组细胞的总RNA，利用RT-PCR检测hTERT mR-NA 剪接异构体表达。结果：与对照组细胞相比，随着顺铂浓度的增加，肺癌A549和H1299细胞，宫颈癌C33A、SiHa和CaSki细胞以及人胚肾293FT细胞中hTERTα+β-和INS3异构体比例升高，而DEL[e2]异构体变化不明显。结论：在顺铂引起的DNA损伤情况下，细胞可利用hTERT mRNA选择性剪接调控机制进行调节，通过改变不同异构体的量和所占比例，从而调节端粒酶功能活性。
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人脐带间充质干细胞致瘤性试验
目的:观察人脐带间充质干细胞对裸鼠的致瘤性.方法:培养扩增人脐带来源的间充质干细胞,制备成细胞生理盐水混悬液注射裸鼠.观察8周裸鼠体内有无肿瘤生长.结果:裸鼠注射细胞后无明显不适,8周观察期内裸鼠体内未见肿瘤生长,病理组织学检测未见异常.结论:人脐带间充质干细胞导致肿瘤发生的可能性低.
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培养的成熟心肌细胞的形态学与电生理特性
随着分子生物学技术不断应用于心脏的生物物理和分子研究中,培养的成熟心肌细胞越发引人关注.本文综述在培养基中所保持的成熟心肌细胞的收缩性、电生理学和形态学特性.同时介绍近年来开发的有助于在培养基中保持心肌细胞特性的新颖技术.
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成熟心肌细胞培养的历史回顾及进展
本文简述成熟心肌细胞培养的历史发展、基本方法及运用分子生物学技术培养心肌细胞的新进展.
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促性腺激素释放激素激动剂对大鼠睾丸间质细胞annexin 5和3β-HSD的表达影响
目的:探讨阿拉瑞林(GnRHa)对大鼠睾丸间质细胞中膜联蛋白V(annexin 5)和3β-羟类固醇脱氢酶(3β-HSD)的表达的影响.方法:建立体外分离、纯化和培养大鼠睾丸间质细胞原代培养技术,采用3β-HSD免疫细胞化学方法对间质细胞进行鉴定,同时用不同终浓度的GnRHa(分别为1×10-5,1×10-6,1×10-7moVL)作用于间质细胞24 h后,通过Western Blot检测问质细胞中annexin 5和3β-HSD的表达变化情况.结果:间质细胞经GnRHa处理后,Western Blot结果显示,与对照组相比,当GnRHa终浓度为1×10-5moL/L时,anenxin 5的表达量显著升高了69.2%(P<0.01),3β-HSD的表达量也升高了25.2%(P<0.05);当GnRHa的终浓度为1×10-6mol/L和1×10-7moL/L时,anenxin 5的表达量分别升高了61.5%(P<0.05)和16.64%(P>0.05),3β-HSD的表达量则无显著性变化,分别升高了7.7%(P>0.05)和2.22%(P>0.05).结论:GnRHa在原代培养的睾丸间质细胞中,对annoxin 5,3B-HSD的表达具有调节作用.
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大葱油对胃癌细胞株体外培养的影响
目的:探讨大葱油对胃癌细胞的影响以及诱导胃癌细胞凋亡的机制. 方法: MTT法评价大葱油对胃癌细胞增殖的影响. 荧光染色观察细胞形态学变化. 流式细胞术和放免法检测细胞凋亡及细胞内游离Ca2+和环磷酸腺苷(cAMP)浓度. 结果:随着大葱油浓度的增加,作用24 h后,细胞增殖抑制率分别达到5.71%,36.33%,44.34%,54.52%和74.15%, IC50≈65 μg/mL. 荧光显微镜下观察结果显示, 实验组出现细胞凋亡形态学变化. 100 μg/mL大葱油作用于胃癌细胞1～12 h, 细胞总凋亡率分别为50.16%, 53.48%, 77.84%, 83.71%和41.34%;早期细胞凋亡率分别为50.15%, 33.25%, 11.69%,4.65%和0.84%. 100 μg/mL大葱油作用于胃癌细胞5 min～12 h,各相应时间点细胞内游离Ca2+含量依次为(71.00±6.08),(77.67±1.53), (79.67±1.53),(83.33±5.03),(76.00±6.06),(75.67±2.52),(72.33±4.24)和(65.00±2.00) nmol/L;细胞内cAMP浓度依次为(5.76±0.36), (18.51±2.06),(20.40±1.65),(16.09±1.46),(12.16±0.78),(9.88±0.53),(9.47±0.78)和(9.82±1.06) pmol/mg(P＜0.05). 结论:大葱油可抑制胃癌细胞增殖,并通过上调细胞内Ca2+和cAMP水平诱导其凋亡.
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外源性胰岛素对于胰岛素一相分泌的影响
目的:探讨外源性胰岛素对离体大鼠胰岛第一时相胰岛素分泌的影响.方法:雄性SD大鼠胰腺采用Ⅴ型胶原酶经胰管灌注消化分离得到胰岛,用100 μU/mL外源性胰岛素分别孵育0,60,120和240 min(n=8)后,给予葡萄糖刺激,分别测定0,3,5,10和30 min胰岛素分泌量.结果:不同时间胰岛素预处理后,各组在葡萄糖刺激时均产生胰岛素第一时相分泌(P＜0.05),但随着胰岛素孵育时间的延长,胰岛素第一时相分泌峰值降低(P＜0.01).结论:100 μU/mL外源性胰岛素损害胰岛素第一时相分泌,且孵育时间越长,抑制程度越明显.
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polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性
目的:建立人食管癌顺铂耐药细胞系及稳定高表达人野生型DNA聚合酶beta(polβ)的食管癌细胞系,分析polβ高表达与食管癌细胞耐药的相关性.方法:顺铂(cDDP)中等浓度、间歇作用法历时9 mo建立耐药细胞系Ec9706/cDDP;同时脂质体转染法将人野生型polβ重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-AC3转染入Ec9706细胞,经G418筛选得到稳定转染细胞系.荧光显微镜观察转染效果,普通倒置显微镜观察细胞形态变化.RT-PCR方法分别检测耐药细胞与转染细胞中polβmRNA的表达水平,MTT法检测各组细胞对cDDP的敏感性.结果:荧光显微镜下转染细胞荧光强,转染效率高,倒置显微镜下耐药细胞与转染前后细胞形态无明显改变.RT-PCR结果表明耐药细胞Ec9706/cDDP中polβ表达较亲本细胞增加,转染细胞的polβ表达较空载体转染细胞、对照细胞也增加.Ec9706/cDDP细胞耐药指数为15.70;转染后细胞对cDDP的敏感性降低,耐药指数为1.78.结论:成功建立了耐药细胞系Ec9706/cDDP与稳定高表达人野生型polβ的Ec9706细胞系,polβ的高表达可引起耐药性的产生,耐药细胞中polβ的表达也增高.polβ的表达与食管癌细胞的耐药性有一定相关性.
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SELDI技术分析体外培养不同肝细胞株差异蛋白的表达
目的: 运用表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS) 技术,检测体外培养的肝癌细胞株(HepG2),转染乙肝病毒的肝癌细胞株(HepG2.2.15)与正常肝细胞株(LO2)蛋白质的差异表达,筛选肝细胞癌的标志蛋白,为进一步研究肝癌发病的蛋白质组学机制奠定基础. 方法: 常规培养上述3种细胞,细胞状态良好时收集细胞,裂解细胞后采用 SELDI-TOF-MS技术用WCX2芯片检测HepG2, HepG2.2.15, LO2细胞内蛋白质组学的差异表达. 结果: WCX2芯片共捕获91个蛋白,在Mr 5000～15 000区段,与正常肝细胞株比较,有7个蛋白质在两种肝癌细胞中出现明显变化,其中2个蛋白在肝癌细胞中表达量增高,5个蛋白在肝癌细胞中表达量降低;另外两种肝癌细胞株也有其各自的标志蛋白,9个蛋白分子在HepG2表达量增高,10个蛋白分子在HepG2.2.15表达量增高. 结论: SELDI蛋白芯片技术检测可作为检测肝癌早期生物标记的方法,它简便,敏感性高,重复性好,本文发现的这些组织特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值,对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义,从而为从蛋白质水平研究肝癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础.
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HCV CE2融合蛋白在家蚕培养细胞、蚕幼虫中的表达及其初步应用
目的:高效表达HCV CE2融合蛋白并进行初步应用. 方法:将2a型HCV全长CE2基因的cDNA重组于质粒pBacPAK8,构建重组转移载体pBacPAK-CE2,与经线性化修饰的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)DNA共转染家蚕培养细胞株,构建重组病毒. 双酶切及PCR鉴定重组病毒基因组中目的片段的表达. 重组病毒感染BmN细胞株及五龄家蚕幼虫后,SDS-PAGE分析细胞培养上清、细胞抽提物及幼虫体液样品中,HCV CE2融合蛋白的特异性条带. 并用间接ELISA法初步检测表达产物的生物活性. 结果:双酶切及PCR鉴定重组病毒基因组含有约1.6 kb的目的片段,重组病毒感染后的BmN细胞培养上清、细胞抽提物及幼虫体液样品中,均可见一Mr约90×103的特异性条带;用间接ELISA检测证明表达产物具有较好的免疫原性. 结论:HCV CE2融合基因在家蚕培养细胞及蚕幼虫中获得了高效表达,并具有生物活性,为进一步进行疫苗的研究及临床诊断试剂的开发奠定基础.
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成年SD大鼠心肌细胞的培养
目的: 建立稳定的成年SD大鼠心肌细胞分离和培养的方法.方法: 主动脉插管逆行灌流分离成年SD大鼠心肌细胞,进行体外培养,并观察其形态的变化.结果: 刚分离的心肌细胞呈长杆状,表面有明显横纹,非同步博动,在含血清的培养环境中,细胞形态很快发生变化,出现去分化表现,在无血清的培养环境中,细胞保持刚分离时的在体形状,2 wk后细胞均明显萎缩.结论: 主动脉插管逆行灌流的方法是较为理想的成年SD大鼠心肌细胞分离与培养方法.
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耐长春新碱肝癌细胞系HCC-7721/VCR的建立
目的: 培养建立耐长春新碱肝癌细胞系HCC-7721/VCR,并对其生物学特性进行研究.方法: 应用人肝癌细胞系HCC-7721,采用长春新碱大剂量间歇诱导法,建立耐药人肝癌细胞系HCC-7721/VCR.观察该细胞的生长规律;用MTT法鉴定该耐药细胞模型对多种抗癌药物的多药耐药性;以流式细胞技术检测该耐药细胞模型细胞周期分布.结果: 经MTT法鉴定,HCC-7721/VCR细胞较HCC-7721细胞的长春新碱半数致死浓度(IC50)增大了4.15倍,并对多种化疗药物产生耐药性,其耐药性提高了2～4倍不等;耐药细胞倍增时间明显延长,S期细胞减少,而G1、G2期细胞增多.结论: HCC-7721/VCR是一个明确的多药耐药细胞模型,具有耐药细胞的基本生物学特性.
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苯异羟肟酸衍生物抑制胃癌细胞活力的体外实验
目的:探讨苯异羟肟酸衍生物对胃癌细胞生长的抑制作用及其机制. 方法:以胃癌细胞株7901为靶细胞,采用体外细胞培养技术评价苯异羟肟酸衍生物E(E药物)对肿瘤细胞活性的影响,通过光学和电子显微镜对E药物作用后细胞形态学进行观察,用免疫组化和RT-PCR方法检测细胞凋亡. 结果:E药物对胃癌细胞活性有抑制作用,作用1～4 d后7901活细胞数分别下降54.55%, 82.05%, 94.85%和94.97%;作用5和6 d时没有细胞存活,各时间点的E药物组与空白对照组比较活细胞数明显下降(1 d:t=4.24, P=0.005; 2 d:t=8.99, P=0.000; 3 d:t=13.36, P=0.000; 4 d:t=17.59, P=0.000; 5 d:t=31.00, P=0.000; 6 d:t=22.52, P=0.000). 光镜及电镜观察:E药物作用后肿瘤细胞变圆,有的出现裂解和皱缩,主要以凋亡为主. E药物作用肿瘤细胞后能抑制Survivin基因表达. 结论:E药物对胃癌7901细胞有抑制增殖作用;其抑制作用与5-氟尿嘧啶(5-FU)和顺铂(DDP)作用相同或近似. 苯异羟肟酸衍生物E主要通过抑制Survivin基因的表达引起肿瘤细胞的凋亡,从而抑制肿瘤细胞的生长.
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原代培养猴骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞的生物学特性
目的: 原代培养猴骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞,比较两种原代培养细胞形态、生长状况的差异性.方法:以骨髓悬液直接贴壁培养的方法获取骨髓基质细胞,以Percoll细胞分离介质(质量浓度1073 g·L-1)分离出骨髓悬液中的骨髓间充质干细胞,用含100 mL·L-1胎牛血清的DMEM培养液分别进行培养,观察细胞的生长状况.〖HTH〗结果:原代培养的骨髓基质细胞增殖迅速,扩增细胞基本都呈形态均一成纤维样细胞,接种1wk 后细胞已长满,3wk后可形成钙化结节.原代培养的骨髓间充质干细胞增殖缓慢,细胞增殖情况和增殖细胞形态不均一;有一些细胞在4wk 的培养时间内未见明显增殖,这些增殖不明显的细胞有的未见明显的伸张,呈圆形,有的伸展充分,成片状,偶见有神经元样的细胞出现;在培养2wk后也可见一些出现明显增殖的细胞,分别形成克隆团状或条带状的细胞群.结论:非诱导条件下原代培养扩增的骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞不同,前者种类均一,可自发向成骨方向发展;后者则表现出间充质干细胞的多向分化潜能.
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对硒鼠皮层神经细胞生长发育及NSE IGFR表达的影响
目的: 研究硒对体外神经细胞生长发育的直接影响及可能的作用机制.方法: 采用体外新生大鼠皮层神经细胞培养法观察微量元素硒对神经细胞生长发育及其相关蛋白NSE、IGFR表达的影响.结果: 中、低浓度的硒(0.0625～0.50 mg·L-1)在培养3 d开始能增加体外培养的神经细胞长突起长度和细胞平均直径(培养3,5,7 d对照组长突起长度分别为49,64,64 μm,加硒各组小值分别为59,78,76 μm,对照组平均直径分别为19,19,21 μm,加硒各组平均值分别为26,25,26 μm,P<0.05),也能促进体外培养的神经细胞表达NSE蛋白(对照组平均秩次为14.1, 实验各组低为21.4, P<0.05),也能促进体外培养的神经细胞IGFR蛋白的表达(对照组平均秩次为16.6, 实验各组低为21.9, P<0.05);高浓度的硒(0.75～1.0 mg·L-1)对培养细胞有明显的细胞毒性作用,可致细胞死亡.结论: 硒可能是通过促进、增强NSE,IGFR蛋白的表达,进而直接作用于体外培养的神经细胞,促进神经细胞的生长发育与分化.
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二贝母胶囊抑瘤作用
目的: 观察不同浓度的二贝母胶囊对S180、EMT6瘤株的体内、体外抑瘤作用. 方法: 体外抑瘤试验采用MTT法;体内试验采用小鼠移植瘤法,瘤株为鼠源性S180肉瘤及EMT6乳腺癌细胞株,治疗采用小鼠ig 12 d并比较合并5 GY 60Co-γ射线治疗的效果. 体外抑瘤试验观察指标为不同浓度的二贝母胶囊对MTT还原产物吸光度值的影响;体内抑瘤试验观察指标为肿瘤移植前后的小鼠体质量、瘤重、脾重,合并60Co-γ射线治疗时亦观察外周血WBC数量. 结果: MTT试验显示对于EMT6细胞株,二贝母胶囊在6.25～100 g*L-1浓度范围内对MTT还原产物吸光度有降低作用(P<0.01或P<0.05),佳抑制浓度为25 g*L-1. ig剂量为2 g*kg-1的二贝母胶囊,给药12 d后,对荷S180及荷EMT6瘤株小鼠的肿瘤生长抑制明显,给药组瘤质量为(0.98±0.49) g及(0.62±0.38) g;而生理盐水组瘤质量为(1.62±0.45) g及(1.22±0.52) g,瘤质量抑制率分别达到39.5%及49.2%,合并放疗对S180瘤株瘤质量抑制率达53.2%,且使外周血WBC及脾质量维持在正常水平. 结论: 二贝母胶囊有抗肿瘤及免疫增强作用.
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人胃癌裸鼠胃原位移植转移模型的建立
目的:建立人胃癌裸鼠原位移植转移模型. 方法:用人胃癌细胞悬殊液接种于裸鼠皮下,形成稳定传代的皮下移植瘤,将皮下移植瘤组织再接种于裸鼠胃浆膜下,称为间接胃原位移植模型,并与直接用细胞悬液接种于裸鼠胃浆膜下、皮下、腹腔、尾静脉的移植瘤模型比较,观察移植肿瘤的生长状况、移植成功率和自发转移的发生率及组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性. 结果:肿瘤组织块保留了人胃腺癌的组织学特片,尾静脉注射与直接原位接种成瘤率均为60%,间接原位接种模型移植成瘤率为80%,皮下与腹腔接种成瘤率均为100%. 间接胃原位移植模型肝脏转移率为60%,直接胃原位移植模型肝脏转移率为33.3%(P<0.05)尾静脉移植瘤模型仅见肝脏转移,实验过程中裸鼠衰竭处死后的肺脏经连续组织切片未见瘤细胞侵袭. 移植瘤细胞具有分泌CEA的功能,细胞动力学检测显示以五倍体细胞为主. 结论: 人胃癌裸鼠皮下-胃原位移植瘤模型的生物学行学与人胃癌自然生长和转移过程相似,为研究人胃癌转移机制提供了理想的模型.
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转染的FasL基因诱导HCC9204细胞凋亡的形态学研究
目的构建含FasL基因的腺病毒载体,转染肝癌9204细胞株, 观察FasL基因对9204细胞株的影响. 方法以腺病毒作载体,把FasL基因克隆入腺病毒载体, 构建成含FasL基因的转基因载体并酶切鉴定,用脂质体包裹法把含FasL基因的腺病毒载体转染HCC9204细胞株,用RT-PCR方法证实转染后有无FasL基因表达,采用电镜观察9204细胞形态学变化. 结果酶切鉴定证实含FasL基因的转基因载体构建成功;RT-PCR显示转染后9204细胞株FasL基因表达水平显著高于未转染细胞株(P<0.01);肝癌细胞株9204转染Fas L基因72 h后,在光镜下可见凋亡细胞体积缩小,生长不良,染色质浓缩,密度增高,胞核中出现颗粒样物质,电镜下可见凋亡小体. 结论成功地构建了FasL基因的转基因载体;转染FasL基因可诱导肝癌9204细胞株出现凋亡.
