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猪髂骨TEB与APBSC复合修复犬牙周骨缺损的实验研究
目的:观察APBSC在原代和不同传代培养下与TEB复合移植修复骨缺损的效果.方法:采用猪的新鲜髂骨块经脱蛋白、脱钙处理后制成TEB,与原代和不同传代培养的APBSC制成APBSC-TEB复合体,移植于犬的下颌骨缺损处,观察不同时间原代APBSC-TEB复合体和不同传代培养的APBSC-TEB复合体对犬颌骨缺损修复的效果.结果:10只犬经过6个月的观察发现:原代APBSC与1～3次传代培养的APBSC在植入骨缺损区的成骨作用没有显著性差别,对骨缺损区的修复作用效果良好.APBSC在TEB的网状支架内生长良好,逐渐衍变为成骨细胞.3个月后,骨缺损区得以完全修复.TEB也逐渐被吸收并由钙化的骨胶原组织取代.而第4～5代培养的APBSC-TEB复合体植入骨缺损区成骨作用较差.结论:经脱蛋白、脱钙处理后的TEB,大大降低了抗原性,是良好的细胞移植载体.APBSC无论是原代,还是经1～3代传代培养,其成骨效果同样良好.
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人肝癌组织伴生成纤维细胞的体外培养及其生物学性状的初步探讨
目的:体外培养人肝癌组织伴生成纤维细胞,观察其生长状态,为进一步研究其功能奠定基础.方法:应用组织块培养法进行人肝癌伴生成纤维细胞的原代培养,细胞铺满培养瓶底后首次传代,通过胰酶消化法和反复贴壁法进行成纤维细胞的纯化;通过倒置显微镜观察细胞形态、免疫组织化学方法检测细胞膜波形蛋白(vimentin)、角蛋白(keratin)表达情况,对细胞进行鉴定.结果:组织块法原代培养约1周可见纤维样细胞从组织块周围游出,5周左右细胞基本长满培养瓶底.首次传代时应用胰酶消化法进行成纤维细胞的初次纯化,第2次转种时先后应用酶消化法和反复贴壁法再次进行细胞纯化,第3代以后基本可获得呈典型克隆性生长、长梭形纤维样细胞,生长周期短.免疫组化染色结果为vimentin染色阳性,keratin染色阴性.结论:在体外成功培养了人肝癌组织伴生成纤维细胞,并对其生物学性状进行了初步探讨,为进一步研究其与肝癌细胞生长、浸润及转移的关系等机制奠定了基础.
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关于结核分枝杆菌定量方法的研究
目的:比较荧光定量PCR法和培养法在结核分枝杆菌定量上是否有差异及探讨应用DNA拷贝浓度替代菌液浓度的可能性.方法:将6种不同浓度的H37Rv标准菌株悬菌液各分为两组:PCR法组和培养法组,并在同一个721型可见光分光光度仪上测定其OD600值.然后,采用荧光定量PCR法,建立结核分枝杆菌DNA拷贝浓度 OD标准曲线,同时对同一标本进行培养并行菌落计数,比较PCR方法和培养法对结核分枝杆菌定量结果是否一致.结果:两种方法对结核分枝杆菌定量无显著性差异(P＞0.05).OD值与DNA拷贝浓度和悬菌液浓度均呈正相关,相关系数分别为1,P＜0.01.其回归方程PCR法为:C(H37Rv)= -0.0189+6.991OD,培养法为:C(H37Rv)= -0.0201+6.757OD,OD范围0.1～0.9.结论:荧光定量PCR法和培养法所得结果基本一致,是一种结核分枝杆菌定量新的方法,可替代菌液浓度法应用于动物实验.
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婴幼儿急性感染性腹泻316例大便镜检与致病菌培养分析
目的:探讨婴幼儿急性感染性腹泻致病菌与大便镜检之间的相互关系.方法:对316例收集病例按镜检区分有无粘液,脓血便组,并比较致病菌培养结果.结果:发现粘液,脓血便与大便致病菌培养阳性,无粘液,脓血便与大便致病菌培养阴性的相互依存关系.结论:大便镜检区分有无粘液,脓血便有助于该病的及早诊治和合理使用抗生素.
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人牙周膜成纤维细胞的体外培养及其生物学性状
采用组织块原代培养法,建立人牙周膜成纤维细胞有限细胞系,利用免疫组化方法鉴定其来源,观察其生长和形态特性.结果显示,所培养的细胞为来自中胚层的非上皮原性、非神经原性、非血管内皮原性的成纤维细胞,细胞倍增时间为45.38h,细胞12h贴壁率为95.3%.染色体核型为正常人23对染色体组型,倒置显微镜下细胞为长梭形,电镜下除胞浆内的各种细胞器,可见较多的胶原纤维束和微丝.细胞有突起,细胞外见较多的胶原纤维和基质.以上研究证实所培养的人牙周膜成纤维细胞来源可靠,可用于进一步的研究工作.
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烧伤血清刺激对大鼠肠上皮细胞结构和粘弹性的影响
目的动态观察烧伤血清对体外肠上皮细胞(IEC)骨架和细胞生物力学(粘弹性)的影响.方法培养大鼠肠上皮细胞株IEC-6,用烧伤血清刺激后,通过细胞骨架免疫组化、细胞ELISA法定量分析以及粘弹性测定技术,动态观察IEC致伤前后的变化.结果IEC在烧伤血清作用早期,骨架蛋白的表达即明显降低,微丝、微管蛋白阳性信号减弱,细胞粘弹性下降.结论细胞骨架的损伤可引起细胞脆性增加、粘弹性下降,导致细胞生物力学特性的改变.这种变化,可能直接参与烧伤后肠上皮细胞损伤的发生.
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人胚胎期表皮干细胞与汗腺发生过程关系的研究
目的观察表皮干细胞与胚胎期汗腺发生过程的关系,为诱导表皮干细胞向汗腺细胞定向分化奠定基础. [ HT5"H 方法分别取13～31周胎龄人胎儿背部全层皮肤,采用常规组织学、免疫组织化学染色法(SP法),动态观察汗腺原基细胞、汗腺胚芽细胞及汗腺细胞中β 1整合素与细胞角蛋白-19(K19) 的表达特征.以细胞角蛋白-8(K8)免疫组化染色阳性为汗腺发生及成熟的鉴定标准. 结果组织学观察显示 ,胎龄16周的皮肤,初级表皮嵴基底层细胞呈灶性聚集,形成小丘状,继而形成圆柱状细胞索向深层切入;至胎龄第24周时,细胞索末端部分形成蟠状,表现为成熟汗腺特征.不仅汗腺原基细胞、汗腺胚芽细胞表达β1整合素与K19,成熟的汗腺细胞亦有表达,并持续存在于汗腺发生全过程.K8始于14～16周,在汗腺胚芽细胞内表达并持续存在. 结论汗腺于胎龄14～16周开始发生,至第24周基本成熟.胚胎期汗腺发生过程中,表皮干细胞是汗腺发生的源泉.
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细胞骨架肌动蛋白表达质粒转染内皮细胞不同方法的比较
目的筛选适合于人脐静脉内皮细胞的转染方法,为进一步转染其他目的基因打下基础. 方法以质粒pEGFP-Actin为外源性基因,分别用脂质体介导的转染法、DEAE-葡聚糖转染法和电穿孔转染法转染人脐静脉血管内皮细胞(ECV-304).比较转染后的细胞死亡率和细胞转染率. 结果 (1) 3种不同方法转染后12 h,细胞死亡率均为4%,至60 h时DEAE-葡聚糖转染的细胞死亡率上升至50%.(2)3种方法均能使ECV-304获得95%的转染率,脂质体介导的转染法荧光强度强于电穿孔转染法. 结论脂质体转染法和电穿孔转染法用于ECV-304,有较好的稳定性和重复性,可作为研究外源性蛋白作用于内皮细胞分子机制的技术手段.
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人胎儿表皮干细胞的体外分离培养及基因转染
目的探讨人胎儿表皮干细胞体外分离培养的方法以及作为体外基因转染靶细胞的可行性.方法利用Ⅳ型胶原快速贴附法分离人胎儿表皮干细胞,以人胎儿成纤维细胞条件培养液配制表皮干细胞培养基,通过角蛋白19(K19)和整合素β1免疫组化染色、细胞周期分析及克隆形成率测定,对培养细胞进行鉴定.采用脂质体介导法,以含血管内皮细胞生长因子165(VEFG165)基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(pcDNA3.1/VEGF165)转染培养细胞;采用病毒载体介导法,以含报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺相关病毒载体(raav/GFP)转染培养细胞.应用免疫组化染色及荧光显微镜观察检测转染效果.结果人胎儿表皮干细胞呈明显克隆性生长,克隆形成率高,G1期细胞比例明显高于普通基底层角质细胞,K19和整合素β1免疫组化染色呈强阳性.pcDNA3.1/VEGF165转染的表皮干细胞VEGF165免疫组化染色阳性,raav/GFP转染的表皮干细胞呈现强荧光.结论利用Ⅳ型胶原快速贴附法及人胎儿成纤维细胞条件培养基,可初步实现人胎儿表皮干细胞的分离培养.以脂质体为介导或以腺相关病毒为载体进行人胎儿表皮干细胞的体外基因转染是可行的.
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间接抗原递呈途径在表皮细胞免疫原性中作用的实验研究
目的探讨间接抗原递呈途径在体外培养的同种异体表皮细胞免疫原性中的作用.方法体外分离、培养人表皮细胞(HEC)、异体人外周血淋巴细胞(PBL)和单个核细胞(PBM,含单核细胞).采用人源毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4Ig)腺病毒表达载体转染HEC,观察CTLA4Ig的表达情况.未转染及已转染的HEC中,均加入异体PBL或PBM共培养,并以单独培养的PBL或PBM为对照.应用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法,测定各培养体系中PBL、PBM增殖情况.结果CTLA4Ig腺病毒表达载体能成功转染HEC并使其表达相应蛋白.未转染的HEC能刺激异体PBL轻度增殖(P＜0.05),以及含单核细胞的异体PBM明显增殖(P＜0.01);经CTLA4Ig基因修饰的HEC刺激PBL、PBM后,两者的增殖反应明显减弱(P＜0.05).结论间接抗原递呈途径在HEC免疫原性中发挥了重要作用,CTLA4Ig能明显抑制该作用.
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胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生研究
目的分离培养胎鼠的表皮干细胞及毛囊乳头层细胞,通过动物模型观察两者复合移植后,上皮形成及毛囊的再生情况.方法采用Ⅳ型胶原分离培养胎鼠表皮干细胞,检测β1整合素及角蛋白15的表达水平,测定其细胞周期及克隆形成率(以角质细胞为对照);分离培养毛囊乳头层细胞,并接种在纤维蛋白胶中,与表皮干细胞膜片复合形成全层皮肤等同物,移植在裸鼠全层皮肤缺损创面作为实验组,同时将胎鼠成纤维细胞替代乳头层细胞作为对照组,8～10周后观察创面及毛囊的组织学变化.结果胎鼠表皮干细胞表达高水平的β1整合素及角蛋白15;细胞周期分析显示,G1期细胞百分率为94.9%,S期为3.5%,提示为慢循环细胞周期;角质细胞的G1期细胞百分率为74.1%,S期为17.5%;表皮干细胞的克隆形成率为15.3%,明显高于对照组的6.7%;裸鼠创面愈合后8～10周,实验组可见新生毛囊形成,对照组未见到此现象.结论能初步实现对胎鼠表皮干细胞的体外分离培养;在毛囊乳头层细胞的诱导下,胎鼠表皮干细胞可参与形成新的毛囊结构.
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小鼠骨髓未成熟树突状细胞体外扩增及鉴定
目的建立体外大量扩增小鼠未成熟树突状细胞(DC)的方法,从形态学、免疫表型和细胞功能试验等方面予以鉴定. 方法制备小鼠骨髓细胞,分别用不同剂量重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)培养,7 d后收集悬浮细胞进行扫描电镜观察和免疫表型鉴定,并行混合淋巴细胞反应,观察其诱导未致敏T淋巴细胞增殖的情况. 结果小剂量rmGM-CSF培养获得的DC(GMlowDC)具有DC的典型特征,细胞表面高表达CD11c,低表达CD40、I-A/I-E, 不表达B7-1,与大剂量rmGM-CSF培养获得的DC(GMhighDC)相比,其体外刺激未致敏T淋巴细胞增殖的能力较弱. 结论本实验中获得的GMlowDC形态上具有DC的典型特征,在细胞表型、细胞功能试验上具有未成熟的特性,说明所建立的培养未成熟DC的方法是可行的;rmGM-CSF的剂量与细胞的成熟程度相关,一般说来,较大剂量的rmGM-CSF诱导生成的细胞以成熟DC为主,小剂量rmGM-CSF诱导生成的细胞以未成熟DC为主.
关键词： 树突细胞 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 细胞 培养的 免疫耐受 -
内毒素诱导内皮细胞粘附分子表达的意义
目的研究内毒素(LPS)刺激下内皮细胞粘附分子(ICAM-1)表达的规律及信号调节机制. 方法 (1)在不同剂量和时间,用LPS刺激培养的人脐静脉血管内皮细胞株ECV-304,从mRNA水平观察ICMA-1的诱导表达规律;(2)以信号通路阻断剂预处理细胞30 min后再行LPS刺激,从mRNA及蛋白水平观察不同信号通路对ICAM-1诱导表达的调节作用. 结果 (1) 100 pg/ml LPS刺激细胞6 h就可以诱导ICAM-1 mRNA的表达,随刺激浓度增加,ICAM-1 mRNA表达增强,100～1 000 ng/ml LPS具有大的诱导效应.6～8 h是mRNA表达高峰,12 h以后表达仍处于较高水平.(2)核因子-κB(NF-κB)抑制剂PSI能显著抑制ICAM-1 mRNA及蛋白表达;细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂PD98059及p38 MAPK抑制剂SB203580,均能在mRNA及蛋白水平部分抑制ICAM-1的表达. 结论 LPS以剂量-时间依赖方式诱导内皮细胞ICAM-1mRNA表达,NF-κB是调节ICAM-1表达的主要信号通路,p38、ERK1/2是调节ICAM-1表达的次要信号通路.
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海洋贝类提取物对血管平滑肌细胞PCNA及PDGF表达的影响
①目的探讨海洋贝类提取物(ES)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响及其作用机制.②方法取培养的5～8代VSMCs,加入50 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),同时给药组分别加入体积分数为0.50的ES及100 mg/L肝素,孵育48 h后,用免疫组织化学LSAB法和计算机图像分析系统,检测VSMCs的增殖细胞核抗原(PCNA)及血小板衍化生长因子(PDGF)的表达.③结果 ES作用下,VSMCs的PCNA,PDGF表达的平均吸光度值、阳性细胞率均显著低于对照组(F=8.93～149.44,q=4.78～21.69,P<0.01).④结论ES能显著抑制VSMCs增殖,该作用可能是通过抑制PDGF的表达而终影响PCNA调控作用的发挥来实现的.
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新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良
①目的建立较理想的新生大鼠海马神经细胞体外原代培养方法.②方法采用低浓度、长时间胰酶消化和机械分离相结合的方法进行单层原代培养.③结果在体外培养条件下神经细胞结构特征明显化,并能形成典型的神经细胞网络.④结论该培养技术是海马神经细胞体外培养的理想方法.
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端粒酶基因hTRT反义寡核苷酸对其酶活性和肿瘤细胞增殖的影响
①目的探讨端粒酶基因hTRT反义寡核苷酸对肿瘤细胞增殖和端粒酶活性的影响.②方法采用MTT法检测反义寡核苷酸对肿瘤细胞HL-60增殖的影响;采用TRAP-PCR法检测反义寡核苷酸处理肿瘤细胞后端粒酶活性的变化;采用Giemsa染色观察反义寡核苷酸处理后肿瘤细胞形态学变化;采用DNA凝胶电泳和三苯胺法检测反义寡核苷酸处理后肿瘤细胞DNA片段化.③结果端粒酶基因hTRT反义寡核苷酸作用48h对肿瘤细胞增殖出现抑制作用.5μmol/L反义寡核苷酸处理24h后,细胞端粒酶活性下降,并且随作用时间的延长,活性不断降低,96h下降至对照组的44.4%.用5μmol/L反义寡核苷酸处理96h的HL-60细胞出现凋亡的形态学特征,处理24,48,72,96h后凋亡指数为0.053,0.127,0.257,0.315.用5μmol/L反义寡核苷酸处理HL-60细胞96h后,电泳出现DNA梯状条带.作用24,48,72,96h细胞DNA片段化率分别为17.98%,29.34%,35.43%,41.24%.④结论端粒酶hTRT基因反义寡核苷酸能抑制肿瘤细胞的增殖和端粒酶活性,并能诱导肿瘤细胞HL-60凋亡.
