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心肌细胞和淋巴细胞β1受体mRNA水平的关系
目的:探讨β1受体mRNA在心肌和淋巴细胞表达的关系.方法:用PT-PCR技术对25例不同心功能状态的心脏病患者(心功能Ⅰ级6例,Ⅱ级14例,Ⅲ级5例),分别检测其心肌和淋巴细胞的β1受体mRNA水平.结果:两种标本检测结果差异无显著意义.结论:淋巴细胞β1受体mRNA水平可反映心肌β1受体mRNA水平.
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以Ⅰ型胶原为基底的表皮细胞培养法
目的:介绍以Ⅰ型胶原为基底的表皮细胞培养法的优点.方法:从鼠尾中提取Ⅰ型胶原蛋白,制备胶原膜作培养皿基底,进行表皮细胞培养,并比较4种不同基底的培养方法.结果:以胶原膜作基底培养的表皮细胞无论是单细胞或组织块都生长好,在第14天均能开始汇合成片,且无毒副作用.结论:该培养法改进了过去培养表皮细胞膜片过薄、韧性欠佳、刮取皮片时造成皮片回缩等缺点,方便了创面移植,且胶原膜本身也能促进创面愈合,可大量地应用于烧伤创面覆盖.
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恶性肿瘤患者自体CIK细胞的实验研究
目的通过比较CIK细胞和LAK细胞的增殖、表型和抗瘤效应,为临床应用CIK细胞过继免疫治疗提供资料.方法取12例恶性肿瘤患者外周血,常规分离成单个核细胞,用不同细胞因子培养诱导出LAK细胞和CIK细胞,观察两种细胞的增殖、表型和抗瘤效应.结果培养后12天,CIK细胞数量达原来的11.5倍,而LAK细胞数量只有原来的5.2倍;比较培养前后CIK细胞的表型,可发现CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+、CD25+在培养后均有明显增高(P<0.05或0.001).CIK细胞杀伤K562细胞和Raji细胞的能力均明显优于LAK细胞(P<0.05或0.001).结论 CIK细胞不仅具有强大的增殖功能,并且对不同的肿瘤细胞系显示出较LAK细胞更强的杀伤活性.因此,它是一种新型的过继免疫治疗方法.
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小鼠神经干细胞的分离培养
目的探讨小鼠神经干细胞的体外分离培养方法.方法采用贴壁培养法,从成体小鼠大脑皮层分离并体外培养成体小鼠大脑皮层细胞,制成细胞悬液后将其置入DMEN/F12 (1∶1)液(包括15%FCS,bFGF20ng/ml,青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)培养,获得细胞克隆.应用免疫组织化学技术检测克隆细胞巢蛋白(Nestin)的表达.结果原代及传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成细胞克隆;克隆细胞表达巢蛋白(Nestin).结论分离的细胞在体外具有很强的增殖能力和自我更新能力,表达Nestin的为中枢神经系统的干细胞.
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甲胎蛋白对Hela细胞增殖的促进作用
目的:采用由脐带血血清中提纯的胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)作用于体外培养的Hela细胞.方法:通过对MTI计数,3H-TdR掺入以及细胞周期时相改变等指标的检测.结果:发现AFP(浓度大于10 mg/L)对Hela细胞增殖有明显的促进作用.结论:AFP具有促Hela细胞增殖的生理功能.
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羊水细胞培养及FISH技术用于产前诊断——附117例分析
目的：探讨羊水细胞培养及荧光原位杂交(FISH)技术在产前诊断中的实验方法及应用价值。方法：对117例孕17～27周有产前诊断指征者，在B超引导下抽取羊水，培养、制备羊水细胞分裂中期染色体，其中1例同时用未培养羊水做间期细胞FISH，另1例用培养后细胞生长不佳的羊水做FISH，两者均采用生物素标记的X、Y、21号染色体探针。结果：羊水细胞培养成功109例。占93.16％；培养失败8例，占6.84％。109例羊水细胞培养分裂中期染色体核型：正常核型46，XX(XY)有95例，占87.16％；异常核型14例，占12.84％。1例间期细胞FISH与羊水培养结果一致，另1例羊水细胞培养仅收到很少分裂中期染色体，改做FISH后可见到较好的荧光信号。结论：FISH技术与羊水细胞培养结合用于产前诊断，提高了诊断的准确性。
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树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞免疫治疗对恶性肿瘤化疗后患者免疫功能的影响
目的 探讨树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗对化疗后肿瘤患者免疫功能的影响.方法 采集化疗后恶性肿瘤患者外周血单个核细胞,经体外诱导产生DC和CIK细胞,每个患者接受DC与CIK细胞治疗至少2个疗程;采用流式细胞术检测21例健康者和48例肿瘤患者化疗前后及DC联合CIK治疗后外周血淋巴细胞CD3+ 、CD4+ 、CD8+、NK细胞及CD4+/CD8+比值.结果 肿瘤患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+ 及NK细胞数量低于健康对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05);化疗后外周血CD3+、CD4+、NK细胞及CD4+/CD8+比值较化疗前降低,差异均有统计学意义(P＜0.05),但化疗前后CD8+均值变化无统计学意义(P＞0.05).DC与CIK细胞回输后外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及NK细胞均高于回输前,CD8+ 低于回输前,但CD3+、CD4+仍低于健康对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 恶性肿瘤患者化疗后免疫力降低,应用DC与CIK细胞免疫治疗,可提高恶性肿瘤患者的免疫功能.
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甘氨脱氧胆酸对人肝癌细胞增殖抑制与诱导凋亡的实验研究
目的 探讨甘氨脱氧胆酸(GDCA)对人肝癌细胞SMMC7721增殖的影响以及细胞凋亡作用.方法 采用96孔细胞培养板体外培养人肝癌细胞株SMMC7721,在24、48、96 h后加入GDCA,并进行四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验,计算肝癌细胞的生长抑制率;采用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的影响.结果 GDCA对肝癌细胞SMMC7721有增殖抑制作用,GDCA作用细胞72 h后,200、400、800 μmo/L GDCA抑制率分别为18.18%、29.94%和88.54%;细胞周期分析显示,G1期细胞比例与对照组相比明显升高,GDCA200、400μmol/L处理组P＜0.05,S期有不同程度的下降,GDCA400 μmol/L处理组P＜0.01.Annexin V-FITC检测结果显示GDCA 200、400 μmol/L处理组48和72 h后细胞凋亡比例比对照组明显增加,差异具有统计学意义.结论 GDCA对人肝癌细胞有增殖抑制作用,并能诱导SMMC7721细胞凋亡.
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流感病毒在MDCK细胞中培养的条件优化
目的 探讨流感病毒在MDCK细胞中的佳培养条件.方法 将流感病毒以吸附法和直接接种法接种在MDCK细胞上,比较接种效果;选择佳病毒接种方案,分别通过调整细胞培养时间、培养温度、病毒生长液胎牛血清浓度、胰酶浓度、病毒接种量和染毒传代次数来优化选择佳培养条件.结果 直接接种法的培养效率较高;流感病毒在MDCK细胞中培养的佳收获时间为96 h;佳培养温度为35.5℃;胎牛血清对病毒的增殖有明显的抑制作用;病毒生长液含有终浓度为2.5μg/mL的胰酶可提高病毒血凝效价;用于流感病毒培养的MDCK细胞的传代次数不宜超过4代.结论 流感病毒在MDCK细胞中佳培养条件是:在病毒生长液环境下直接接种流感病毒,放置35.5℃、5％CO2培养箱培养96 h后收获.其中病毒生长液中无胎牛血清、胰酶终浓度为2.5 μg/mL.
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羊水细胞培养技术的临床应用
目的 探索羊水细胞染色体培养改良方法,提高培养、收获成功率,满足临床诊断需要.方法 对493例羊水标本进行细胞培养和染色体收获,并对实验细节进行优化,建立标准操作程序.结果 羊水培养成功率99.8％(492/493),发现21-三体6例、18-三体2例、其他异常2例.结论 采取严格质量控制;保留换液后的上清,解决因收获失败无法诊断的问题;采取肝素抗凝等,消除母血细胞干扰,可使羊水细胞培养成功.
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儿童血培养病原菌分布及耐药性分析
目的 回顾性分析该院2010年1月至2011年12月儿童血培养病原菌分布和耐药性特点,为该院儿童血流感染抗菌药物使用提供依据.方法 血培养采用BACTEC自动化血培养仪,菌株鉴定使用VITEK-32细菌鉴定系统或API鉴定系统.结果 2 134例血培养标本中共分离210株细菌,其中革兰阳性菌株157株(占74.76%),革兰阴性菌株53株(占25.24%).耐甲氧西林金黄色葡萄球菌占金黄色葡萄球菌56.12%,耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌占凝固酶阴性葡萄球菌79.07%,未检出耐万古霉素、替考拉宁革兰阳性球菌;大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶分别占55.56%、46.15%,未检出耐碳青霉烯革兰阴性细菌.结论 该院儿童血培养主要病原菌为革兰阳性菌,且耐药株比例较高,重视抗菌药物的合理使用刻不容缓.
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DKK1真核表达质粒的构建及表达产物鉴定
目的 构建人DKK1基因的真核表达质粒,表达、纯化、鉴定其表达产物.方法 自宫颈癌组织提取癌细胞,抽提mRNA,RT-PCR获得人DKK1基因片断,构建重组质粒pCMV-HA2/DKK1,EcoRⅠ酶切、测序鉴定重组质粒;借助脂质体将载体瞬时转染入Free-Style 293-F细胞(无血清培养)蛋白印迹法检测DKK1蛋白.结果 RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pCMV-HA2/DKK1重组质粒构建成功;DKK1蛋白分泌表达在Free-Style 293-F细胞培养液中,Western Blot鉴定表达产物为DKK1蛋白.结论 成功构建了人DKK1的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步的DKK1蛋白对肿瘤发生中的生物学活性研究奠定基础.
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长时间高糖培养导致施万细胞PDGF表达下调
目的 观察高糖培养条件下施万细胞血小板源性生长因子(PDGF)表达变化情况.方法 试验分为普通糖水平组及30 mmol/L作用2 d组(HG2)、作用4 d组(HG4)和作用6 d组(HG6).应用逆转录聚合酶链反应检测各组PDGF mRNA表达.结果 与普通糖水平组比较,HG2组PDGF mRNA无变化(P＞0.05),HG4组、HG6组均下降(P＜0.05),且HG4组、HG6组比较无统计学差异(P＞0.05).结论 PDGF与还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶和反应性氧化产物间可能存在负反馈调节机制.
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表没食子儿茶素没食子酸酯抗肿瘤侵袭转移相关机制的探讨
目的 观察茶多酚的有效成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对人肝癌细胞侵袭转移的影响及探讨其相关机制.方法 用免疫细胞化学检测黏蛋白1的表达、人工重组基底膜侵袭小室及明胶酶谱法观察其对人肝癌细胞株HepG2细胞侵袭转移的影响.结果 EGCG能抑制HepG2细胞黏蛋白1的表达,对照组HepG2强阳性细胞数为15个,而EGCG组的强阳性细胞数为1个,差异有统计学意义;EGCG能抑制侵袭基底膜的能力,对照组的侵袭细胞数为(53.2±12.6)个,而EGCG组侵袭细胞数为(8.0±5.1)个,差异有统计学意义.EGCG能抑制MMP-2、MMP-9的分泌.结论 EGCG具有明显的抗癌侵袭和转移的作用,其机制可能与黏蛋白1的降低有关.
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大鼠皮层神经元原代培养方法的改进
目的:建立一种简单、较理想的新生大鼠皮层神经元体外原代培养方法.方法:采用低浓度、短时间胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮层神经元悬液,进行培养.结果:在体外培养条件下神经元结构特征明显,并能形成典型的神经元网络.结论:本方法适合普通实验室进行大鼠皮层神经元体外培养.
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MicroRNA-206可能通过调控Cx43表达调节人乳腺癌细胞的转移能力
目的 通过干预人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231中微小RNA206(microRNA-206,miR-206)的表达,观察连接蛋白43(connexin43,Cx43)的表达以及细胞在增殖、迁移和侵袭能力等方面的变化.方法 使用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测正常乳腺细胞MCF-10A和MCF-7、MDA-MB-231细胞中miR-206的表达水平.通过构建慢病毒载体转染MCF-7及MDA-MB-231细胞,分别升高和降低miR-206的表达水平;采用qRT-PCR和Westem blot法检测转染后Cx43的mRNA及蛋白表达水平的变化.利用CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力.结果 MCFJ和MDA-MB-231中miR-206的表达均明显低于正常细胞株;其中MCF-7细胞中miR-206表达水平较MDA-MB-231中低,Cx43表达水平较MDA-MB-231中高.转染慢病毒包装靶向增强miR-206表达的shRNA载体LV-hsa-miR-206(1569-11)后,MCF-7细胞的miR-206表达明显上升,Cx43的mRNA表达水平及蛋白表达水平均明显下降;细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显降低.转染慢病毒包装靶向抑制miR-206表达的shRNA载体LV-hsa-miR-206-inhibition后,MDA-MB-231细胞的miR-206表达明显下降,Cx43 mRNA表达水平及蛋白表达水平均明显上升;细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显增强;以上差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 干预miR-206的表达可导致Cx43表达水平的变化,并影响人乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231的增殖、迁移和侵袭能力;miR-206可能通过抑制Cx43的表达调节了乳腺癌细胞的转移能力.
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GLP-1受体激动剂艾塞那肽对肿瘤细胞增殖、迁移的影响
目的 目的通过体外细胞实验观察胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)受体激动剂艾塞那肽对乳腺癌、结肠癌、胰腺癌3种肿瘤细胞增殖、迁移的影响.方法 选取乳腺癌MDA-MB-231细胞、结肠癌HCT116细胞、胰腺癌HS766T细胞作为研究对象,每种细胞分为对照组、二甲双胍组、艾塞那肽组.利用CCK-8分别检测3种肿瘤细胞艾塞那肽干预72 h后的增殖能力;利用Transwell小室法观察培养12 h后3种肿瘤细胞的迁移能力.结果 艾塞那肽组与对照组相比,MDA-MB-231细胞、HCT116细胞的增殖受到明显抑制(P＜0.01,P＜0.05),而HS766T细胞增殖无影响(P＞0.05).Transwell体外细胞迁移实验结果显示,艾塞那肽组与对照组相比,MDA-MB-231细胞、HCT116细胞迁移受到明显抑制(P＜0.01,P＜0.05),但HS766T细胞迁移却显著增加(P＜0.01).结论 GLP-1受体激动剂艾塞那肽可以抑制乳腺癌、结肠癌细胞的增殖与迁移,不影响胰腺癌细胞增殖,却促进其迁移,其对不同肿瘤细胞的影响具有差异性.
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川芎嗪通过Akt信号通路影响前列腺癌PC3细胞的增殖和凋亡
目的 研究盐酸川芎嗪对前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响及作用机制.方法 0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL盐酸川芎嗪处理雄激素非依赖性前列腺癌PC3细胞,MTT法检测各组细胞的增殖能力,荧光显微镜观察细胞核形态学改变,Western blot检测Akt以及下游相关蛋白mTOR、p70S6蛋白及蛋白磷酸化的表达,以及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达.结果 盐酸川芎嗪能有效抑制前列腺癌PC3细胞增殖,且显示浓度时间依赖性(P＜0.05).1.5、2.5 mg/mL的盐酸川芎嗪能够降低Akt和p-Akt的表达,进而下调mTOR、p-mTOR、p70S6及p-p70S6的表达(P＜0.05)；同时下调Bcl-2、上调Bax蛋白的表达(P＜0.05).结论 Akt及其下游信号通路介导了盐酸川芎嗪抑制前列腺癌PC3细胞增殖及促凋亡作用.
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肝癌干细胞样细胞的分离及其耐药性受PI3K/Akt通路调节
目的 分离肝癌干细胞样细胞,初步探讨PI3 K/Akt通路调节其对化疗药物阿霉素的敏感性.方法 将人肝癌细胞株PLC、HepG2、Hep3B置于无血清条件培养基中培养,形成细胞球,选用PLC细胞株进行后续实验.采用流式细胞仪、克隆形成实验、SCID小鼠体内成瘤实验鉴定PLC细胞球(肝癌干细胞样细胞)的肿瘤干细胞特性.MTT法、流式细胞仪测定PLC细胞球对化疗药物阿霉素的敏感性.流式细胞仪分析加入PI3 K/Akt通路特异性抑制剂LY294002、阿霉素共同孵育细胞球后,其凋亡率的变化.Western blot法比较PLC细胞球、PLC贴壁细胞中p-Akt1(Ser473)蛋白分子表达量及加入抑制剂LY294002作用于细胞球后,p-Akt1(Ser473)、Akt1蛋白分子表达量的变化.结果 肝癌干细胞标志物CD90在细胞球中的表达较贴壁细胞显著升高(P＜0.01).细胞球的克隆形成数目(123.00±28.48)为贴壁细胞(56.33±7.37)的2.18倍(P＜0.05).同样细胞数接种于SCID小鼠皮下7周后,细胞球的致瘤率明显大于贴壁细胞.以5μg/mL的阿霉素分别处理细胞球和贴壁细胞48 h后,细胞球的增殖率明显高于贴壁细胞[(71.83±12.30)％ vs (45.68±5.95)％,P ＜0.05],凋亡率显著低于贴壁细胞[(11.73 ±3.77)％ vs (41.22±6.73)％,P＜0.01],而以阿霉素5μg/mL和LY294002共同孵育细胞球后,其凋亡率[(35.44±6.65)％]显著增加(P＜0.01).Western blot检测到细胞球的p-Akt1(Ser473)蛋白分子表达量显著高于贴壁细胞(P＜0.01),加入抑制剂LY294002处理细胞球后,p-Akt1(Ser473)蛋白表达量明显降低(P＜0.05),Akt1的表达量无明显变化(P＞0.05).结论 肝癌干细胞样细胞对化疗药物阿霉素具有耐药性,其耐药机制与Akt信号通路第473位点磷酸化Akt1分子有关.
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过氧化氢联合低频超声波诱导卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的研究
目的 探讨过氧化氢联合超声波诱导人卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的效果.方法 体外培养人卵巢癌A2780/DDP细胞,MTT法研究过氧化氢对卵巢癌A2780/DDP细胞生长抑制情况,选择过氧化氢对A2780/DDP细胞作用的合适作用参数；实验分为对照组,0.5 W/cm2、30 s超声组,10 μmol/L过氧化氢组,10 μmol/L过氧化氢联合0.5 W/cm2、30 s超声组；不同因素作用A2780/DDP细胞24h后,Hoechst33258染色观察细胞形态变化；流式细胞仪检测各处理因素作用A2780/DDP细胞的凋亡率；Western blot检测各组细胞caspases-9蛋白表达量的改变.结果 对照组,0.5 W/cm2、30 s超声组和10 μmol/L过氧化氢组无明显凋亡改变,而10tmol/L过氧化氢联合0.5 W/cm2、30 s超声组与对照组之间比较,差异具有显著性(P＜0.05).结论 过氧化氢联合超声波能增强诱导人卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的作用.
