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胰岛分离器制冷系统方案设计
目的 为了提高胰岛组织的分离纯度、数量和活力,需要将胰岛组织放在一个相对低温的环境下分离.本研究意在为现有的细胞处理器加装一个制冷系统.方法 通过水冷系统和风冷系统两种系统的研究,选择风冷系统给COBE2991细胞分离器进行降温,达到胰岛细胞分离的温度要求.结果 采用制冷系统后的细胞分离器能成功分离出胰岛细胞,较之前没有加装制冷装置所得到的的胰岛细胞纯度有所提高,尤其是活力大大提升,有助于移植.结论 通过实验对比验证,利用风冷系统对COBE2991细胞分离器进行降温的方法可行.
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胰岛细胞移植的现状
在发现胰岛素近80年后的今天,尽管因酮症酸中毒而死亡的病例逐渐减少,但是糖尿病肾病、视网膜病和末梢神经系统并发症等,仍然是糖尿病诊治过程中重要而艰巨的课题[1～4].近10年来,糖尿病患病率在世界各国急剧上升,已成为全球性的卫生保健问题.以美国为例,糖尿病病人目前有1400万人,其中1型糖尿病100万人.鉴于如此严峻的现实,几年来美国NIH对糖尿病研究的funding成倍增加,大有赶上癌症基金的趋势.通过胰岛细胞移植来增加患者的胰岛素分泌细胞,可以有效地控制血糖代谢,减少和改善糖尿病的并发症,提高生活质量进而达到根治糖尿病的目的;同时可以避免外源性胰岛素治疗引起的低血糖和胰岛素抵抗.本文就国际上胰岛细胞移植的近期动态及其发展趋势加以概述.一、概况对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者,包括1型糖尿病和部分2型糖尿病病人,从理论上讲胰岛细胞移植是比胰腺移植更加合理的治疗方法,其理由主要为:(1)手术操作简单安全,无处理外分泌的问题,尚无手术引起死亡的报道.使用内窥镜门静脉内直接注入胰岛细胞的方法,患者即日可恢复出院;(2)便于体外修饰移植物.例如,利用基因工程的方法增加胰岛细胞功能和抗免疫能力或降低免疫源性等.遗憾的是当前胰岛细胞移植尚未完全摆脱实验室阶段,与胰腺移植相比,其临床病例仍然较少.据ITR(International Islet Transplant Registry)的统计[5],截至1995年底成人胰岛细胞移植的病例数仅为307例,而同期的胰腺移植为7888例.70年代初,Lacy等成功地证明了通过移植胰岛细胞可以改善糖尿病大鼠的高血糖状态,胰岛细胞移植的方法逐渐引起人们的重视.从70年代到80年代中,人们多次尝试人体胰岛细胞移植,却因胰岛纯度低和排斥反应等原因屡遭失败.进入90年代,自动胰岛分离仪的出现使病例数快速增加,也出现了一些成功的病例.在90年代的267例成人胰岛细胞移植中,8.2%的患者超过一年[5].一些关键技术的突破客观上也加速了胰岛细胞移植的临床化进程.Ricordi等发明的自动胰岛分离装置,使1989年前世界各地散在的病例,在1990年内增加至37例,目前仍有上升的趋势;Lim和Sun首创的胰岛细胞免疫隔离技术,使猪对猴异种移植获得成功,达到完全控制血糖803天而无需免疫抑制;几个月前,加拿大Edmonton的Shapiro实验室改良免疫抑制的用药方案,取得了连续7例胰岛细胞移植病例的成功.近,根据他们的经验JDF(Juvenile Diabetes Foundation)出资2 000万美元用于移植有关的基础和临床研究以推动胰岛细胞移植的临床应用.随着经验的总结和认识的深入,胰岛细胞移植必将成为1型糖尿病和部分2型糖尿病患者的理想疗法.
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人胰岛分离和纯化技术要点以及移植后主要问题
胰岛移植是胰岛素依赖型糖尿病的一种有效的治疗方法[1],分离胰岛的数量和质量决定着胰岛移植的成败.虽然胰岛的分离和纯化是在Ricordi等[2]所建立的胰岛分离方法的基础上发展起来的,并被认为是一种比较成熟的技术,但是目前真能很好掌握这项技术的胰岛移植中心为数不多,以至于埃德蒙顿胰岛移植方案并不能在大多数胰岛移植中心得到完美的重复[3-4].因此,进一步完善胰岛分离和纯化技术是每个胰岛中心需要不断探索的课题.
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不同离心介质对小鼠胰岛分离结果影响研究
胰岛移植治疗糖尿病推广中的首要问题是如何获得多量、高活力和高纯度的胰岛.离心介质的选择是影响胰岛分离结果的重要因素之一[1].该研究旨在比较Ficoll和Dextran两种离心介质对小鼠胰岛分离结果的影响.
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一种改良的小鼠胰岛分离和移植模型
胰岛移植治疗1型糖尿病已成功应用于临床[12],但长期疗效尚不理想[3].小鼠胰岛移植是胰岛移植研究中常用的模型之一,由于技术操作不易掌握,国内鲜有报告.
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免疫抑制药物对成人胰岛移植物毒性作用的体外研究
胰岛移植是治疗1型糖尿病的有效途径之一.临床开展同种异体胰岛移植面临的主要问题包括:胰岛分离、纯化以及手术操作存在一定难度;胰岛寄居部位的非特异性炎症反应;同种异体以及自身免疫反应攻击植入的胰岛;移植后使用的免疫抑制药物引发的胰岛毒性作用[1].本研究以成人胰岛为试验对象,探索免疫抑制药物的毒性作用,旨在为临床制定胰岛移植免疫抑制方案提供依据.
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促胰素对大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响
背景:有研究报道,促进胰岛β细胞增殖分化和再生是2型糖尿病患者一种潜在的治疗方案.目的:观察促胰素对体外培养大鼠胰岛细胞增殖及功能的影响.方法:采用胶原酶消化和组织培养法分离纯化大鼠胰岛细胞,检测其纯度和活性,将胰岛细胞分为空白对照组和实验组,空白对照组加入普通培养基,实验组培养基中加入不同质量浓度(100,200,300,400 mg/L)促胰素,培养1,3,5 d后CCK-8法检测细胞增殖活性;培养5 d后行低糖和高糖刺激胰岛素释放实验.结果与结论:随着促胰素质量浓度的增高,胰岛细胞增殖活性呈剂量依赖性增加(P < 0.05),但无明显时间依赖性.除100,200 mg/L组外,300,400 mg/L两组胰岛素分泌量均显著高于空白对照组(P < 0.05).表明300,400 mg/L促胰素不仅可促进胰岛细胞增殖,而且可显著增强胰岛细胞分泌胰岛素的功能.
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大鼠胰岛分离、肾被膜下移植方法的改进
目的改进大鼠胰岛分离和移植方法.方法在静止消化法和借助黄色吸头移植法的基础上加以改进的方法.结果①胰岛分离所需时间为164.00±11.74min.②纯化后胰岛收获量为320.50±44.25个/只.③胰岛纯度为95.90±0.99(%).④胰岛移植所需时间为27.60±1.71min.⑤同系胰岛移植后1～2d,糖尿病大鼠血糖下降到200mg/dl以下.⑥胰岛计数时使用显微镜的磨砂反光镜面,可清楚区分胰岛、外分泌组织、淋巴结.结论①改进后的分离法和移植方法更加简便,易于掌握.②显微镜的磨砂反光镜面有利于胰岛计数.
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小鼠胰岛分离纯化方法的比较
胰岛移植已成为治疗Ⅰ型糖尿病的一种新型手段,而增加胰岛收获量,提高胰岛纯度一直是胰岛移植中面临的重要问题.足够数量、活性良好的胰岛细胞植入受体后,可逆转糖尿病的高血糖状态,并可防止严重并发症的出现[1,2].为了推进临床应用,在动物身上摸索较好的提取方法十分必要.虽然啮齿类动物胰岛分离方法早已建立,但胰岛的纯度和收获量仍不理想[3].所以本实验拟通过对几种胰岛分离、纯化方法的比较,得出一种简便、高效、实用的胰岛提取方法.
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大鼠胰岛分离的影响因素
建立一种有效的胰岛分离方法,制备出高产量、高纯度、高活力的胰岛是深入研究胰岛移植后免疫排斥机制、筛选有效的免疫抑制药物和其它抗排斥手段的前提和基础.啮齿类动物胰腺胰岛分离方法虽早已建立,但胰岛的纯度和收获量仍不理想.本研究旨在分析大鼠胰岛制备过程中的影响因素,并以此优化胰岛分离和纯化的方法.
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胰岛移植进展
近年来,随着胰岛分离、纯化技术的不断改进以及新型免疫抑制剂的问世和应用,临床同种胰岛移植已取得令人瞩目的进展[1-2],有可能在今后数年内得以广泛开展.本文对这些方面的进展作一综述.
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小鼠胰岛分离改良技术和肾被膜下移植的研究
目的 改进小鼠胰岛分离技术,结合肾被膜下移植,探讨一套完整的小鼠胰岛移植模型方案.方法 结扎小鼠胆总管末段,2 g/L胶原酶V3 ml灌注胰腺,100μm网筛过滤,显微镜下使用手检法获得胰岛,对胰岛的产量、纯度、体外分泌胰岛素的功能和移植效果进行评估,使用传统的Ficoll梯度离心纯化胰岛法所获得的胰岛作为对照.结果 使用改良法平均每只小鼠可分离出110个胰岛,明显多于对照组(P＜0.01),但胰岛的纯度无明显差异,改良法所分离的胰岛体外分泌胰岛素的能力强于对照组(P＜0.01),且逆转高血糖移植胰岛的量少于对照组.结论 使用小鼠胰岛分离改良法能够获得更大产量和胰岛素分泌功能更好的胰岛,其纯度没有受到影响,改良法较Ficoll法省时、省材,结合肾被膜下移植所构建的胰岛移植模型可以广泛用于小鼠胰岛移植的研究.
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小鼠胰岛的分离和移植
目的 改进小鼠胰岛分离和移植方法.方法 利用胆总管穿刺方法灌注胰腺,滤网过滤后人工挑取方法纯化胰岛;采用肾被膜下胰岛移植方法进行移植;用双硫棕(DTZ)染色方法鉴定分离纯化后的胰岛并计数;血糖仪动态检测胰岛移植后糖尿病小鼠血糖值;免疫组织化学染色观察肾脏被膜下胰岛存活情况.结果 分离纯化后获得高纯度胰岛,可被DTZ染成猩红色,呈圆形或椭圆形;经计数每只小鼠可获胰岛(134±12)个;肾脏被膜下胰岛移植后血糖检测显示,移植胰岛后糖尿病小鼠可长期维持正常血糖值,移植胰岛在小鼠体内发挥了正常功能;免疫组织化学染色显示移植入的胰岛生存状态良好.结论 依改进后的技术方法进行胰岛分离和移植,分离获得的胰岛纯度高、活力强,移植物功能正常、存活时间长,是一种简捷稳定的技术方法.
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成人胰岛细胞手工消化与自动消化法的比较研究
目的通过改进成人胰岛细胞消化分离技术,探索成人胰岛细胞分离纯化的有效方法.方法分别采用改进的手工消化法(n=12);及采用自制的胰岛自动分离装置(n=10)进行成人胰岛分离.比较两组间胰岛分离产量,胰岛素刺激释放试验检测胰岛细胞功能.结果自动消化组每克胰腺胰岛产量(6410.55±1871.6)IEQ/g胰腺,明显高于手工消化法(4428.4±1201.7)IEQ/g胰腺(纯化后),(P＜0.01).自动消化组高糖刺激后胰岛素释放量为(4.31±0.24)μU/insulin/IE/h,刺激指数为(2.52±0.39)μU/IE/h,均高于手工消化组(4.04±0.23)μU/insulin/IE/h,(1.99±0.53)μU/IE/h,(P＜0.05).结论采用自动消化法分离成人胰岛产量较高,功能良好.胰腺自动分离装置可望进一步推广应用.
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比伐卢定对大鼠胰岛细胞凋亡的影响
目的 探讨比伐卢定(直接凝血酶抑制剂)在大鼠胰岛分离过程中保护胰岛细胞的作用.方法 将SD大鼠分为比伐卢定处理组和对照组,处理组在胰岛分离全过程中加用比伐卢定进行干预,对照组则不加比伐卢定处理,采用Ficoll非连续密度离心纯化后对两组胰岛细胞的凋亡(采用原位末端核苷酸标记法及流式细胞仪检测)、胰岛产量及活力方面进行比较性研究.结果 比伐卢定5000U处理组的胰岛细胞凋亡计数(5±4)个/HPF、凋亡率(16.5±3.6)％、Fas-1基因表达水平(4.6±1.9)％均显著低于对照组(P＜0.01),胰岛产量(315.3±6.1)IEQ、胰岛素释放水平(179.11±2.18)mIU/L和Bcl-2基因表达水平(10.5±1.2)％均显著高于对照组(P＜0.01),差异有统计学意义.结论 胰岛分离过程中加用比伐卢定对胰岛具有抑制凋亡、提高胰岛产量和保护胰岛活力的作用.
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乌司他丁在大鼠胰岛分离中的抗凋亡作用
目的 探讨乌司他丁在大鼠胰岛分离过程中抑制胰岛细胞凋亡的作用.方法 将20只SD大鼠平均分为两组,处理组在胰岛分离全过程中加用胰蛋白酶抑制剂乌司他丁进行干预,对照组则不加乌司他丁处理,采用Ficoll非连续密度离心纯化后对两组胰岛细胞的凋亡、胰岛产量及活力进行比较.结果 加用乌司他丁处理组的胰岛细胞凋亡率显著低于对照组(P＜0.01),处理组胰岛产量和胰岛素释放水平均显著高于对照组(P＜0.01).结论 胰岛分离过程中加用胰蛋白酶抑制剂对胰岛具有抑制凋亡、提高胰岛产量及保护胰岛活力的作用.
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胰岛移植研究新进展
1型糖尿病是一种胰岛β细胞破坏，胰岛素绝对缺乏，使机体产生一系列内分泌代谢障碍的慢性自身免疫性疾病。在临床上通过注射外源性胰岛素来控制血糖成为了1型糖尿病患者的重要疗法，但与此同时也产生不良反应，尤其是日常低血糖的产生，且糖尿病肾病、视网膜病变、神经病变及心血管疾病等并发症也会发生。胰岛移植近来成为了控制1型糖尿病患者糖代谢有希望的新型方法。人类第1例同种异体胰岛移植发生在1974年［1］，但其在临床上的成功率并不高，直到2000年Edmonton方案的出现，胰岛移植在临床应用中获得了戏剧性突破［2］。然而，由于胰腺供体的有限性、缺乏经验丰富的胰岛分离团队、免疫抑制剂的不良反应及不尽满意的长期疗效，使胰岛移植临床广泛应用依旧受限，为使胰岛移植成为一种常规的、有效的临床治疗糖尿病方法，还需要进一步努力。本文主要阐述胰岛移植治疗糖尿病的近期进展情况。
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一种新的胰岛细胞提取方法
目的:研究猪胰岛细胞分离纯化及探索一种新的胰岛收集方法.方法:成年猪胰岛消化分离采用Calafiore的方法并加以改进.取10头供体猪的胰腺组成第一组作为对照组,对它们采用传统的胰岛分离方法.再取15头供体猪的胰腺组成第二组作为实验组,对它们采用调整后的胰岛分离方法.结果:用新的胰岛收集方法,成功的完整消化试验组15头猪胰腺中的13头.而传统的消化收集方法只能完整消化对照组10头中的4头,前提是假定完整消化的标准是消化后所剩完整的胰腺组织不到原来的5%.用调整后的方法收集胰岛,其产量提高了.而且同一组中每克胰腺组织的胰岛产量也有所增加.结论:调整后的胰岛细胞分离收集方法,能够减少早期分离出的胰岛细胞对胶原酶的接触时间,而同时又不影响其他胰腺组织的消化过程,从而有效地减少胰岛碎片的出现,使分离出的胰岛细胞尽量保持完整的结构.
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大豆胰蛋白酶抑制剂对大鼠胰岛分离纯化的影响
目的 探讨大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)在大鼠胰岛分离纯化中对胰岛产量及功能的影响.方法 按胶原酶中是否加入STI将大鼠分为实验组和对照组,实验组在胶原酶消化液中按2.0 mg/ml加入STI,对照组不添加STI.2组均运用胶原酶原位灌注大鼠胰腺的方法来分离胰岛,使用Ficoll-400用非连续梯度离心法纯化胰岛,将纯化前、后获得的胰岛进行计数,并对纯化后的胰岛进行形态、功能检查.同时进行大鼠同种异体胰岛移植观察其体内功能.结果 实验组和对照组在消化后纯化前所得胰岛数量无明显差别[(624±38.2) IEQ vs (586±37.7) IEQ, P＞0.05]; 在纯化后实验组与对照组所得胰岛数量[(408±28.3) IEQ vs (189±27.1) IEQ,P＜0.05]和纯度[(93±2.4)% vs (75±2.1)%, P＜0.05]差异有统计学意义.实验组与对照组终所得胰岛的体外功能差异无统计学意义(P>0.05),体内功能实验结果差异亦无统计学意义(P>0.05).结论 使用在胶原酶中加入STI的消化液原位灌注大鼠胰腺,可以明显提高大鼠胰岛的终产量和纯度,但对胰岛的功能无明显影响.
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利用 Dispase高效分离胰岛的实验研究
目的：如何获得高质量、数量充足的小鼠胰岛细胞。方法通过比较当前研究中使用的大多数消化酶来分离小鼠胰岛，证实相继使用XI型胶原酶和Dispase比单独使用前者更为有效。结果可获得更多的胰岛细胞（增加至40％）、更短的消化时间（下降25％） ，并且使用较少的胶原酶（减少40％）。结论这一新改良的方案在小鼠胰岛分离的质量、数量方面都有明显改善。
